威寧地區(qū)茶樹種質(zhì)資源的抗旱性研究

劉 燕，羅文敏，段如雁，李 蕓，楊秀忠

(1. 貴州省生物研究所, 貴陽 550009；2. 威寧自治縣山地特色農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，貴州 威寧 553100)

【研究意義】威寧縣地處貴州省西部，屬于高海拔高寒地區(qū)，該地氣候溫和，冬無嚴(yán)寒、夏無酷暑，有利于茶葉有機(jī)物的合成和積累[1]，產(chǎn)出的茶葉氨基酸、咖啡堿、黃酮、維生素和芳香類物質(zhì)含量均高于低山地區(qū)[2]。生長在海拔1900～2200 m的威寧高山茶，因其香味濃厚、回味甘甜、經(jīng)久耐泡和獨特的“豆香味”而深受人們喜愛。但威寧縣春季降水偏少[2]，平均月雨量低于150 mm，春季干旱嚴(yán)重抑制了幼林茶樹生長，影響了威寧高山茶的產(chǎn)量和品質(zhì)，減少了茶農(nóng)的經(jīng)濟(jì)收入。因此，選擇抗旱性強(qiáng)的茶樹品種對威寧地區(qū)茶產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展有積極的促進(jìn)作用。【前人研究進(jìn)展】葉片的顯微結(jié)構(gòu)是茶樹生長發(fā)育過程一系列生理活動基礎(chǔ)，與茶樹的分類、遺傳和抗逆性等具有密切關(guān)系[3]。黎釗等[3]研究發(fā)現(xiàn)，葉片較厚的茶樹品種比葉片較薄的茶樹抗旱性強(qiáng)，表皮厚度大的茶樹品種比表皮厚度小的抗旱性強(qiáng)。楊鳳等[4]則指出，葉片柵欄組織層數(shù)多、柵海比(柵欄組織/海綿組織)高的茶樹比柵欄組織層數(shù)少、柵海比小的茶樹抗旱性強(qiáng)[4]。除了葉片解剖結(jié)構(gòu)的改變外，茶樹在生理生化上也會對干旱產(chǎn)生積極響應(yīng)[5]。茶樹可通過提高自身調(diào)節(jié)滲透能力、改變保護(hù)酶活性等生理活動來適應(yīng)干旱[6-7]?！颈狙芯壳腥朦c】植物的抗旱性受多種因素影響。前人對茶樹種質(zhì)資源抗旱性評價大多采用單個指標(biāo)進(jìn)行分析，對數(shù)據(jù)綜合考量較少[8]，單個指標(biāo)評定植物抗旱性容易造成的數(shù)據(jù)的孤斷性。采用多項指標(biāo)對植物抗旱性進(jìn)行綜合評價，評定結(jié)果與實際情況更加接近[9]。隸屬函數(shù)法可結(jié)合多項測定指標(biāo)，對材料特性進(jìn)行綜合評價，克服單一研究指標(biāo)的不足[8]?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以威寧縣茶產(chǎn)區(qū)收集到的9份茶樹種質(zhì)資源為試驗材料，對其進(jìn)行葉片解剖結(jié)構(gòu)觀察、抗氧化酶活性和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的測定，探究其在葉片解剖結(jié)構(gòu)和生理上的差異，并通過模糊隸屬函數(shù)法對其進(jìn)行抗旱性綜合評價，以期找出適合威寧地區(qū)種植的茶樹品種，為威寧高山茶產(chǎn)業(yè)的發(fā)展奠定堅實的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

茶葉種質(zhì)資源共9份，來源于貴州省畢節(jié)市威寧縣茶產(chǎn)區(qū)，分別是黃金芽、云南大葉茶、鳩坑小葉種、福鼎大白茶、安吉白茶、銀霜、茗科1號、威寧老茶樹、龍井43。種質(zhì)資源種植于威寧香爐山茶園公司的草海西碼頭茶葉種植基地內(nèi)(25°35′11″N，104°25′30″E)。種植規(guī)格為行距1.6 m，叢距0.6 m，株距0.25 m，雙行條栽，每叢3株。每個品種種植500株以上，茶苗均為2年生扦插苗，基地生長環(huán)境及人工管理一致。采摘連續(xù)10 d未澆水或未受到雨水灌溉的茶苗葉片進(jìn)行相關(guān)分析測定。

1.2 方法

1.2.1 石蠟切片制作與觀察 隨機(jī)選取各茶樹第2～3節(jié)位成熟葉，用徠卡刀片沿葉片主脈中部橫切成0.5 cm×0.5 cm的小塊；放入福爾馬林—醋酸—酒精(FAA)固定液中固定、抽氣。系列酒精脫水各2 h，二甲苯透明，石蠟包埋，徠卡RM2016切片機(jī)切片，切片厚度為8～10 μm，番紅—固綠雙重染色，中性樹膠封片[10]。采用日本尼康顯微鏡(Eclipse E100)觀察解剖結(jié)構(gòu)，用尼康自帶拍照軟件(NiknoDS-U3)拍照，并利用Image-pro plus 6.0軟件進(jìn)行葉片厚度、柵欄組織厚度等指標(biāo)測定。

1.2.2 抗氧化酶活性測定 隨機(jī)選取各茶樹相同部位成熟葉片，用蒸餾水清洗，吸干水分，將葉片剪碎，稱取約0.1 g葉片，加入1 mL磷酸緩沖液(pH 7.5)進(jìn)行冰浴勻漿。4 ℃ 8000 r/min離心 10 min，取上清液置冰上待測。參照超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)試劑盒使用說明書操作在酶標(biāo)儀上測定SOD、POD和CAT值。

1.2.3 滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)測定 稱取0.1 g各茶樹葉片樣品，加入5 mL 3%磺基水楊酸，均質(zhì)化后過濾。取2 mL濾液加入2 mL酸性茚三酮試劑和2 mL冰醋酸，混合均勻，100 ℃下加熱反應(yīng)1 h，而后在冰上冷卻20 min，放入4 mL甲苯，冷卻至室溫。采用分光光度計法在520 nm測量脯氨酸吸光度值?？扇苄缘鞍缀坎捎每捡R斯亮藍(lán)法測定；可溶性糖含量采用蒽酮比色法測定[11]。

1.2.4 抗旱性指標(biāo)評價 采用模糊隸屬函數(shù)值法對9份茶樹種質(zhì)資源的抗旱性進(jìn)行綜合評價[12]?？购惦`屬值的計算公式如下。

(1)

(2)

1.3 數(shù)據(jù)分析

用SPSS 18.0 進(jìn)行單因素方差分析，采用LSD法進(jìn)行多重比較，顯著水平設(shè)置為α= 0.05，用Microsoft excel 2007進(jìn)行隸屬函數(shù)分析，相關(guān)圖表制作在Origin pro 8中完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同茶樹品種的葉片解剖結(jié)構(gòu)

根據(jù)不同茶樹品種葉片的解剖結(jié)構(gòu)特征(表1，圖1)，9個茶樹品種在葉片厚度、柵欄組織和海綿組織厚度、上下表皮厚度、柵欄組織和海綿組織密度、海綿組織層數(shù)和柵欄組織層及數(shù)柵/海比上都存在差異。9個茶樹品種中，葉片厚度、柵欄組織厚度和柵/海比以鳩坑小葉種的最大，其次是威寧老茶樹和福鼎大白茶，黃金芽和云南大葉茶最小。

表1 不同茶樹葉解剖結(jié)構(gòu)特征

1～9分別為黃金芽、云南大葉茶、鳩坑小葉種、福鼎大白茶、安吉白茶 、龍井43、銀霜 、茗科1號和威寧老茶樹Numbers of 1-9 were the Golden bud tea，Yunnan large leaf tea，Jiukeng small leaf tea，F(xiàn)uding white tea，Anji white tea，Longjing tea 43，Yinshuang tea, Mingke tea 1 and Weining old tea圖1 不同茶樹品種葉片的解剖結(jié)構(gòu)特征Fig.1 Anatomical structure of leaves of different tea cultivars

2.2 不同茶樹品種的抗氧化酶活性

9個茶樹品種間葉片抗氧化酶活性存在一定差異(圖2)。其中，鳩坑小葉種、福鼎大白茶、威寧老茶樹的SOD含量最高，3個品種間差異不顯著，但與黃金芽、云南大葉茶、安吉白茶、銀霜、茗科1號間差異顯著(P<0.05)，黃金芽中SOD含量最低，除與云南大葉茶差異不顯著外，與其他7個茶樹差異顯著(P<0.05)。黃金芽、安吉白茶和龍井43的POD含量最低，3個品種間無顯著性差異，但與其他6個茶樹間差異顯著(P<0.05)；云南大葉茶、鳩坑小葉種、福鼎大白茶、銀霜、茗科1號和威寧老茶樹的POD含量略有不同，但6個茶樹間無顯著性差異。鳩坑小葉種、福鼎大白和威寧老茶樹CAT含量最高，三者無顯著性差異，但與其他6個茶樹差異顯著(P<0.05)；黃金芽、安吉白茶和銀霜的CAT含量最低。

不同小寫字母表示差異達(dá)顯著性水平(P<0.05)，下同Different lowercase letters indicate significant difference at P<0.05 level. The same as below圖2 不同茶樹品種的抗氧化酶活性Fig.2 Analysis of antioxidant enzyme content in different tea cultivars

2.3 不同茶樹品種的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)

從圖3看出，9個茶樹品種間葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量存在差異性。脯氨酸含量以鳩坑小葉種、福鼎大白茶和威寧老茶樹的最高，三者間差異不顯著，與云南大葉茶、安吉白茶、龍井43和茗科1號間均無顯著性差異；黃金芽脯氨酸含量最低，與云南大葉茶和銀霜無顯著性差異，但與其他6個品種間差異顯著(P<0.05)?？扇苄缘鞍缀恳愿６Υ蟀撞璧淖罡?，與鳩坑小葉和威寧老茶樹無顯著性差異，與其他茶樹品種間差異顯著(P<0.05)；黃金芽含量最低，與其他8個茶樹品種間差異顯著(P<0.05)。

圖3 不同茶樹品種的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量Fig.3 Osmotic adjustment substances in different tea cultivars

可溶性糖含量以鳩坑小葉最高，與其他8個茶樹品種間差異顯著(P<0.05)，黃金芽含量最低，與其他8個茶樹差異顯著(P<0.05)。

2.4 不同茶樹品種抗旱性綜合評價

對各指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析，去除相關(guān)性較弱的指標(biāo)，余下葉片厚度、柵欄組織厚度、柵/海、SOD、CAT、POD、脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白作為隸屬函數(shù)綜合評價指標(biāo)，得到綜合評價表(表2)。由綜合評價得出的抗旱性為鳩坑小葉種>威寧老茶樹>福鼎大白>茗科1號>銀霜>安吉大白茶>龍井43>云南大葉茶>黃金芽。根據(jù)抗旱性等級評價的方法[13]，對9個茶樹品種進(jìn)行抗旱等級劃分，綜合評價均值為0.49，綜合評價值高于0.59的為強(qiáng)抗旱品種，包括鳩坑小葉、福鼎大白和威寧老茶樹；綜合值在0.39～0.59的為中抗旱品種，包括茗科1號和銀霜；綜合值小于0.39的弱抗旱品種，包括安吉白茶、龍井43、云南大葉茶和黃金芽。

表2 不同茶樹隸屬函數(shù)值及抗旱性綜合評價

3 討 論

植物葉片是植物進(jìn)行光合作用的場所，它的顯微結(jié)構(gòu)受植物生長發(fā)育過程一系列生理活動的影響，與植物的分類和遺傳有密切聯(lián)系[3]。黎釗[3]、楊鳳[4]等研究表明，茶樹葉片的解剖結(jié)構(gòu)與茶樹的抗旱性有一定的相關(guān)性，葉片厚度越大的茶樹比葉片厚度小的茶樹抗旱性強(qiáng)，柵/海比大的茶樹比柵/海比度小的抗旱性強(qiáng)。白重炎等[14]研究指出，上表皮厚度、柵欄組織厚度可作為品種間抗旱性指標(biāo)。本研究中，9個茶樹品種在葉片厚度、柵欄組織和海綿組織厚度、海綿組織和海綿組織密度和柵/海比上表現(xiàn)出一定的差異性，鳩坑小葉種、威寧老茶樹和福鼎大白茶的葉片總厚度、柵欄組織厚度和柵/海比上在9個茶樹品種中值最大，黃金芽和云南大葉茶的葉片厚度、柵欄組織厚度和柵/海比最小，表明茶樹間抗旱性存在明顯的遺傳差異，鳩坑小葉種、威寧老茶樹和福鼎大白茶在解剖結(jié)構(gòu)上表現(xiàn)出對干旱積極響應(yīng)。

當(dāng)植物遭受干旱脅迫時，細(xì)胞自由基濃度會迅速增加，細(xì)胞透性增大，引起蛋白質(zhì)變性，細(xì)胞受損嚴(yán)重[15]。植物體內(nèi)自由基的清除，主要依賴于SOD、CAT和POD組成的酶保護(hù)系統(tǒng)[14]。本研究中，鳩坑小葉種、威寧老茶樹和福鼎大白的SOD、POD和CAT活性較高，黃金芽和云南大葉茶的SOD、POD和CAT活性較低，表明鳩坑小葉種、威寧老茶樹和福鼎大白茶對干旱脅迫造成的活性氧清除要強(qiáng)于其他茶樹，這與林鄭和等人[16]結(jié)果相似。

干旱引起細(xì)胞失水，細(xì)胞滲透壓降低，引起胞內(nèi)物質(zhì)外滲，原生質(zhì)體結(jié)構(gòu)遭到破壞[15]。滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)增加了植物細(xì)胞溶質(zhì)濃度，降低細(xì)胞滲透勢，維持較高的滲透壓，緩解了脫水脅迫帶來的傷害，有利于細(xì)胞水分的保持和細(xì)胞各種生理過程的維持，從而對酶、抗逆性蛋白和生物膜起保護(hù)作用[17]。脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白是植物體內(nèi)常見的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)。本研究中，鳩坑小葉種、威寧老茶樹和福鼎大白茶的脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白含量均高于其他茶樹品種，表明3種茶樹遇到干旱時能有效調(diào)節(jié)細(xì)胞中滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，有效緩解干旱脅迫造成的細(xì)胞失水傷害，保證了茶樹的正常生長。

植物耐旱性性狀受多種基因共同調(diào)控，分析單個指標(biāo)無法全面反映植物對干旱脅迫的耐受性[8-12]。利用模糊隸屬函數(shù)值法可以綜合評價茶樹品種的抗旱性，準(zhǔn)確性高。本試驗利用隸屬函數(shù)值法綜合評價了9個茶樹品種抗旱性，并根據(jù)抗旱性等級評價的方法對9個茶樹品種進(jìn)行了等級分類，其中鳩坑小葉、福鼎大白、威寧老茶樹歸為強(qiáng)抗旱品種，茗科1號、銀霜歸為中等抗旱品種，安吉白茶、龍井43、云南大葉茶和黃金芽歸為弱抗旱品種，與生理試驗結(jié)果一致。

4 結(jié) 論

茶樹抗旱性鑒定是全面系統(tǒng)評價茶樹種質(zhì)資源和篩選優(yōu)質(zhì)資源最基本的內(nèi)容。本研究通過對威寧縣周邊茶區(qū)種植的9個茶樹品種的葉片解剖結(jié)構(gòu)觀察，抗氧化酶活性和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的測定，并通過模糊隸屬函數(shù)法對9個茶樹品種進(jìn)行了抗旱性綜合評價，最終篩選出抗旱性較強(qiáng)的3個品種，分別為鳩坑小葉種、威寧老茶樹和福鼎大白茶，為威寧高山茶產(chǎn)抗旱品種的選擇提供了試驗依據(jù)。