葡萄耐鋁毒基因STOP1的克隆與表達分析

張永福，徐仕琴，陳 姣，楊硯斌，任 禛

(昆明學院農(nóng)學與生命科學學院，昆明 650214)

【研究意義】在pH值于5.0的酸性土壤中，大量的活性A13+被釋放出來，A13+所產(chǎn)生的鋁毒嚴重抑制植物生長，使其產(chǎn)量大幅度降低[1-2]。pH小于5.0的酸性土壤，廣泛存在于世界熱帶和亞熱帶地區(qū)[3]，鋁毒已成為抑制這些地區(qū)植物生長的主要因素之一[4-5]。隨著現(xiàn)代工業(yè)的發(fā)展，大量生理酸性化肥的施用和酸雨的高頻率發(fā)生，使中國南方地區(qū)原本呈酸性的土壤酸度進一步加劇[6]。葡萄是一種世界廣泛栽培的大宗果樹，由于其口感極佳和營養(yǎng)豐富而深受廣大消費者的喜愛，由于葡萄種植能夠取得較高的經(jīng)濟效益，因此葡萄栽培在我國南方酸性土壤地區(qū)增長迅速[7]，且隨著栽培年限的增加，葡萄根際對土壤養(yǎng)分的富集作用越來越弱，園土pH呈明顯的下降趨勢[8]。然而，葡萄在鋁毒脅迫下，根系活力下降，氧自由基產(chǎn)生速率和丙二醛含量上升，過氧化物酶和超氧化物歧化酶活性亦上升，植株生長受到抑制[9]。為解決此問題，在提高土壤pH的同時，挖掘葡萄自身的耐鋁毒基因，獲得耐鋁毒能力強的種質(zhì)資源是一條行之有效的途徑。為此，課題組從26份葡萄種質(zhì)中篩選出了耐鋁毒能力較弱的山葡萄(Vitisamurensis)和耐鋁毒能力較強的小葉葡萄(V.sinocinerea)[10]作為STOP1基因克隆與表達分析的試驗材料?！厩叭搜芯窟M展】STOP1(sensitive to proton rhizotoxicity 1)是一個含有4個鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域的C2H2型鋅指轉(zhuǎn)錄因子，在擬南芥(Arabidopsisthaliana)中，該轉(zhuǎn)錄因子能調(diào)控下游耐鋁關(guān)鍵基因表達，如檸檬酸轉(zhuǎn)運蛋白AtMATE1(multidrug and toxic compound extrusion)基因[11]、ABC通道蛋白AtALS3(aluminum sensitive 3)基因[12]及鋁激活蘋果酸轉(zhuǎn)運子AtALMT1(aluminum-activated malate transporter 1)基因表達[13]。當這些基因表達受到抑制時，與H+毒害耐受機制相關(guān)基因的表達、檸檬酸及蘋果酸的分泌也會被抑制[14]。擬南芥的STOP1突變體對Al3+的毒害極為敏感，在鋁脅迫中根系生長受阻嚴重[13]。隨后，在煙草(Nicotianatabacum)[15]、水稻(Oryzasativa)[16]、大豆(Glycinemax)[17]、柱花草(Stylosanthesguianensis)[18]和桉樹(Eucalyptusrobusta)[19]中也相繼克隆了與AtSTOP1同源的基因?？梢姡谡{(diào)控植物對鋁毒的耐受中，STOP1基因具有重要作用?！颈狙芯壳腥朦c】山葡萄原產(chǎn)于中國東北，其果實可釀酒和鮮食，由于其生長旺盛和耐寒性強，目前在葡萄栽培中主要用作砧木。小葉葡萄分布于我國云南、浙江、福建等南方地區(qū)，目前還處于野生狀態(tài)，其果實可用于釀制葡萄酒，其植株可用作葡萄耐鋁毒砧木。小葉葡萄具有較強的耐鋁性，而山葡萄的耐鋁性相對較弱，二者是研究葡萄在酸性土壤中耐鋁毒脅迫機制的重要試材。目前，盡管葡萄種質(zhì)資源的耐鋁性評價已有報道[10]，但并不清楚相關(guān)的分子機制?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以山葡萄和小葉葡萄為研究材材，分別克隆出鋅指轉(zhuǎn)錄因子VaSTOP1和VsSTOP1，并利用生物信息學對這兩個鋅指轉(zhuǎn)錄因子進行基因的表達分析，為以后進一步揭示葡萄耐鋁性相關(guān)基因的調(diào)控機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料及鋁脅迫處理

研究材料山葡萄(Vitisamurensis)為砧木品種‘通化-3’的1年生扦插苗，收集于云南省彌勒市；小葉葡萄(V.sinocinerea)為野生種的1a生壓條苗，收集于云南省羅平縣。收集到的試驗材料保存于昆明學院果樹資源圃大棚，取成熟健壯的葉片進行STOP1基因克隆。葉片摘下后立即投入液氮中進行速凍，然后用超低溫冰箱在-80 ℃下保存。

用PVC管進行鋁脅迫處理，管分兩層，相隔80 cm，分別用直徑3 cm的PVC管連接兩層管的兩端，然后安裝抽水泵在其中一端，開啟水泵后營養(yǎng)液就能在兩層管中循環(huán)流動。栽培用的管長200 cm、18 cm內(nèi)徑，栽培孔間隔40 cm，直徑10 cm。把1年生的試驗材料根系從栽培孔中放入，再用陶粒固定，裝入2/3管的1/2 Hoagland’s營養(yǎng)液(pH=4.5)。15 d后，加入5 mmol/L Al2(SO4)3·18H2O(pH = 4.5)于1/2 Hoagland’s營養(yǎng)液(pH=4.5)中進行鋁毒脅迫處理。然后分別在鋁毒脅迫的第0、7、14、21、28天進行采樣，采取成熟健壯的葉片，并立即置于液氮中冷凍，然后用超低溫冰箱在-80 ℃下保存，用于STOP1基因的表達分析和測定生理指標。

1.2 提取RNA及合成cDNA

稱0.1 g樣品，放入有1 mL TPIzol提取液的研缽中磨成勻漿，再加氯仿0.2 mL，然后在室溫中放置5 min，16 099 r/min離心10 min(4 ℃)。取上清，加入異丙醇0.5 mL，搖勻后室溫放置10 min，16 099 r/min離心10 min(4 ℃)。棄上清，75%乙醇漂洗沉淀，把乙醇倒去，風干沉淀后再加入100 μL DEPC水溶解RNA。參照說明書用PrimeScript 1stStrand cDNA Synthesis Kit試劑盒(TaKaRa公司生產(chǎn))進行逆轉(zhuǎn)錄，合成cDNA第1鏈。

1.3 克隆STOP1全長cDNA

根據(jù)模式植物擬南芥的AtSTOP1蛋白序列進行Blastp搜索，得到葡萄同源基因的cDNA及氨基酸序列，然后根據(jù)cDNA序列設(shè)計引物(表1)，設(shè)計好的引物送生物技術(shù)公司進行合成。基因擴增用高保真酶PrimeSRAHS DNA Polymerase完成。擴增程序為預變性2 min(98 ℃)；變性10 s(98 ℃)，復性10 s(58 ℃)，延伸25 s(72 ℃)，循環(huán)35次；延伸2 min(72 ℃)后擴增結(jié)束。用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測所得擴增產(chǎn)物，用從Axygen公司購買的回收試劑盒進行切膠回收目的條帶，然后跟pMD19-T Vector連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，挑出陽性克隆進行測序(北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司)。

表1 引物序列

1.4 生物信息學分析

利用NCBI在線分析軟件ORFfinder把STOP1基因翻譯成蛋白質(zhì)序列，利用ProtParam tool(http:// web.expasy.org/protparam/)預測理論等電位和蛋白質(zhì)分子量。蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)預測使用GOR4 (https://npsa-prabi. ibcp.fr/cgi -bin/npsa_automat.pl?page=npsa_ gor4. html)；蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)預測使用SWISS-MODEL (https://www. swissmodel.expasy.org/interactive)。使用NCBI的Blastn對比核酸序列、Blastp對比氨基酸序列；使用DNAMAN 8.0比對氨基酸多序列和MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.5 基因表達分析

對葡萄葉片鋁脅迫的不同時期的STOP1基因表達量進行熒光定量分析，方法參照TSE202[2×T5 Fast qPCR Mix(SYBR Green I)，擎科]說明書，內(nèi)參基因為GAPDH和UBQ，引物序列見表1。反應(yīng)體系：2×T5 Fast qPCR Mix(SYBR Green I)10 μL、各0.8 μL上下游引物、1.0 μL cDNA模板、加Nuclease-free Water到20 μL。反應(yīng)條件：預變性1 min(95 ℃)；10 s(95 ℃)，5 s(60 ℃)，10 s(72 ℃)，循環(huán)40次；熔解階段：15 s(95 ℃)，1 min(60 ℃)，15 s(95 ℃)，20 s(0.3 ℃)。反應(yīng)結(jié)束后進行溶解曲線以及熒光值變化曲線分析。

1.6 測定生理指標

丙二醛含量利用雙組分光光度法測定，通過硫酸鈦—濃氨水顯色法測定H2O2含量，通過鹽酸羥胺法測定氧自由基產(chǎn)生速率[20]。試驗重復3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄STOP1基因ORF序列的克隆

使用核酸蛋白檢測儀測定從山葡萄和小葉葡萄葉片中提取的總RNA，結(jié)果濃度分別為638.1和598.6 μg/mL，A260/A280分別為1.83和1.79，可見RNA純度能夠滿足后續(xù)試驗的要求，將其保存于-80 ℃冰箱中備用。用逆轉(zhuǎn)錄獲得的山葡萄和小葉葡萄的cDNA為模板，用特異引物擴增出長度均為1800 bp左右的條帶(圖1)。對山葡萄和小葉葡萄的克隆產(chǎn)物進行測序(北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司)，得到cDNA的大小分別為1782和1800 bp。轉(zhuǎn)錄組獲得的序列與電泳的基因序列基本一致，通過DNAMAN 8.0分析發(fā)現(xiàn)其分別編碼593和599個氨基酸，及各1個終止密碼子(圖2～3)。

M：Marker DL 2000；1：山葡萄STOP1基因PCR產(chǎn)物；2：小葉葡萄STOP1基因PCR產(chǎn)物M: Marker DL 2000; 1: PCR products of STOP1 gene of V. amurensis; 2: PCR products of STOP1 gene of V. sinocinerea圖1 STOP1基因PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.1 The gel electrophoresis PCR product of STOP1

圖2 山葡萄STOP1的cDNA和氨基酸序列Fig.2 STOP1 gene cDNA and amino sequence of V.amurensis

圖3 小葉葡萄STOP1的cDNA序列及預測氨基酸序列Fig.3 STOP1 gene cDNA and amino sequence of V.sinocinerea

2.2 STOP1氨基酸序列的理化性質(zhì)

用ProtParam tool在線工具對山葡萄和小葉葡萄的STOP1多肽鏈氨基酸數(shù)目、分子式、等電點、相對分子量等進行預測發(fā)現(xiàn)：山葡萄的STOP1基因共編碼593個氨基酸，分子式C2976H4620N826O919S25，相對分子量67.48 kD，理論等電點(pI)5.21，含9366個原子；小葉葡萄中STOP1基因共編碼599個氨基酸，分子式C2958H4610N832O876S37，相對分子量67.03 kD，理論等電點(pI)6.42，含9313個原子。

2.3 預測STOP1蛋白結(jié)構(gòu)

利用GOR4預測蛋白的二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果見圖4。在組成山葡萄STOP1蛋白中，無規(guī)則卷曲(Cc)占61.89%、α-螺旋(Hh)占21.42%、折疊延伸鏈(Ee)占16.69%；在組成小葉葡萄STOP1蛋白中，無規(guī)則卷曲(Cc)占52.59%、α-螺旋(Hh)占24.37%、折疊延伸鏈(Ee)占23.04%。二者的二級結(jié)構(gòu)均有無規(guī)則卷曲>α-螺旋>折疊延伸鏈的規(guī)律，其中無規(guī)則卷曲是蛋白多肽鏈的結(jié)構(gòu)元件，大量散布于整個肽鏈中，決定了蛋白的功能，α-螺旋(Hh)則主要對蛋白骨架起到穩(wěn)定作用。

用SWISS-MODEL在線工具進行預測后發(fā)現(xiàn)，葡萄STOP1蛋白的三維結(jié)構(gòu)由α-螺旋、β-折疊片、β-轉(zhuǎn)角和鋅指結(jié)構(gòu)等組成。山葡萄STOP1蛋白的三級結(jié)構(gòu)含有α-螺旋1個、β-折疊片2個、β-轉(zhuǎn)角3個和鋅指結(jié)構(gòu)4個；小葉葡萄含有α-螺旋1個、β-折疊片2個、β-轉(zhuǎn)角3個、鋅指結(jié)構(gòu)4個(圖5)。

A: 山葡萄；B: 小葉葡萄；藍色代表α-螺旋、紅色代表折疊延伸鏈、紫色代表無規(guī)則卷曲A: V.amurensis; B: V. sinocinerea. Blue represents alpha helix, red represents folding extension chain,purple represents irregular curl圖4 STOP1蛋白的二級結(jié)構(gòu)預測Fig.4 Secondary structure prediction of the STOP1 protein

2.4 STOP1系統(tǒng)進化關(guān)系結(jié)果

利用生物分析軟件MEGA 7.0構(gòu)建了山葡萄、小葉葡萄、野生茶(Camelliasinensis)、黑楊(Populusnigra)、煙草(Nicotianatabacum)、水稻(Oryzasativa)、桉樹(Eucalyptusrobusta)、可可(Theobromacocao)、棉花(Gossypiumarboretum)、小麥(Triticumaestivum)、甜橙(Citrussinensis)、柑橘(C.clementina)、擬南芥(Arabidopsisthaliana)等的STOP1同源蛋白的系統(tǒng)進化樹。發(fā)現(xiàn)山葡萄和小葉葡萄的STOP1蛋白在氨基酸序列上具有高度相似性(相似度達96%)；此外，與山葡萄和小葉葡萄同源性在80%以上的有野生茶、黑楊、煙草、桉樹等，另外幾個種與山葡萄和小葉葡萄的同源性均在44%～76%。此外，從系統(tǒng)進化樹上可見，山葡萄與小葉葡萄在同一個分支上，說明二者STOP1基因的親緣關(guān)系極近；二者與野生茶、黑楊、煙草、桉樹、可可、棉花等的STOP1基因進化關(guān)系較近，與擬南芥、小麥、水稻、甜橙、柑橘等的STOP1基因進化關(guān)系較遠(圖6)。

A：山葡萄；B：小葉葡萄A: V.amurensis; B: V. sinocinerea圖5 STOP1蛋白三級結(jié)構(gòu)模型預測Fig.5 Prediction results of the tertiary structure model of the STOP1 protein

圖6 葡萄STOP1蛋白與其他植物STOP1蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Phylogenetic tree of STOP1 protein and other plant STOP1 proteins

2.5 STOP1基因的相對表達量及生理指標

通過qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，鋁脅迫前，山葡萄和小葉葡萄的STOP1基因相對表達量均在400以下，且相差不大；但在鋁脅迫的第7天，二者相對表達量均有不同程度的上升，其中山葡萄上升到1600以上，比小葉葡萄高3倍，此時山葡萄的相對表達量達到峰值；從鋁脅迫的第7～28天，小葉葡萄的相對表達量一直呈逐漸上升的趨勢，而山葡萄則呈逐步下降的趨勢，到第28天，小葉葡萄上升至接近1600，比下降到最小值的山葡萄高9.5倍(圖7)。可見，鋁脅迫下耐鋁性強的葡萄種質(zhì)STOP1基因上升幅度平穩(wěn)，且峰值出現(xiàn)的晚。

圖7 鋁脅迫期間STOP1基因的相對表達量及生理指標的變化Fig.7 Relative expression of STOP1 gene and changes of physiological indices during aluminum stress

脂過氧化的產(chǎn)物丙二醛的含量與膜脂受氧化破壞的程度呈正相關(guān)；而H2O2和氧自由基均會對膜脂造成氧化破壞，且其含量越高，氧化破壞程度越大。由圖7可見，鋁脅迫前，山葡萄與小葉葡萄的丙二醛和H2O2含量相差均不大；從鋁脅迫開始至第21天，2個種均呈上升趨勢，且山葡萄的上升幅度大于小葉葡萄，到第21天時，山葡萄的丙二醛和H2O2含量均達到峰值，此時山葡萄這2項指標均高于小葉葡萄2倍左右；從鋁脅迫的第21～28天，山葡萄的丙二醛和H2O2含量均呈下降趨勢，但小葉葡萄呈平穩(wěn)的上升趨勢。此外，鋁脅迫前山葡萄與小葉葡萄的氧自由基產(chǎn)生速率相差不大；在鋁脅迫的第7天，山葡萄的氧自由基產(chǎn)生速率達到峰值，比小葉葡萄高1.4倍，之后便呈下降趨勢；而小葉葡萄從鋁脅迫開始至第21天均呈上升趨勢，在第21天達到峰值，此時比山葡萄高3倍左右?？梢姡X脅迫下，耐鋁性強的葡萄種質(zhì)丙二醛、H2O2含量、氧自由基產(chǎn)生速率上升平穩(wěn)，峰值出現(xiàn)較晚，細胞膜受到不可逆的損傷也較晚，而耐鋁性弱的葡萄種質(zhì)這些指標在鋁脅迫早期就大幅度上升，峰值出現(xiàn)較早，細胞膜較早就受到不可逆損傷。這些指標的變化趨勢與STOP1基因相對表達量的變化趨勢一致，說明鋁脅迫下，STOP1基因的相對表達量與葡萄耐鋁性密切相關(guān)。

3 結(jié) 論

3.1 作物耐鋁性與STOP1基因

鋁元素在土壤中含量豐富，在中性或堿性土壤中，并不會對作物造成危害，但在酸性(pH<5)土壤中，由于產(chǎn)生大量Al3+而抑制作物的生長發(fā)育[5]。不同種植物或同種植物的不同基因型對鋁毒的耐受性差異較大[21]。一般認為，起源于熱帶亞熱帶酸性土壤地區(qū)的植物適應(yīng)鋁毒能力更強[22]。通過挖掘耐鋁毒基因，利用現(xiàn)代生物技術(shù)來提高作物耐鋁毒能力，是解決酸性土壤地區(qū)鋁毒問題最有效的方法。山葡萄是起源于中國東北中性或微堿性土壤地區(qū)的一個種，目前已有馴化栽培，其耐鋁性較弱；小葉葡萄是起源于中國南方酸性土壤地區(qū)的一個野生種，目前還處于野生狀態(tài)，其耐鋁性較強。植物下游耐鋁毒基因的表達可被具有高度保守的C2H2鋅指結(jié)構(gòu)域的STOP1蛋白調(diào)控，如在煙草[15]和桉樹[19]中均發(fā)現(xiàn)STOP1蛋白可通過調(diào)控MATE基因和ALS3基因表達來提高其耐鋁性，在擬南芥中[13-14]發(fā)現(xiàn)AtSTOP1蛋白可通過調(diào)控AtALMT1、ALS3和AtMATE基因表達來提高其耐鋁性，此外，水稻(Oryzasativa)OsMATE基因在其耐鋁性中也起著重要的作用[16]。這為探究葡萄STOP1基因提供了研究思路和理論依據(jù)。

3.2 葡萄與其他植物的STOP1基因同源性

在探明了山葡萄和小葉葡萄耐鋁性的基礎(chǔ)上，克隆出了二者的鋅指轉(zhuǎn)錄因子，分別命名為VaSTOP1和VsSTOP1基因。STOP1基因在植物耐鋁毒中起著重要作用，這在擬南芥[13]和高粱(Sorghumbicolor)[23]中均有報道。此外，亦有研究表明，赤小豆(Vignaumbellata)的VuSTOP1基因可調(diào)控VuMATE1基因的表達[24]，高粱的SbSTOP1蛋白定位于細胞核中，可調(diào)控與耐鋁毒相關(guān)基因SbSTAR2和SbMATE的表達[23]，進而增強其耐鋁毒能力。羅佳佳等[18]發(fā)現(xiàn)，STOP1蛋白為典型的鋅指結(jié)構(gòu)蛋白，能夠調(diào)控下游基因的表達，可推測本研究中，VaSTOP1和VsSTOP1蛋白亦有此結(jié)構(gòu)和功能。進化分析發(fā)現(xiàn)，山葡萄VaSTOP1蛋白與小葉葡萄VsSTOP1蛋白的親緣關(guān)系最近，同源性達96%，二者與同一分支的野生茶CcSTOP1、黑楊PnSTOP1、煙草NtSTOP1、桉樹ErSTOP1的同源性均在80%以上，與另一分支的擬南芥AtSTOP1、小麥TaSTOP1、水稻OsSTOP1等的同源性在44%～76%，說明STOP1蛋白在不同物種間具有較高的保守性。

3.3 STOP1基因的表達量及膜脂過氧化指標與葡萄的耐鋁性

擬南芥AtSTOP1基因[13]、大豆(Glycinemax)GmSTOP1基因[17,25]、柱花草(Stylosanthesguianensis)SgSTOP1基因[18]、高粱SbSTOP1基因[23]和赤小豆(Vignaumbellata)VuSTOP1基因[24]在Al3+處理后表達量均顯著增加。然而，Al3+處理后，與STOP1基因同源的水稻OsART1基因表達量并沒有顯著增加，說明Al3+不能調(diào)控該基因的表達，但下游耐鋁基因OsSTAR的表達量卻增強了。在本研究中，鋁脅迫的前7 d，VaSTOP1和VsSTOP1的表達量均大幅度上升，但從脅迫的第7～28天，耐鋁性弱的山葡萄VaSTOP1表達量大幅度下降，而耐鋁性強的小葉葡萄VsSTOP1則一直處于平穩(wěn)的上升趨勢；通過對山葡萄和小葉葡萄膜脂過氧化指標測定后發(fā)現(xiàn)，其變化規(guī)律與STOP1表達量的變化規(guī)律基本相似，即鋁脅迫下，二者的膜脂過氧化物質(zhì)均呈先上升后下降的趨勢，其中耐鋁性弱的山葡萄峰值出現(xiàn)的時間早于耐鋁性強的小葉葡萄?？梢?，鋁脅迫下，耐鋁性強的小葉葡萄的VsSTOP1基因可長時間持續(xù)大量表達，其細胞存活的時間較長，可持續(xù)產(chǎn)生并積累氧自由基及膜脂過氧化產(chǎn)物，而耐鋁性弱的山葡萄的VaSTOP1基因表達量在鋁脅迫短時間內(nèi)就達到高峰，隨后便開始下降，此時其細胞已經(jīng)逐漸開始死亡，細胞內(nèi)的氧自由基和膜脂過氧化產(chǎn)物亦隨著細胞的死亡而逐漸下降。

4 結(jié) 論

本研究克隆了山葡萄和小葉葡萄的VaSTOP1和VsSTOP1基因，二者的序列長度分別為1782和1800 bp，分別編碼594和600個氨基酸，相對分子量分別為67.03和67.48 kD，理論等電點分別為5.21和6.42。二者二級結(jié)構(gòu)的規(guī)律是折疊延伸鏈<α-螺旋<無規(guī)則卷曲；由α-螺旋、β-折疊片、β-轉(zhuǎn)角和鋅蛋白等組成二者的三級空間結(jié)構(gòu)。系統(tǒng)進化樹分析發(fā)現(xiàn)，VaSTOP1與VsSTOP1的同源性高達96%，二者與CcSTOP1、PnSTOP1、NtSTOP1、ErSTOP1的同源性均在80%以上。鋁毒脅迫下，VaSTOP1基因表達量先上升后下降，峰值較早出現(xiàn)，而VsSTOP1基因表達量則穩(wěn)定上升，這與二者的膜脂過氧化物質(zhì)的變化規(guī)律基本一致。