豬CD163基因的單堿基編輯研究

趙為民，王慧利，曹少先，郭日紅，王澤平，陳 哲，徐 奎，付言峰，李碧俠，任守文，程金花*

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所 江蘇省農(nóng)業(yè)種質(zhì)資源保護(hù)與利用平臺(tái)，南京 210014；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部種養(yǎng)結(jié)合重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210014；3.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院宿遷農(nóng)科所，宿遷 223800；4.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院深圳農(nóng)業(yè)基因組研究所，深圳 518124)

CRISPR/Cas9系統(tǒng)是細(xì)菌為抵御病毒入侵所進(jìn)化的一種適應(yīng)性免疫系統(tǒng)[1-3]。該系統(tǒng)利用gRNA識(shí)別并引導(dǎo)核酸酶Cas9對(duì)靶DNA進(jìn)行切割，誘發(fā)DNA的非同源重組(NHEJ)或同源重組(HDR)損傷修復(fù)機(jī)制，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因序列的編輯[4-6]。CRISPR/Cas9系統(tǒng)自開發(fā)以來已被廣泛用于疾病治療、基因功能研究與新品種培育[7-11]。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂后，細(xì)胞內(nèi)傾向于利用非同源重組方式修復(fù)[12]，這種修復(fù)方式隨機(jī)性強(qiáng)，插入或刪除的堿基數(shù)難以控制,有時(shí)無法對(duì)目的基因產(chǎn)生敲除效果，從而導(dǎo)致篩選有效的突變體耗時(shí)耗力。單堿基編輯技術(shù)(base editor)是基于CRISPR系統(tǒng)的新型靶基因定點(diǎn)修飾技術(shù)，在不產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂的情況下，利用胞嘧啶脫氨酶或腺嘌呤脫氨酶對(duì)靶位點(diǎn)進(jìn)行精準(zhǔn)的單堿基編輯，實(shí)現(xiàn)C-T或A-G的替換，從而開發(fā)了CBE和ABE系統(tǒng)[12-13]，自2016年報(bào)道以來受到了廣泛的關(guān)注。CRISPR/Cas9系統(tǒng)在制備動(dòng)物疾病模型和治療單堿基遺傳疾病的潛力成為了研究熱點(diǎn)。然而后續(xù)許多研究表明，胞嘧啶單堿基編輯器存在嚴(yán)重的DNA脫靶[14-15]，胞嘧啶單堿基編輯器和腺嘌呤單堿基編輯器還存在著大量的RNA脫靶效應(yīng)[16-17]，使單堿基編輯工具的安全性受到了質(zhì)疑，限制了單堿基編輯系統(tǒng)在動(dòng)植物中的精準(zhǔn)和多樣化突變的應(yīng)用。Zuo等[18]通過突變APOBEC1上的ssDNA結(jié)構(gòu)域相應(yīng)氨基酸，得到了顯著降低DNA脫靶的CBE突變體YE1-BE3-FNLS工具。優(yōu)化后的YE1-BE3-FNLS在保證高保真的情況下，顯著提高了基因編輯效率，從而成為既安全又高效的新單堿基基因編輯工具。Doman等[19]也報(bào)道了YE1-CBE系統(tǒng)在保持較高編輯效率的同時(shí)降低了DNA和RNA上的脫靶。

豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)俗稱藍(lán)耳病，是一種世界性傳染病，也是嚴(yán)重危害我國(guó)生豬產(chǎn)業(yè)的高度烈性傳染病，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[20]。研究表明，CD163基因是藍(lán)耳病毒侵入細(xì)胞的重要受體[21-24]，通過敲除CD163基因或功能域能有效的抵御藍(lán)耳病毒的感染[25-29]。

本研究通過YE1-BE3-FNLS系統(tǒng)對(duì)豬CD163基因進(jìn)行單堿基編輯，通過C>T，在其第七外顯子將其中一個(gè)密碼子CAA改變?yōu)榻K止密碼子TAA，可實(shí)現(xiàn)該基因翻譯的提前終止，為后續(xù)制備安全有效的CD163基因敲除豬提供了技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、菌株與質(zhì)粒

PX330載體由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部種養(yǎng)結(jié)合重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；YE1-BE3-FNLS載體由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院深圳農(nóng)業(yè)基因組研究所左二偉研究員贈(zèng)予。

1.2 主要試劑

MEGAshortscriptTMT7 Transcription Kit、mMESSAGE mMACHINETMT7 ULTRA Transcription Kit、MEGAclearTMTranscription Clean-Up Kit、TCM-199和EGF購于Thermo fisher公司；REPLI-g single cell kit購于Qiagen公司；化學(xué)試劑購于Sigma公司。DNA marker、DNA聚合酶PrimerSTAR Max Premix、購于TaKaRa公司；DNA純化回收試劑盒購于Zymo Research公司；引物合成與測(cè)序驗(yàn)證由北京擎科公司完成。

1.3 CD163基因的sgRNA設(shè)計(jì)

使用在線軟件(http://chopchop.cbu.uib.no/)設(shè)計(jì)CD163基因(XM_021091120.1)的sgRNA靶標(biāo)位點(diǎn)[30]。首先考慮Efficiency>50%的sgRNA，然后是Off-targets指標(biāo)，選取的sgRNA序列位點(diǎn)盡量沒有Off-targets所述的0、1、2、3錯(cuò)配類型；綜合Self-complementarity和GC含量篩選CD163基因的候選sgRNA序列。在候選sgRNA的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步采取以下規(guī)則：由于YE1-BE3-FNLS載體的單堿基編輯窗口較短(C5-C6)，因此設(shè)計(jì)的sgRNA的第5或第6位堿基為C，并且C5或C6后續(xù)的兩個(gè)堿基為GA、AG或AA，而且CGA、CAG、CAA與起始密碼子ATG之間的堿基數(shù)為3的整數(shù)倍。

1.4 CD163基因的sgRNA與YE1-BE3-FNLS載體的擴(kuò)增與體外轉(zhuǎn)錄

以PX330載體為模板，在設(shè)計(jì)的CD163-sgRNA的正向引物引入T7 promoter引物(加粗堿基)和sgRNA序列(下劃線堿基)，正向引物序列F:TAATACGACTCACTATAGGGAGTACAACATGG-AGACACGTGTTTTAGAGCTAGAAATAG，反向引物R: AAAAGCACCGACTCGGTGCC。以YE1-BE3-FNLS載體為模板，擴(kuò)增APOBEC-Cas9n-UGI，正向引物F: TAATACGACTCACTATAGGGGATCC;反向引物R: TCGAGGCTGATCAGCGGGTTTTTA。PCR擴(kuò)增體系：mix 10 μL，F(xiàn)引物0.5 μL，R引物0.5 μL，DNA 1 μL，ddH2O補(bǔ)至20 μL；擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性1 min；98 ℃變性10 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸25 s，33個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸1 min。

對(duì)CD163-sgRNA和APOBEC-Cas9n-UGI片段進(jìn)行回收純化，進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。CD163-sgRNA利用MEGAshortscriptTMT7 Transcription Kit進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，方法參考試劑盒說明書。APOBEC-Cas9n-UGI片段利用mMESSAGE mMACHINETMT7 ULTRA Transcription Kit進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，方法參考試劑盒說明書。轉(zhuǎn)錄后的RNA純化參考MEGAclearTMTranscription Clean-Up Kit。對(duì)體外轉(zhuǎn)錄純化后的CD163-sgRNA和APOBEC-Cas9(D10A)-UGI mRNA進(jìn)行混合，使兩者終濃度分別為50 和100 ng·μL-1。

1.5 卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)

屠宰場(chǎng)收集豬卵巢后3 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，生理鹽水充分洗滌后，注射器抽取3～6 mm卵泡，體視鏡下挑選卵丘致密、胞質(zhì)均勻的卵丘細(xì)胞-卵母細(xì)胞復(fù)合體(cumulus-oocyte complexes，COCs)。將挑選的COCs置于卵母細(xì)胞體外成熟液中(TCM-199培養(yǎng)基含10% porcine follicular fluid, 0.1% PVA, 3.05 mmol·L-1D-glucose, 0.91 mmol·L-1sodium pyruvate,0.5 IU·mL-1FSH,0.5 IU·mL-1LH, 10 ng·mL-1EGF和0.57 mmol·L-1cysteine)，在38.5 ℃，5% CO2，飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)44～48 h，培養(yǎng)結(jié)束后將COCs轉(zhuǎn)移到0.1%透明質(zhì)酸酶中脫去卵丘細(xì)胞，挑選排出第一極體、質(zhì)膜完整的MII期卵母細(xì)胞備用。

1.6 卵母細(xì)胞孤雌激活與體外注射

將上述MII期卵母細(xì)胞用激活液(0.3 mol·L-1mannitol, 0.05 mmol·L-1CaCl2, 0.1 mmol·L-1MgSO4, 0.1% BSA)充分洗滌后，置于注滿激活液的電融合槽內(nèi)，利用ECM2001融合儀施加1.2 kv·cm-1，40 us的直流電脈沖進(jìn)行孤雌激活，經(jīng)PZM3胚胎培養(yǎng)液充分洗滌后，放入含5 μg·mL-1CB的PZM3培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)3 h，再經(jīng)充分洗滌并轉(zhuǎn)入石蠟油覆蓋的PZM3中于38.5 ℃, 5% CO2，飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10～12 h后，利用Nikon NT88-V3顯微注射系統(tǒng)進(jìn)行顯微注射。

1.7 單堿基編輯驗(yàn)證與off-target分析

利用REPLI-g single cell kit提取擴(kuò)增單個(gè)胚胎的基因組DNA。在酒精燈上拉細(xì)毛細(xì)管后吸取單個(gè)胚胎置于0.2 mL離心管，加入PBS和D2 buffer，65 ℃裂解10 min，加入stop buffer，最后加入預(yù)混的master mix，30 ℃ 8 h，65 ℃3 min。結(jié)束后用TE buffer稀釋10倍。對(duì)單堿基編輯區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物為F: TCTGGTGTGCCTTTGACTCC; R: CCAGTGAGAGTTGCAGAGGG,預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物大小為865 bp。PCR擴(kuò)增體系：mix 10 μL，F(xiàn)引物0.5 μL，R引物0.5 μL，DNA 1 μL，ddH2O補(bǔ)至20 μL；擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性1 min；98 ℃變性10 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸10 s，33個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸1 min。PCR產(chǎn)物擴(kuò)增后進(jìn)行回收純化，送北京擎科公司進(jìn)行sanger測(cè)序。off-target分析所用引物見表1。

表1 Off-target分析所用引物

2 結(jié) 果

2.1 CD163基因的sgRNA序列的設(shè)計(jì)與篩選

CD163基因位于5號(hào)染色體的正義鏈，有17個(gè)外顯子。網(wǎng)站結(jié)果顯示共有423個(gè)sgRNA針對(duì)CD163基因的外顯子。在綜合分析Efficiency(>50%)、Off-targets指標(biāo)(MM0、MM1、MM2值為0)、Self-complementarity(0)和GC含量(40%～60%)后發(fā)現(xiàn)，候選CD163-sgRNA共有49個(gè)。由于YE1-BE3-FNLS載體的單堿基編輯窗口較短(C5-C6)，因此對(duì)候選sgRNA的第5或第6位堿基要求為C，并且C5或C6后續(xù)的兩個(gè)堿基為GA、AG或AA，而且CGA、CAG、CAA與起始密碼子ATG之間的堿基數(shù)為3的整數(shù)倍?？紤]到盡量在基因的前中部進(jìn)行單堿基編輯，綜合這些因素最終篩選的CD163-sgRNA序列為：AGTACAACATGGAGACACGT，PAM為GGG。此sgRNA的第5位堿基為C，其后續(xù)兩個(gè)堿基為AA，位于CD163基因的第7外顯子(num1479，圖1)。并且在CD163的mRNA序列中，CD163-sgRNA序列中的CAA與起始密碼子ATG之間堿基數(shù)為1 479，為3的整數(shù)倍。當(dāng)發(fā)生C>T突變時(shí)，密碼子發(fā)生了CAA>TAA突變，形成終止密碼子，可使CD163基因在第7外顯子處提前終止翻譯。CD163-sgRNA的特征如表2所示，符合預(yù)期要求。

表2 CD163-sgRNA序列特征

圖1 CD163-sgRNA序列的位置示意圖

2.2 CD163基因的sgRNA與APOBEC-Cas9(D10A)-UGI片段的體外擴(kuò)增

如圖2顯示，分別以PX330和YE1-BE3-NLS載體為模板，PCR擴(kuò)增的CD163-sgRNA和APOBEC-Cas9(D10A)-UGI片段大小與預(yù)期相符合。

A: M.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.CD163-sgRNA擴(kuò)增產(chǎn)物；B: M.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.APOBEC-Cas9n-UGI擴(kuò)增產(chǎn)物

2.3 豬孤雌胚胎的顯微注射

利用顯微操作儀對(duì)激活的豬孤雌胚胎進(jìn)行CD163-sgRNA和APOBEC-Cas9n-UGI mRNA的顯微注射，每個(gè)胚胎注射10～20 pL后繼續(xù)培養(yǎng)。圖3為注射后2～4細(xì)胞期的豬孤雌胚胎。

圖3 豬孤雌胚胎注射RNA混合物的2～4細(xì)胞期

2.4 單堿基編輯的效果驗(yàn)證

挑選單個(gè)發(fā)育至桑椹胚或囊胚的胚胎，利用單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增試劑盒REPLI-g single cell kit對(duì)胚胎進(jìn)行基因組DNA的提取與擴(kuò)增。經(jīng)過8 h擴(kuò)增后，單個(gè)胚胎的DNA濃度為1.7～1.8 μg·μL-1，滿足后續(xù)PCR擴(kuò)增要求。分別對(duì)對(duì)照組和注射組的胚胎DNA進(jìn)行編輯區(qū)域的PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物測(cè)序的序列分析發(fā)現(xiàn)對(duì)照組的預(yù)期位點(diǎn)為C(圖4A)，注射組的20個(gè)胚胎中有8個(gè)胚胎的DNA在預(yù)期位點(diǎn)(num 1479)出現(xiàn)C>T突變(圖4B)。而進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)有額外4個(gè)胚胎的DNA在預(yù)期位點(diǎn)中雖然序列顯示為C，但峰圖結(jié)果顯示該位點(diǎn)出現(xiàn)C與T堿基的雜峰，表明該位點(diǎn)被成功編輯(圖4C-D)。綜合分析在挑選的20個(gè)胚胎中有12個(gè)的DNA在預(yù)期位點(diǎn)出現(xiàn)C>T突變，單堿基編輯效率約60%。

2.5 CD163-sgRNA的off-target分析

由于選取的CD163-sgRNA在錯(cuò)配3個(gè)堿基的情況下能匹配到豬基因組的5個(gè)位置，利用Cas-OFFinder對(duì)這5個(gè)錯(cuò)配的位置進(jìn)行序列分析。表3顯示了這5個(gè)off-target的基因組位置，4個(gè)位于1號(hào)染色體，1個(gè)位于4號(hào)染色體，這5個(gè)off-target在基因組中相應(yīng)的錯(cuò)配位點(diǎn)分別用小寫字母表示，如表3的第3列。Off-target1在C9、C11、C15三個(gè)位點(diǎn)有錯(cuò)配；Off-target2在C13、C14、C18三個(gè)位點(diǎn)有錯(cuò)配；Off-target3在 C4、C14、C19三個(gè)位點(diǎn)有錯(cuò)配；Off-target4在C3、C11、C18三個(gè)位點(diǎn)有錯(cuò)配；Off-target5在C2、C13、C14三個(gè)位點(diǎn)有錯(cuò)配。這5個(gè)off-target區(qū)域在C5位點(diǎn)都是C，因此對(duì)這5個(gè)off-target區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測(cè)序結(jié)果的峰圖顯示選取的CD163-sgRNA在這5個(gè)off-target位置上的C5位點(diǎn)并沒有發(fā)生C>T單堿基編輯(圖5)。

圖5 對(duì)照組(A)與注射組(B)CD163-sgRNA的off-target位點(diǎn)測(cè)序分析

表3 CD163-sgRNA的off-target位點(diǎn)

3 討 論

豬是最重要的家畜動(dòng)物之一，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生物醫(yī)藥中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。單核苷酸多態(tài)性(SNPs)是豬品種和個(gè)體間遺傳變異的一種主要類型，對(duì)性狀的形成起著重要作用[31]，對(duì)重要的功能性SNP位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)期突變可加速豬的育種進(jìn)程，然而CRISPR/Cas9系統(tǒng)誘發(fā)的同源重組的損傷修復(fù)存在效率低以及細(xì)胞內(nèi)傾向于非同源重組修復(fù)[12]，因此很難實(shí)現(xiàn)高效穩(wěn)定的單堿基突變。單堿基編輯器作為新一代基因編輯工具，可為豬的精準(zhǔn)遺傳改良提供一種可行的解決方案。

YE1-BE3-FNLS作為新一代的高精度、高活性的單堿基編輯工具，可顯著降低脫靶效應(yīng)和提高編輯效率[18]，具有廣闊的應(yīng)用前景。但是該工具的編輯窗口較短C5-C6，而且胞嘧啶脫氨酶rAPOBEC1對(duì)GC motif中胞嘧啶的編輯效率不高[32]，因此在設(shè)計(jì)sgRNA的時(shí)候需要進(jìn)行大量的篩選，如果是利用sgRNA創(chuàng)造終止密碼子，很有可能篩選不到好的sgRNA。本研究中針對(duì)CD163初篩了49個(gè)參數(shù)較好的候選sgRNA，但是最終確定的CD163-sgRNA只有1個(gè)，因此與傳統(tǒng)的CRISPR/Cas9系統(tǒng)相比，單堿基編輯工具sgRNA的篩選與鑒定要顯得更為繁瑣。

由于sgRNA本身較短，長(zhǎng)度在20 bp左右，因此在基因組上容易匹配到多個(gè)位置，從而造成脫靶效應(yīng)[33]。本研究選取的sgRNA序列位點(diǎn)的off-targets所述的0、1、2、3錯(cuò)配類型為(0,0,0,5)，而0、1、2、3分別代表在基因組上錯(cuò)配0～3個(gè)堿基數(shù)量的sgRNA個(gè)數(shù)，本研究中的CD163-sgRNA在錯(cuò)配0、1和2個(gè)堿基情況下沒有off-target，而在錯(cuò)配3個(gè)堿基下的5個(gè)off-target位點(diǎn)都沒有發(fā)生堿基突變，因此表明該CD163-sgRNA在基因組上高度特異。

研究表明，CD163基因不僅可作為PRRSV的受體，還參與清除血漿中的血紅蛋白等生物過程[34]。因此，CD163基因功能的喪失可能存在未知的風(fēng)險(xiǎn)。然而有研究表明與野生型相比，CD163基因敲除豬在經(jīng)濟(jì)性狀(例如產(chǎn)肉與繁殖性狀以及免疫性狀例如巨噬細(xì)胞作為血紅蛋白-結(jié)合珠蛋白清除劑)的表型都沒有發(fā)生顯著變化[27,35]，因而CD163敲除豬的安全性還需要進(jìn)一步持續(xù)研究。

目前，已有多個(gè)團(tuán)隊(duì)利用CRISPR/Cas9技術(shù)制備了CD163 敲除豬，其方式是通過CRISPR/Cas9介導(dǎo)的同源重組(HDR)或DNA片段刪除[25-26]，這兩種方式的效率較低，而且對(duì)于DNA片段刪除需要借助2條sgRNA，額外增加了可能的脫靶性。而且DNA片段刪除的方式也容易額外插入堿基序列，不易獲得純合的CD163敲除豬[26]。

姚旭東等[36]利用單堿基編輯系統(tǒng)對(duì)羊MSTN基因進(jìn)行了精準(zhǔn)編輯，表明單堿基編輯系統(tǒng)具有較好的特異性。本研究中的單堿基編輯效率較高，達(dá)到了60%，而且造成的堿基突變類型單一，容易得到純合突變，為后續(xù)精準(zhǔn)制備CD163基因敲除豬提供了技術(shù)支撐。

4 結(jié) 論

本研究利用YE1-BE3-FNLS工具在胚胎水平上對(duì)豬的CD163基因進(jìn)行了單堿基編輯，成功使得該基因第7外顯子預(yù)期位點(diǎn)(num1479)C突變?yōu)門，從而使得密碼子CAA突變?yōu)門AA，可提前終止CD163基因的翻譯。