野生香菇黔香篩5號菌絲的生物學(xué)特性及抗氧化活性

曾 茜，陳 旭，楊 雨，楊仁德，王曉敏

(1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴陽 550025；2.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所，貴陽 550006)

【研究意義】香菇(Lentinulaedodes)又名香蕈、椎茸、花菇，隸屬于擔(dān)子菌門(Basidiomycota)蘑菇綱(Agaricomycetes)蘑菇目(Agaricales)類臍菇科(Omphalotaceae)微香菇屬(Lentinula)，人工栽培起源于我國，是世界第二大生產(chǎn)菇類[1]。香菇種植為勞動密集型農(nóng)業(yè)，因與農(nóng)戶利益聯(lián)結(jié)緊密，促進(jìn)了生產(chǎn)規(guī)模的不斷壯大，然而優(yōu)良種質(zhì)資源儲備匱乏和適栽菌材日益緊缺已成為制約產(chǎn)業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵因素[2-4]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】據(jù)統(tǒng)計，2018年我國出產(chǎn)香菇1000余萬t，占食用菌總產(chǎn)量1/4以上，遠(yuǎn)超于其他種類食用菌[5]。香菇作為家常傳統(tǒng)美食不僅味道鮮美，營養(yǎng)豐富，還兼具保健功能，是一種普遍認(rèn)可的食藥同源真菌，其藥用價值自古以來就有著述及報道[6-8]。特別是香菇多糖(Lentinan, LNT)已受到世界各國學(xué)者的廣泛關(guān)注，相繼開展了許多藥理與臨床研究[9]，具有抗腫瘤[10]、抗氧化[11]、免疫調(diào)節(jié)[12]等多種生物活性。我國擁有極其豐富的地域野生香菇種質(zhì)資源，多樣性特征顯著，但缺乏用于地方適栽品種的創(chuàng)新創(chuàng)制研究[13]。如何開發(fā)并利用好野生資源，挖掘優(yōu)質(zhì)性狀基因，馴化或選育出更多生長適應(yīng)性強、高產(chǎn)穩(wěn)定、種性優(yōu)良的香菇品種，是推動產(chǎn)業(yè)健康及創(chuàng)新發(fā)展的重要途經(jīng)[14]?！颈狙芯壳腥朦c】通過前期在貴州銅仁梵凈山國家自然保護(hù)區(qū)采集篩選獲得的一株野生香菇作為試驗菌株，經(jīng)馴化已在印江、播州及義龍等地開展栽培小試，均表現(xiàn)出副產(chǎn)物基質(zhì)適料性強、生產(chǎn)周期短、商品性狀優(yōu)良等特點，具備較好的發(fā)展應(yīng)用前景?！緮M解決的關(guān)鍵問題】采用固體和液體培養(yǎng)方式，以菌落直徑和菌絲體干重作為主要考察指標(biāo)，從營養(yǎng)條件和環(huán)境因素方面研究該香菇菌株菌絲(體)的生物學(xué)特性，并基于不同添加物(皇竹草和中藥渣浸煮汁)進(jìn)一步測定經(jīng)液體發(fā)酵后其香菇多糖的抗氧化活性，以期為高活力菌種的制備及功能性產(chǎn)品開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 采集分離自貴州省銅仁市梵凈山國家自然保護(hù)區(qū)，菌株編號為黔香篩5號，現(xiàn)保存于貴州省農(nóng)科院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所微生物研究室。

1.1.2 試劑 沙氏培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基、蔗糖、乳糖、甘露醇、麥芽糖、葡萄糖、(NH4)2SO4、酵母浸膏、硝態(tài)氮、NH4Cl、蛋白胨、皇竹草浸煮汁、中藥渣浸煮汁、無水乙醇、正丁醇、三氯甲烷、過硫酸鉀、1,1-二苯基-2-苦基肼(DPPH)、2,2-聯(lián)氮基雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)、Vc。

1.2 試驗方法

1.2.1 不同因子對香菇黔香篩5號營養(yǎng)生長的影響 ①碳源。以改良沙氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別添加20 g/L的蔗糖、乳糖、甘露醇、麥芽糖、葡萄糖作為碳源制成相應(yīng)的平板培養(yǎng)基(培養(yǎng)皿直徑90 mm)，以不添加碳源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基作對照(CK)。參照文獻(xiàn)[15]的方法利用打孔器取直徑為5 mm的單個活化菌餅接種于各培養(yǎng)基中，置于24 ℃恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)8 d，觀察不同處理菌落的生長情況，并采用十字交叉法分別測量菌落直徑。每個處理5次重復(fù)(下同)。②氮源。在改良沙氏培養(yǎng)基中分別加入10 g/L (NH4)2SO4、酵母浸膏、硝態(tài)氮、NH4Cl、蛋白胨作為氮源，并以不添加氮源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基作對照(CK)。③初始pH。在無菌條件下，利用濃度為0.1%的HCl和NaOH溶液調(diào)節(jié)基礎(chǔ)培養(yǎng)基初始pH分別至2.0、4.0、6.0、8.0、10.0進(jìn)行試驗。④溫度。將接種菌餅的基礎(chǔ)培養(yǎng)基平板分別置于10、15、20、25、30和35 ℃條件下培養(yǎng)。

1.2.2 不同因子對香菇黔香篩5號菌絲體生物量的影響 ①碳源。以改良沙氏培養(yǎng)液為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，分別添加20 g/L的蔗糖、乳糖、甘露醇、麥芽糖、葡萄糖作為碳源，以不加碳源培養(yǎng)液為對照(CK)，裝液量為200 mL/500 mL，再分別以3%(V/V)接種量將種子液接入不同培養(yǎng)液，pH自然，置于24 ℃條件下，150 r/min恒溫?fù)u瓶培養(yǎng)12 d。之后用已烘干稱重的濾紙過濾，并一起置于60 ℃干燥箱中烘干至恒重稱量，減除干濾紙重量即為菌絲體生物量。每個處理5次重復(fù)[16-17](下同)。②氮源。參照1.2.1的氮源設(shè)置制備培養(yǎng)液，即以改良沙氏培養(yǎng)液為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，分別加入10 g/L (NH4)2SO4、酵母浸膏、硝態(tài)氮、NH4Cl、蛋白胨作氮源，以基礎(chǔ)培養(yǎng)液作對照(CK)。③初始pH。參照1.2.1的培養(yǎng)液初始pH設(shè)置制備培養(yǎng)液。④溫度。參照1.2.1的溫度設(shè)置進(jìn)行培養(yǎng)。⑤接種量。以改良沙氏培養(yǎng)液為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，分別設(shè)置1%、2%、3%、4%、5%和6%(V/V)的接種量。

1.2.3 不同添加物對香菇黔香篩5號抗氧化活性的影響 ①菌絲體發(fā)酵培養(yǎng)。以改良沙氏培養(yǎng)液為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，分別添加10%(V/V)的皇竹草浸煮汁、中藥渣浸煮汁及馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液，裝液量為200 mL/500 mL，按3%(V/V)接種香菇種子液，置于24 ℃條件下，150 r/min恒溫?fù)u瓶培養(yǎng)20 d，用濾紙收集菌絲體低溫干燥備用。②胞內(nèi)多糖制備。參照MA等[18]改良后的水提醇沉法。將菌絲體研磨至粉末狀，加25倍蒸餾水，90 ℃水浴煮提2次混合濾液，旋蒸濃縮至1/4體積，用3倍體積95%乙醇，于4 ℃醇沉24 h，4500 r/min離心5 min，烘干至恒重。利用Sevag法脫蛋白，按等量加入香菇多糖溶液振蕩2次，每次1 h，靜置分層并分離上層溶液，選擇3500 Da透析袋流水透析24 h，經(jīng)冷凍干燥后獲得皇竹草香菇多糖HLNT、中藥渣香菇多糖ZLNT、PD香菇多糖PLNT。③抗氧化性測定。將上述多糖樣品分別配制為濃度0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/mL的水溶液，以Vc為對照(CK)，測定DPPH、ABTS、羥基自由基的清除率，每個處理3次重復(fù)。參照趙詩雨等[11，19]的方法進(jìn)行測定。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

利用SPSS 17.0和Excel 2010對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同因子處理香菇黔香篩5號菌落的生長

從圖1看出，香菇黔香篩5號在不同碳源、氮源、溫度及初始pH等因子影響下其菌落生長存在差異。

2.1.1 碳源 各處理的菌落直徑為0.2～7.7 cm，表現(xiàn)為葡萄糖>蔗糖>麥芽糖>乳糖>無碳(CK)>甘露醇。當(dāng)甘露醇作為碳源時，菌絲幾乎不能生長，而在其他碳源平板培養(yǎng)基上均能生長，但對不同碳源的利用能力存在顯著差異。其中，含葡萄糖培養(yǎng)基上的菌絲生長速度最快，菌落長勢良好，菌絲粗壯濃密，培養(yǎng)10 d后其菌落直徑達(dá)7.7 cm，分別為CK和劣勢組乳糖的1.97和1.45倍，顯著高于除蔗糖外的其余處理。其次是含蔗糖培養(yǎng)基上的菌絲，生長旺盛，較潔白濃密，菌落直徑為7.1 cm，顯著高于除麥芽糖外的其余處理。蔗糖、麥芽糖和乳糖差異顯著，均優(yōu)于CK；乳糖培養(yǎng)基中的菌絲較稀疏，且有少量氣生菌絲產(chǎn)生。結(jié)果表明，葡萄糖為最佳碳源，蔗糖次之。

2.1.2 氮源 各處理的菌落直徑為0.5～8.6 cm，表現(xiàn)為(NH4)2SO4>蛋白胨>NH4Cl>酵母浸膏>無氮(CK)>硝態(tài)氮。菌株在硝態(tài)氮培養(yǎng)基上無法生長，而其他氮源培養(yǎng)基的菌落生長速度均優(yōu)于CK。其中，硫酸銨和蛋白胨能顯著促進(jìn)菌絲生長，菌落直徑分別為8.6和7.6 cm，生長速率分別達(dá)1.08和0.95 cm/d，菌絲潔白濃密，長勢較好，且以硫酸銨處理菌絲生長的綜合性狀最優(yōu)，其菌落直徑顯著高于其余處理；其次為氯化銨和酵母浸膏處理，菌絲生長相對緩慢，稀疏不整齊，略發(fā)黃。

2.1.3 溫度 香菇黔香篩5號菌株在溫度14～38 ℃時菌絲均可生長，各處理的菌落直徑為2.0～6.7 cm，表現(xiàn)為30 ℃>25 ℃>20 ℃>35 ℃>15 ℃>10 ℃，即隨著培養(yǎng)溫度升高，菌落直徑呈先升后降趨勢。其中，當(dāng)溫度為30 ℃時菌落直徑達(dá)最大；最適溫度為25～30 ℃，對高溫表現(xiàn)出較好的耐受性，培養(yǎng)8 d菌落直徑達(dá)6.5～6.7 cm，差異不顯著，但均顯著高于其他溫度條件下的菌落直徑；當(dāng)溫度<15 ℃或>30 ℃時，菌落長勢緩慢，菌絲較稀疏細(xì)弱。

2.1.4 初始pH 各處理的菌落直徑為0.4～5.9 cm，表現(xiàn)為pH 4.0>pH 6.0>pH 8.0>pH 2.0>pH 10.0，即隨著初始酸堿度升高，菌落直徑呈先升后降趨勢。菌株在初始pH為2.0～8.0的培養(yǎng)基上均能生長，pH最適范圍在4.0～6.0，培養(yǎng)8 d后菌落直徑可達(dá)5.6～5.9 cm，且菌絲健壯，較濃密。其中，pH 4.0時菌落直徑最大，pH 6.0時其次(5.6 cm)，二者菌落直徑差異不顯著，但均顯著高于其余處理；當(dāng)pH達(dá)10.0其長勢急劇減弱，甚至無法生長。

2.2 不同因子處理香菇黔香篩5號菌絲體的生物量

從圖2看出，不同碳源、氮源、溫度及初始pH等因子影響下香菇黔香篩5號菌株菌絲體的生物量(干重)存在差異。

從左到右接種量依次為1%、2%、3%、4%、5%、6%(V/V)Inoculum sizes were designed by 1, 2, 3, 4, 5 and 6 percent, in order圖2 不同因子處理香菇黔香篩5號菌絲體的生物量(干質(zhì)量)Fig.2 Biomass(dry weight) of Lentinula edodes treated with different factors

2.2.1 碳源 各處理的菌絲體干重為0.09～1.49 g，表現(xiàn)為蔗糖>葡萄糖>乳糖>麥芽糖>無碳(CK)>甘露醇。香菇黔香篩5號仍無法利用液體培養(yǎng)基中的甘露醇，與CK相比，其余碳源處理均能顯著提高該菌株菌絲體生物量的積累。其中，以蔗糖處理黔香篩5號菌株的菌絲體生長情況最佳，碳源利用率高，產(chǎn)量較好，其菌絲體干重為CK的3.17倍，顯著高于其余處理，且在此碳源條件下的菌絲球數(shù)量相對較多、均勻致密、大小適宜，培養(yǎng)液較澄清。葡萄糖、乳糖和麥芽糖處理次之，菌絲體產(chǎn)量為CK的2.60～2.70倍，均勻度略差，三者間差異不顯著，葡萄糖和乳糖處理的菌絲體干重顯著高于除麥芽糖外的其余處理，麥芽糖處理的菌絲體干重顯著高于無碳和甘露醇處理。

2.2.2 氮源 各處理的菌絲體干重為0.07～1.65 g，表現(xiàn)為(NH4)2SO4>蛋白胨>酵母浸膏>NH4Cl>無氮(CK)>硝態(tài)氮。硝態(tài)氮處理的液體培養(yǎng)基無法被黔香篩5號菌株吸收，其他處理的菌絲體干重均顯著高于CK。其中，添加硫酸銨和蛋白胨的培養(yǎng)基效果較好，菌絲體干重分別為1.65和1.62 g，二者差異不顯著，但均顯著高于其余處理；且兩者的菌絲球在數(shù)量、大小、均勻度和懸浮性等性狀上差異不明顯，硫酸銨處理菌絲球輪廓更清晰，相互分明。酵母浸膏和氯化銨處理其次，培養(yǎng)液澄清，菌絲體干重分別為1.48和1.39 g，二者差異不顯著，但均顯著高于無氮(CK)和硝態(tài)氮。

2.2.3 溫度 各處理的菌絲體干重為0.33～1.45 g，表現(xiàn)為25 ℃>30 ℃>35 ℃>20 ℃>15 ℃>10 ℃，即隨著培養(yǎng)溫度升高，菌絲體生物量呈先升后降趨勢。不同培養(yǎng)溫度處理黔香篩5號菌株的菌絲體生長情況和生物量積累存在顯著性差異。當(dāng)溫度為25 ℃時，菌絲體干重達(dá)最大，為1.45 g，該條件下菌絲球性狀均優(yōu)于其他處理，且培養(yǎng)液較澄清。隨著溫度的升高或下降，菌絲體干重均逐漸降低，而當(dāng)溫度高于35 ℃或低于20 ℃時，菌絲球生長緩慢并受到抑制，少部分相互粘連，培養(yǎng)液較渾濁。

2.2.4 接種量 各處理的菌絲體干重為0.63～0.94 g，表現(xiàn)為4%>3%>1%>2%>6%>5%，不同接種量處理黔香篩5號菌株的菌絲球性狀及干重存在一定差異。其中，接種量3%(V/V)和4%菌絲體生物量積累均較好，干重分別達(dá)0.91和0.94 g，二者差異不顯著，但前者菌絲球的均勻度、懸浮性及大小形態(tài)均優(yōu)于后者。接種量1%和2%處理其次，而當(dāng)接種量為1%時，菌絲球性狀表現(xiàn)為數(shù)量少、形態(tài)大，且相互粘連，難以分生擴(kuò)增。接種量6%和5%處理的菌絲體生物量最低，二者差異不顯著，但均顯著低于除2%處理外的其余處理。

2.2.5 初始pH 各處理的菌絲體干重為0.21～1.16 g，表現(xiàn)為pH 6.0>pH 8.0>pH 4.0>pH 10.0>pH 2.0，即隨著培養(yǎng)溫度升高，菌絲體干重呈先升后降趨勢，各處理間差異顯著。液體培養(yǎng)條件下黔香篩5號菌絲體在pH 4.0～10.0均能較好生長，菌絲體干重達(dá)0.6 g以上。其中，當(dāng)初始pH為6.0時，菌絲體生物量積累最多，達(dá)1.16 g，顯著高于其余處理，菌絲球相對密集均勻，懸浮性較好，互相分明。pH 8.0處理其次，干重為1.01 g；當(dāng)pH為2.0時，菌絲體生長受到明顯抑制。

2.3 不同添加物處理香菇黔香篩5號的抗氧化活性

從圖3看出，不同添加物處理黔香篩5號產(chǎn)香菇多糖的抗氧化活性存在差異。

圖3 不同發(fā)酵處理產(chǎn)香菇多糖對DPPH自由基、羥基自由基及ABTS自由基的清除率Fig.3 Scavenging rate of lentinan polysaccharide produced by different liquid fermentation to DPPH radical,hydroxyl radical and ABTS radical

2.3.1 清除DPPH自由基 皇竹草(HLNT)、中藥渣(ZLNT)浸煮汁及馬鈴薯葡萄糖(PLNT)3種添加物處理的香菇多糖對DPPH自由基清除能力與濃度呈正相關(guān)，濃度為0.2～1.0 mg/mL清除率增長較快，而濃度超過1.0 mg/mL后HLNT和PLNT處理的清除能力逐漸趨于平緩，而ZLNT處理多糖濃度大于3.0 mg/mL時，其活性較其他處理呈現(xiàn)出較好的增強趨勢。在濃度達(dá)5.0 mg/mL時，ZLNT、HLNT和PLNT處理對DPPH自由基的清除率分別為86.7%、78.1%和66.0%，均低于Vc(CK)。與HLNT和PLNT相比，ZLNT對DPPH自由基具有更強的清除作用，且最大值為Vc(CK)的0.89倍。

2.3.2 清除羥基自由基 不同處理香菇多糖隨著濃度增加，其清除羥基自由基能力也逐漸增強。當(dāng)香菇多糖濃度為5.0 mg/mL時，ZLNT、PLNT和HLNT處理對羥基自由基的清除率分別為73.5%、63.7%和59.8%，但均低于Vc(CK)。其中，ZLNT對羥基自由基的清除作用明顯強于PLNT和HLNT處理，而PLNT和HLNT處理間差異不明顯。

2.3.3 清除ABTS自由基 多糖濃度直接影響3個處理對于ABTS自由基的清除能力，相較Vc(CK)，ZLNT和PLNT處理清除率隨濃度增長緩慢，且差異不明顯。當(dāng)香菇多糖濃度達(dá)5.0 mg/mL時，HLNT、ZLNT和PLNT處理對ABTS自由基的清除率依次為75.5%、57.8%及52.1%，均低于Vc(CK)，但HLNT清除ABTS自由基的效果明顯高于ZLNT和PLNT處理。

3 討 論

隨著香菇產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，種植規(guī)模不斷壯大，產(chǎn)銷競爭日益激烈，菌種作為食用菌生產(chǎn)上的重要基礎(chǔ)資料，市場需求已逐漸由價格轉(zhuǎn)變?yōu)閮?yōu)質(zhì)、穩(wěn)定及適應(yīng)性強等品種特性。而目前國內(nèi)香菇主栽品種為野生資源譜系中的較小分支，遺傳背景狹窄，缺乏對優(yōu)良種質(zhì)資源的挖掘與利用，導(dǎo)致香菇新品種選育及良種繁育工作相對滯后[20]。研究發(fā)現(xiàn)，我國是世界上野生香菇種質(zhì)資源最豐富、遺傳多樣性最高的地區(qū)，地理環(huán)境和氣候生態(tài)多變促使各譜系間差異頻繁，且西南和西北區(qū)域為香菇多樣性分布中心，這些都為優(yōu)勢品種創(chuàng)制提供了有利條件[21-23]。因此，野生香菇資源的收集評價及開發(fā)應(yīng)用具有深遠(yuǎn)的現(xiàn)實意義。

馴化或選育出的優(yōu)良食用菌品種在應(yīng)用于生產(chǎn)前，必須全面掌握其生物學(xué)信息及種性特點等要素，盡可能預(yù)防和減少不必要損失[24]。本研究已初步篩選出適宜于香菇黔香篩5號菌絲生長的營養(yǎng)需求及培養(yǎng)條件，可為后續(xù)進(jìn)一步探明各因素對其生長發(fā)育、遺傳規(guī)律及基因互作影響提供參考。錢可晴等[25]通過對野生皺木耳開展生物學(xué)特性研究及本地馴化栽培，獲得出菇性狀穩(wěn)定的木耳屬新品種鹿肚耳菌株，為工廠化栽培提供了適宜種質(zhì)資源，也充分說明野生資源是食用菌品種開發(fā)與創(chuàng)新利用的重要來源。并且，隨著菌林矛盾的日益凸顯，決定了利用農(nóng)林副產(chǎn)物替代闊葉樹木屑作為香菇栽培原料將成為主要發(fā)展趨勢，如何開發(fā)適宜特殊營養(yǎng)源和特定地理區(qū)域的優(yōu)勢品種，或挖掘出更多功能基因是重要的育種方向，也是產(chǎn)業(yè)發(fā)展的根本動力。另外，研究發(fā)現(xiàn)不同栽培基質(zhì)條件下獲得的食用菌代謝產(chǎn)物也會存在一定差異，部分表現(xiàn)為可誘導(dǎo)或抑制某些特定代謝產(chǎn)物產(chǎn)生[26]。香菇黔香篩5號菌株具有較好的副產(chǎn)物適料性，添加其浸煮汁可有效促進(jìn)發(fā)酵物的抗氧化活性，與朱伶俐、吳鴻雪等[27-28]利用不同基質(zhì)栽培猴頭菇和靈芝，改善代謝產(chǎn)物體外免疫及抗腫瘤活性結(jié)果相似，表明篩選并改良基質(zhì)配方亦可作為食藥用菌活性產(chǎn)物富集及產(chǎn)品研發(fā)的新途徑[29]。

4 結(jié) 論

研究結(jié)果表明，不同碳氮源、培養(yǎng)溫度及pH等因素對香菇黔香篩5號菌株的菌絲生長存在顯著影響。其中，母種培養(yǎng)基的最佳碳氮源分別為葡萄糖和硫酸銨，最適培養(yǎng)溫度25～30 ℃，初始pH在偏酸性的4.0～6.0為宜。液體培養(yǎng)基中以蔗糖作為碳源、硫酸銨或蛋白胨作為氮源時更有利于菌絲體生物量的積累，且培養(yǎng)溫度25 ℃、接種量3%(V/V)及pH 6.0為適宜條件。值得注意的是，在2種菌絲培養(yǎng)方式下，供試菌株均無法利用甘露醇和硝態(tài)氮作為營養(yǎng)物質(zhì)。并且，香菇黔香篩5號液體發(fā)酵添加皇竹草(HLNT)和中藥渣(ZLNT)浸煮汁均能提高多糖的抗氧化活性，ZLNT對DPPH及羥基自由基具有顯著清除作用，當(dāng)濃度為5 mg/mL時，清除率分別達(dá)86.7%和73.5%；HLNT則是對ABTS自由基清除效果較好，相同濃度下清除率為75.5%。