玉米肽對慢性酒精中毒小鼠認知損傷的改善作用

林 巍，曲國強，劉曉蘭，王曉杰，景 言

(齊齊哈爾大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾161006)

酒精濫用和酒精依賴已成為當(dāng)今影響人類健康的重要因素之一，世界衛(wèi)生組織報道全球每年約有300萬人死于酒精相關(guān)疾病，占所有死亡人數(shù)的5.3%[1-4]。長期飲酒可導(dǎo)致200多種疾病，酒精暴露能夠破壞大腦的表觀遺傳和轉(zhuǎn)錄過程，損害神經(jīng)再生，誘發(fā)神經(jīng)炎癥[5-6]，因此長期飲酒可引起許多神經(jīng)系統(tǒng)不可逆的反應(yīng)，進而引起以神經(jīng)精神癥狀為主的疾病。學(xué)習(xí)、記憶功能損害是慢性酒精性腦損傷神經(jīng)行為學(xué)變化的早期重要癥狀之一，目前已有許多學(xué)者從不同的角度對酒精中毒導(dǎo)致學(xué)習(xí)能力減退、認知障礙進行了研究[7-9]。中樞神經(jīng)遞質(zhì)在大腦思維、學(xué)習(xí)、記憶等高級功能中發(fā)揮著重要作用，腦內(nèi)短時間的高酒精濃度能干擾神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)受體的活動，引起細胞和突觸功能障礙，影響神經(jīng)元對信息的反應(yīng)和傳遞，最終影響大腦的學(xué)習(xí)記憶行為[10-11]。目前對于酒精性腦損傷的治療，臨床上主要采取戒酒、營養(yǎng)支持和對癥治療等綜合療法，但這只能減輕酒精性腦病臨床癥狀，阻止酒精性腦病的進一步發(fā)展，因而預(yù)防酒精中毒對腦組織的損傷至關(guān)重要。

玉米蛋白多肽鏈中存在多個功能區(qū)，經(jīng)過蛋白酶控制性酶解后得到的玉米肽具有顯著的生物學(xué)活性。近年來眾多學(xué)者分別制備出具有體外醒酒活性的玉米肽[12-14]。動物實驗表明玉米肽具有良好的解酒效果及護肝作用[15-17]。酒醉除了損害肝臟，還可引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒性，影響大腦的學(xué)習(xí)記憶行為，本實驗室研制開發(fā)的玉米肽具有解醉的功效，并且能夠減輕酒精對神經(jīng)系統(tǒng)刺激，緩解醉酒后頭痛[18-19]。但是玉米肽如何降低酒精對腦組織的損傷作用，是否可以改善酒后學(xué)習(xí)、記憶功能尚未清楚。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，進一步證實了玉米肽對酒精引起的認知損傷的改善作用，探討了玉米肽對慢性酒精中毒小鼠中樞神經(jīng)遞質(zhì)合成和/或代謝的調(diào)節(jié)作用，以期找到玉米肽改善酒精性認知損傷的客觀依據(jù)，為預(yù)防腦損傷的天然保健食品的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

清潔級ICR小鼠，體重(18±2)g，實驗動物生產(chǎn)許可證號為SCXK(吉)2015-0005，長春市億斯實驗動物技術(shù)有限責(zé)任公司；玉米肽粉(蛋白質(zhì)含量45.3%，其余為淀粉，肽分子質(zhì)量<1 kDa)，依據(jù)發(fā)明專利ZL 201910249682.2實驗室自制；基礎(chǔ)鼠糧，長春市億斯實驗動物技術(shù)有限責(zé)任公司；小鼠多巴胺(DA)、5-羥色胺(5-HT)、乙酰膽堿酯酶(AChE)、一氧化氮合成酶(NOS)、γ-氨基丁酸(GABA)試劑盒，上海江萊生物科技有限公司。

EnSpire全波長多功能酶標(biāo)儀，美國珀金埃爾默公司；CF15RXII型高速低溫離心機，日本日立公司；WMT-100水迷宮視頻分析系統(tǒng)、PAT-8避暗實驗視頻分析系統(tǒng)，成都泰盟科技有公司；MT70擠壓膨化機，濟南美騰機械設(shè)備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物飼養(yǎng)與分組

加肽鼠糧的制作：以1 g/kg中劑量玉米肽為例說明添加玉米肽鼠糧的制作。首先，用粉碎機將基礎(chǔ)鼠糧粉碎，之后將玉米肽與粉碎后的基礎(chǔ)鼠糧以質(zhì)量比1∶1 000用攪拌機混合均勻，最后將混合后的飼料利用擠壓膨化機制作成具有一定硬度的圓柱體飼料。高劑量玉米肽和低劑量玉米肽的制作，除玉米肽與粉碎后的基礎(chǔ)鼠糧質(zhì)量比分別為2∶1 000和0.5∶1 000外，其余過程均與中劑量玉米肽的制作過程一致。

ICR小鼠80只(雌雄各半)，隨機分為5組，每組16只，分別為正常對照組、慢性酒精性腦損傷模型組(酒精模型組)、玉米肽高劑量組(2 g/kg)、玉米肽中劑量組(1 g/kg)、玉米肽低劑量組(0.5 g/kg)。慢性酒精性腦損傷模型組的建立參考 Turchan等[20]的方法，將小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，正常組飲用蒸餾水，飼喂基礎(chǔ)鼠糧；慢性酒精性腦損傷模型組依次飲用體積分數(shù)為6%、12%、15%、20%的酒精溶液，飼喂基礎(chǔ)鼠糧，其中體積分數(shù)為6%、12%、15%的酒精溶液分別飲用1周，體積分數(shù)為20%的酒精溶液一直飲用到實驗結(jié)束。玉米肽實驗組按分組分別飼喂加肽鼠糧，飲用酒精溶液同酒精模型組；各組小鼠皆自由攝食，實驗周期為5個月。實驗結(jié)束后，先進行動物行為學(xué)實驗(Morris水迷宮實驗和避暗實驗)，然后頸椎脫臼處死，取腦組織，一半用于病理組織學(xué)觀察，一半用于腦組織中各項指標(biāo)的測定。

1.2.2 Morris水迷宮實驗

參照許亞軍等[21]的方法，并作修改。

學(xué)習(xí)獲得實驗：訓(xùn)練部分為5 d，第1天讓小鼠自由游泳2 min，適應(yīng)實驗環(huán)境。從第2天起，每天訓(xùn)練時分別隨機從4個象限各選1個入水點，將小鼠面向池壁放入水中，令其在水中尋找180 s，由視頻采集系統(tǒng)記錄小鼠的運動軌跡和其找到平臺位置的時間(逃避潛伏期)。若180 s內(nèi)小鼠未找到平臺的位置則由測試者將小鼠引至平臺，將其放在平臺上再滯留30 s，未找到平臺的小鼠逃避潛伏期記為180 s。最后記錄在第二象限入水時的逃避潛伏期，以此結(jié)果判斷學(xué)習(xí)獲得能力和短時記憶能力。

記憶保持實驗：第6天進行記憶保持實驗，先將小鼠在平臺上放置30 s，然后將平臺撤掉。從平臺對側(cè)象限將小鼠面朝桶壁投入池中。視頻采集系統(tǒng)記錄每只小鼠空間運動軌跡和逃避潛伏期等，以此結(jié)果判斷長期記憶保持能力。

1.2.3 避暗實驗

使用PAT-8避暗實驗視頻分析系統(tǒng)進行避暗實驗。小鼠避暗箱分為前部明室和后部暗室兩部分，兩室間有直徑3 cm的空洞相通。底部為銅柵，前半部明室以高強度燈光刺激，后半部暗室通以40 V電壓，實驗時將小鼠背對入口放入明室，記錄從小鼠放入明室至鉆進暗室觸電的時間，即逃避潛伏期，同時記錄小鼠在5 min內(nèi)進入暗室的次數(shù)，即錯誤反應(yīng)次數(shù)。

1.2.4 病理組織學(xué)觀察

神經(jīng)行為學(xué)實驗結(jié)束后，取小鼠腦組織，剝離海馬組織，制成 HE染色切片并進行病理學(xué)觀察。

1.2.5 腦組織中神經(jīng)遞質(zhì)的測定

小鼠脫臼處死后迅速取腦組織，用4℃生理鹽水漂洗，拭干，稱重，然后加入9倍0.9%冰生理鹽水，磨漿，再用高速低溫離心機以2 000 r/min離心10 min，取上清液置4℃冰箱保存，按試劑盒說明書測定多巴胺(DA)、5-羥色胺(5-HT)、γ-氨基丁酸(GABA)含量以及乙酰膽堿酯酶(AChE)、一氧化氮合成酶(NOS)活性。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用SPSS 19.0軟件，對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，差異顯著者再進行LSD檢驗。各組數(shù)據(jù)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 Morris水迷宮實驗

玉米肽對小鼠學(xué)習(xí)獲得實驗結(jié)果的影響見圖1。

圖1 玉米肽對小鼠學(xué)習(xí)獲得實驗結(jié)果的影響

由圖1可知：各組小鼠尋找平臺所需逃避潛伏期均有隨著訓(xùn)練進程而下降的趨勢，與正常對照組相比，酒精模型組小鼠的逃避潛伏期均顯著延長(P<0.05)；訓(xùn)練第4天時，與酒精模型組相比，玉米肽中、高劑量組小鼠逃避潛伏期顯著縮短，與正常對照組無顯著差異(P>0.05)。這表明長期的酒精處理導(dǎo)致小鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降，影響小鼠學(xué)習(xí)獲得能力和短時記憶能力，給予玉米肽對由酒精導(dǎo)致的學(xué)習(xí)獲得能力和短時記憶能力下降具有一定緩解作用。

由Morris水迷宮空間探索軌跡(圖2)直觀可得，正常對照組小鼠的運動軌跡大多集中在有效區(qū)域象限，與正常對照組相比，酒精模型組小鼠的運動軌跡分布隨機。

玉米肽對小鼠記憶保持實驗結(jié)果的影響見圖3。由圖3可知：與空白對照組相比，酒精模型組小鼠逃避潛伏期顯著延長，運動總距離及有效區(qū)域運動時間顯著縮短，有效區(qū)域進入次數(shù)顯著減少(P<0.05)；與酒精模型組相比，玉米肽中、高劑量組小鼠逃避潛伏期均顯著縮短，有效區(qū)域進入次數(shù)顯著增加(P<0.05)，玉米肽中劑量組有效區(qū)域運動時間顯著延長(P<0.05)，但玉米肽低、中劑量組運動總距離沒有顯著改變(P>0.05)。到達隱藏平臺的路徑和時間與動物的完整記憶有關(guān)，表明酒精對小鼠的記憶保持能力有明顯損傷作用，而玉米肽對由酒精造成的小鼠記憶保持能力的損傷有一定的改善作用。

圖2 玉米肽對小鼠記憶保持實驗空間探索軌跡的影響

2.2 避暗實驗

玉米肽對小鼠避暗實驗結(jié)果的影響見表1。

表1 玉米肽對小鼠避暗實驗結(jié)果的影響

由表1可見：與正常對照組相比，酒精模型組小鼠進入暗箱的錯誤次數(shù)和逃避潛伏期均有顯著變化(P<0.05)，表明慢性酒精性腦損傷模型對小鼠被動回避記憶能力造成損害；與酒精模型組相比，玉米肽各劑量組均能降低由酒精引起的進入暗箱的錯誤次數(shù)，延長逃避潛伏期(P<0.05)，這說明玉米肽對由酒精引起的被動回避記憶能力損害有所緩解。

2.3 玉米肽對慢性酒精中毒小鼠海馬組織病理學(xué)的影響(見圖4)

由圖4可知：正常對照組小鼠海馬區(qū)椎體細胞排列規(guī)則，層次清楚，細胞結(jié)構(gòu)完整，細胞核清晰；與正常對照組相比，酒精模型組小鼠海馬組織病理組織圖呈現(xiàn)神經(jīng)細胞固縮或結(jié)構(gòu)模糊、神經(jīng)膠質(zhì)細胞數(shù)量增多的形態(tài)變化，表明長期較高濃度的酒精作用可導(dǎo)致海馬組織細胞病變，進而引起酒精性認知損傷，這與李一欣等[22]的研究結(jié)果一致。與酒精模型組相比，玉米肽低劑量組小鼠海馬組織損傷未見明顯改善，玉米肽中、高劑量組海馬組織損傷情況有不同程度的減輕，但海馬區(qū)內(nèi)仍有部分神經(jīng)細胞結(jié)構(gòu)模糊，神經(jīng)膠質(zhì)細胞數(shù)量略增多。病理組織學(xué)結(jié)果表明玉米肽可減輕酒精對小鼠海馬組織的損傷作用，從而改善酒后認知損傷。

圖4 小鼠海馬組織病理學(xué)觀察結(jié)果(400×)

2.4 玉米肽對小鼠酒后腦組織中神經(jīng)遞質(zhì)及受體的影響

2.4.1 玉米肽對小鼠腦組織中AChE活性的影響(見圖5)

圖5 玉米肽對小鼠腦組織中AChE活性的影響

由圖5可知，與正常對照組相比，酒精模型組小鼠腦組織中AChE活性顯著升高(P<0.05)，表明酒精可引起腦中AChE活性的改變。AChE能特異性水解乙酰膽堿，當(dāng)AChE活性升高時，可加快對乙酰膽堿的水解，使其含量下降，從而導(dǎo)致認知功能下降。與酒精模型組相比，玉米肽低、中、高劑量組小鼠腦組織中AChE活性未見顯著改變(P>0.05)。玉米肽對酒后腦組織中AChE活性的增加沒有改善作用，表明玉米肽對酒后腦組織損傷的保護作用不是通過調(diào)節(jié)AChE活性以及乙酰膽堿含量實現(xiàn)的。

2.4.2 玉米肽對小鼠腦組織中5-HT含量的影響(見圖6)

由圖6可知，與正常對照組相比，酒精模型組小鼠腦組織中5-HT含量顯著升高(P<0.05)。攝入酒精后，乙醇脫氫酶能催化酒精生成乙醛，乙醛可抑制醛脫氫酶而影響 5-HT在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的代謝，減弱其降解，導(dǎo)致5-HT含量升高，這也是酒精中毒后促進睡眠的原因[23]。與酒精模型組相比，玉米肽低劑量組中5-HT含量沒有顯著變化(P>0.05)，但玉米肽中、高劑量組中5-HT含量顯著降低(P<0.05)。這表明玉米肽可通過下調(diào)酒后腦組織中5-HT含量來減輕酒精性腦損傷，從而改善認知損傷。

圖6 玉米肽對小鼠腦組織中5-HT含量的影響

2.4.3 玉米肽對小鼠腦組織中DA含量的影響(見圖7)

圖7 玉米肽對小鼠腦組織中DA含量的影響

由圖7可見，與正常對照組相比，酒精模型組小鼠腦組織中DA含量顯著升高(P<0.05)，表明酒精可使多巴胺能神經(jīng)元釋放的DA增多，這與劉坤等[24]的結(jié)論一致。酒精是親神經(jīng)性興奮性毒物，可通過DA轉(zhuǎn)運蛋白進入神經(jīng)元，直接激動中腦-邊緣DA系統(tǒng)和中腦-額葉DA系統(tǒng)，使得腦內(nèi)DA的區(qū)域神經(jīng)元興奮性增強，并引起多巴胺能神經(jīng)元釋放DA增多，同時還可抑制DA的分解[25]。與酒精模型組相比，玉米肽中、高劑量組小鼠腦組織中DA含量顯著降低(P<0.05)。這表明玉米肽可調(diào)節(jié)腦組織中DA含量，減輕酒精對神經(jīng)遞質(zhì)DA的干擾，改善神經(jīng)元對信息的反應(yīng)和傳遞異常，恢復(fù)神經(jīng)細胞的正常功能。

2.4.4 玉米肽對小鼠腦組織中GABA含量的影響(見圖8)

圖8 玉米肽對小鼠腦組織中GABA含量的影響

由圖8可知：與正常對照組相比，酒精模型組小鼠腦組織中GABA含量顯著升高(P<0.05)，表明酒精可顯著增加腦組織中抑制性氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)GABA的水平；與酒精模型組相比，玉米肽低、中、高劑量組小鼠腦組織中GABA含量沒有顯著變化(P>0.05)。這表明玉米肽對酒精引起的GABA含量升高沒有調(diào)節(jié)作用，玉米肽對酒后腦組織損傷的改善不是通過調(diào)節(jié)GABA水平發(fā)揮作用的。

2.4.5 玉米肽對小鼠腦組織中NOS活性的影響(見圖9)

圖9 玉米肽對小鼠腦組織中NOS活性的影響

由圖9可知，與正常對照組相比，酒精模型組小鼠腦組織中NOS活性顯著降低(P<0.05)。NOS是NO合成的關(guān)鍵酶，在神經(jīng)系統(tǒng)中，NO參與了學(xué)習(xí)和記憶等神經(jīng)生理活動，還對腦部血流具有調(diào)節(jié)作用，并參與神經(jīng)系統(tǒng)的免疫防御，酒精降低了腦組織中NOS活性，間接降低了NO的含量，因此影響了小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。與酒精模型組相比，玉米肽中、高劑量組小鼠腦組織中NOS活性顯著增加(P<0.05)，玉米肽低劑量組未見顯著改變(P>0.05)。這表明玉米肽可通過提高腦組織中NOS活性，恢復(fù)正常生理水平的NO含量，從而改善由酒精引起的學(xué)習(xí)記憶能力下降。

3 結(jié) 論

玉米肽對慢性酒精中毒小鼠認知損傷具有明顯的改善作用，可減輕酒精引起的海馬組織細胞病變，提高酒后小鼠學(xué)習(xí)記憶能力；還可調(diào)節(jié)酒后腦組織中5-HT、DA含量以及NOS活性，但對酒精導(dǎo)致的AChE活性及GABA含量升高沒有下調(diào)作用。由此可知，玉米肽對酒精性腦損傷具有預(yù)防作用，可改善酒后腦組織中部分相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)紊亂導(dǎo)致的細胞和突觸功能障礙，這可能是玉米肽改善慢性酒精中毒小鼠認知損傷的重要機制之一。提示飲酒前食用玉米肽，可改善酒精性認知損傷，減輕酒精對大腦的毒性作用。但是玉米肽預(yù)防酒精性腦損傷的具體分子機理尚不清楚，還有待進一步研究。