結(jié)直腸癌免疫治療的多模態(tài)影像及分子影像評估

張琳焓，姜慧杰，付鵬，張榮軍

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是常見的惡性腫瘤。免疫治療是繼手術(shù)、化學(xué)療法和放射療法之后的主要治療手段。該治療手段是通過自身的免疫系統(tǒng)來對抗癌細胞，克服了藥物對正常細胞非特異性攻擊和細胞毒性，具有廣闊的前景。本文對當(dāng)前結(jié)直腸診療中的影像應(yīng)用和進展進行概述。

免疫治療后形態(tài)學(xué)變化及免疫相關(guān)不良事件的傳統(tǒng)影像評估

免疫治療過程中常常引起假進展或分離現(xiàn)象，而常規(guī)實體瘤療效評價標準(response evaluation criteria in solid tumors,RECIST)對于這些非典型病變未作出描述。因此，研究者制訂了一些評價免疫治療效果的標準，包括免疫相關(guān)反應(yīng)標準(immune-related response criteria,irRC)、免疫相關(guān)RECIST(irRECIST)和免疫RECIST(iRECIST)[1]。這些標準的實施主要依靠傳統(tǒng)影像技術(shù)。傳統(tǒng)影像學(xué)可以提供CRC的形態(tài)、體積、信號/密度等信息，不但可以直觀監(jiān)測免疫治療的效果，而且可以早期發(fā)現(xiàn)免疫治療引起的各種免疫相關(guān)不良事件。由于免疫相關(guān)不良事件的影像學(xué)表現(xiàn)并無特異性，因此放射科醫(yī)師需要結(jié)合患者的臨床信息等來進行診斷。

CRC微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的放射組學(xué)及人工智能預(yù)測

盡管免疫療法極大地改變了許多晚期癌癥患者的治療前景，但迄今為止，CRC免疫治療的益處僅限于微衛(wèi)星灶高度不穩(wěn)定性/DNA錯配修復(fù)缺陷(microsatellite instability high/deficient mismatch repair,MSI-H/dMMR)的CRC患者。2017年更新的《美國國家綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)臨床實踐指南》指出，盡管氟尿嘧啶化療對MSI的結(jié)直腸癌患者無效，但是受益于抗程序性細胞死亡蛋白-1(programmed death-1,PD-1)及其配體(programmed cell death ligand 1,PD-L1)和抗細胞毒性T淋巴細胞相關(guān)抗原4(cytotoxic T lymphocyte associated protein 4，CTLA-4)等免疫治療[2-3]，因此了解MSI狀態(tài)對于CRC患者治療策略的選擇具有重要意義。目前臨床上，MSI的確定是通過聚合酶鏈反應(yīng)或免疫組織化學(xué)檢測來實現(xiàn)的。然而，這2種檢測方法均為有創(chuàng)性、價格昂貴且只能在三級醫(yī)療機構(gòu)使用，使其不能廣泛應(yīng)用于MSI狀態(tài)的臨床評估。因此，探索一種非侵入性的方法來評估CRC患者的MSI是非常必要的。

研究表明MSI腫瘤比微衛(wèi)星穩(wěn)定性(microsatellite stability，MSS)腫瘤具有更強的血管生成能力[4]。兩者血管生成的差異可以通過雙能CT掃描的碘圖和放射組學(xué)分析來證實。Wu等[5]研究發(fā)現(xiàn)MSI患者標準化碘濃度、能譜曲線斜率及有效原子序數(shù)均顯著低于MSS，多個參數(shù)的聯(lián)合對CRC-MSI與CRC-MSS的鑒別具有更高的診斷符合率。放射組學(xué)是通過對CT、MRI等圖像上的感興趣區(qū)進行分割和特征提取，獲得大量高通量信息來建立診斷模型(圖1)，對疾病的診斷和預(yù)后判定等具有重要價值。在與Wu等[5]同一機構(gòu)的另一項研究中，發(fā)現(xiàn)碘圖像上提取的放射組學(xué)特征對預(yù)測CRC患者MSI狀態(tài)更有價值[6]。Golia Pernicka等[7]發(fā)現(xiàn)在治療前基于門靜脈期CT圖像的放射組學(xué)分析也可以識別結(jié)腸癌的MSI狀態(tài)。與僅使用臨床數(shù)據(jù)或放射組學(xué)特征開發(fā)的模型相比，基于臨床和放射組學(xué)特征的預(yù)測模型具有更好的預(yù)測性能。此外，基于MRI的放射組學(xué)也有新的發(fā)現(xiàn)。Zhang等[8]發(fā)現(xiàn)治療前MR T2WI的組學(xué)特征與直腸癌的MSI狀態(tài)具有顯著相關(guān)性。臨床因素和MRI放射組學(xué)特征的組合分析可提高預(yù)測性能，并有助于個性化治療方案的選擇。人工智能的進步推動了機器學(xué)習(xí)和深度學(xué)習(xí)在放射學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用和發(fā)展。Zhang等[9]基于MR T2WI聯(lián)合臨床因素首次建立預(yù)測MSI的深度學(xué)習(xí)模型，具有較高的預(yù)測能力。目前，大多數(shù)區(qū)分CRC-MSI狀態(tài)的研究都是基于單個中心的有限患者量的研究，尚需要更大樣本量的多中心研究來進一步證實，以促進這種技術(shù)能夠在日常臨床實踐中實施。近期Cao等[10]通過增強CT放射組學(xué)多中心研究對結(jié)直腸MSI進行預(yù)測，與動脈期或靜脈期模型相比，延遲期模型顯示出優(yōu)越的預(yù)測性能。同時，年齡、位置和癌胚抗原也是預(yù)測MSI 狀態(tài)的風(fēng)險因子。另外，結(jié)合臨床風(fēng)險因素和放射組學(xué)參數(shù)建立的臨床放射組學(xué)列線圖也顯示出優(yōu)異的性能，在訓(xùn)練集和驗證集中均具有較高的敏感度和符合率?？傊?，上述研究表明，從影像圖像得出的某些參數(shù)或與臨床信息組合的多參數(shù)模型可以作為鑒別CRC-MSI和CRC-MSS的標志物，但是由于放射組學(xué)特征的可靠性和臨床價值高度依賴于特征的選擇、提取平臺和使用的軟件版本，所以尚不能完全取代病理學(xué)分析，需要進行更多的研究來進一步驗證。

圖1 放射組學(xué)模型預(yù)測CRC微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的流程圖。

免疫微環(huán)境的分子影像學(xué)監(jiān)測及免疫治療效果的評估

癌癥成像正從純粹的腫瘤解剖學(xué)評估轉(zhuǎn)向?qū)δ[瘤表型和異質(zhì)性的整體評估[11]。分子影像學(xué)是在細胞和分子水平上評估體內(nèi)生理過程的成像技術(shù)，這些技術(shù)能夠無創(chuàng)性檢測與免疫反應(yīng)(如PD-1和PD-L1等)或某些免疫細胞群相關(guān)的特定標志物，以及評估與其激活和作用相關(guān)的生理和分子變化。

1.監(jiān)測腫瘤PD-L1的表達水平

腫瘤細胞表達的PD-L1是預(yù)測抗PD-1/PD-L1免疫治療反應(yīng)的潛在生物標志物[12]。免疫組化作為此生物標志物的主要檢測方法，一方面存在侵入性強、樣本采集困難及陽性標準不一致等諸多缺點[13-14]；另一方面，PD-L1表達水平是動態(tài)和異質(zhì)的[15-16]，單個時間點的活檢在整個治療方案中提供的信息有限。因此，需要一種無創(chuàng)且準確的檢測方法。近年來已有較多臨床前研究證實光學(xué)成像、PET、SPECT及MRI可以提供所有病變中PD-L1表達的實時數(shù)據(jù)，在檢測 PD-1/PD-L1方面具有重要優(yōu)勢。

光學(xué)成像是通過熒光蛋白和染料來研究分子、細胞和組織水平生理變化的方法。Zhang等[17]開發(fā)了一種靶向PD-L1的近紅外(near infrared,NIR)光學(xué)探針，可在不同的人結(jié)直腸裸鼠皮下瘤模型中檢測 PD-L1的表達水平，體內(nèi)的熒光信號強度與體外流式細胞術(shù)和蛋白質(zhì)印跡分析結(jié)果一致。近紅外Ⅱ區(qū)(NIR-Ⅱ)的熒光成像具有低組織散射、最小自發(fā)熒光、高對比度和深層組織穿透等優(yōu)點而受到越來越多的關(guān)注[18]。Wan等[19]采用PD-L1單克隆抗體和具有快速腎臟排泄功能的NIR-Ⅱ分子熒光團來組成探針，用于免疫檢查點PD-L1的分子成像。此探針增強了分子成像性能，是研究免疫治療機制的有力工具。核素切倫科夫光學(xué)成像是近幾年發(fā)展起來的新興的分子影像學(xué)方法。目前，已有較多學(xué)者對核素切倫科夫分子探針在體內(nèi)代謝檢測方面的作用進行了研究，這種探針已經(jīng)成為重要的分子影像研究工具[20]。Zhao等[21]使用131I標記抗PD-L1單克隆抗體，并在不同的CRC異種移植小鼠模型中通過無創(chuàng)的切倫科夫光學(xué)成像監(jiān)測腫瘤中PD-L1表達水平(圖2)。

圖2 切倫科夫光學(xué)成像檢測PD-L1表達水平。在SW620、LS174T和RKO裸鼠皮下模型中，腫瘤-背景熒光強度比隨時間的增加而逐漸增加，在120h達到最大值，120h的圖像直觀清晰地顯示PD-L1表達水平，且呈現(xiàn)RKO>LS1747>SW620[21]。

PET及SPECT影像具有良好的組織分辨率，同時不受受試者體位的限制，已被廣泛應(yīng)用于腫瘤PD-L1表達水平的動態(tài)監(jiān)測。由于抗體從血流和正常組織中被清除的過程較緩慢，在動態(tài)成像中依賴于抗體的探針面臨著挑戰(zhàn)。與完整抗體相比，納米抗體具有更好的組織滲透性和更快的代謝速度。Gao等[22]開發(fā)了靶向PD-L1的納米抗體探針——99mTc-MY1523，可以實時、定量和動態(tài)地檢測CRC荷瘤小鼠體內(nèi) PD-L1 表達水平，通過SPECT-CT成像指導(dǎo)可以增強PD-L1阻斷免疫療法的治療效果。Nb109是一種對PD-L1具有高選擇性、高親和力的非阻斷納米抗體，Qin等[23]利用68Ga對其進行放射性標記，在不同PD-L1表達水平的MC38荷瘤小鼠中評估了新型免疫檢查點抑制劑的治療效果，該藥成功抑制了PD-L1顯像陽性的腫瘤。上述研究結(jié)果表明，分子影像學(xué)具有篩選對免疫療法產(chǎn)生反應(yīng)的受試者的巨大潛力。此外，利用核素標記單克隆抗體的分子影像學(xué)可以為CRC荷瘤小鼠放射免疫治療篩選合適的抗體。最近Ren等[24]將不同的抗PD-L1單克隆抗體與89Zr偶聯(lián)用于免疫PET成像，篩選出一種高度腫瘤選擇性的抗PD-L1抗體，然后將此抗體與177Lu進行放射性標記，用于靶向PD-L1放射免疫治療和放射協(xié)同免疫治療。

由于每種成像方式具有特定的優(yōu)點和局限性，因此聯(lián)合顯像可以揚長避短。Du等[25]基于雙模態(tài)方法(MRI和熒光成像)成功開發(fā)了一種新型診斷及治療性的納米探針——PD-L1-PCI-Gd，此探針不但可以區(qū)分4T1和CT26腫瘤中PD-L1的表達水平，還可以對C26荷瘤小鼠進行靶向化療?？傊?，分子影像學(xué)可以無創(chuàng)性動態(tài)監(jiān)測PD-L1的表達水平，對預(yù)測免疫治療反應(yīng)具有良好的應(yīng)用前景。

2.監(jiān)測腫瘤免疫微環(huán)境變化

腫瘤的發(fā)展、生長、轉(zhuǎn)移及擴散受各種免疫細胞的影響，這些免疫細胞被招募到腫瘤部位建立了特定的腫瘤免疫微環(huán)境。通過分子影像學(xué)標記各種免疫細胞(包括T細胞、巨噬細胞、中性粒細胞、樹突細胞、髓樣來源抑制細胞等)可以追蹤腫瘤的位置[26-29]，但是除了T細胞外，其它免疫細胞在評估免疫治療效果方面的作用有限。

T淋巴細胞是抗腫瘤免疫反應(yīng)最有效的介質(zhì)。靶向T細胞成像主要包括腫瘤浸潤T細胞(tumor infiltrating lymphocytes,TIL)和活化細胞毒性T細胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)成像，目前已成為研究熱點。在免疫治療過程中，盡管一些患者具有顯著的臨床療效，但僅少數(shù)患者達到了持久的臨床反應(yīng)。免疫檢測點抑制劑治療失敗歸因于不吸引TIL的低免疫原性腫瘤。因此，在免疫治療過程中監(jiān)測TIL的能力可能有助于及早確定治療效果，從而推動了CD3+、CD4+和CD8+細胞探針的開發(fā)。Larimer[30]開發(fā)了靶向CD3+的PET探針，在結(jié)腸癌異種移植模型中對抗CTLA-4免疫治療的TIL進行量化，同時發(fā)現(xiàn)TIL顯像先于腫瘤的消退。Kristensen等[31]開發(fā)了64Cu-NOTA-CD8a探針，可以在CT26荷瘤小鼠腫瘤體積變化之前成功區(qū)分免疫檢查點抑制劑治療的反應(yīng)者與無反應(yīng)者，在CRC臨床前研究模型中可作為監(jiān)測免疫治療反應(yīng)的生物標志物。

目前大多數(shù)的研究都是基于免疫治療后TIL變化水平來預(yù)測免疫治療的效果，但是尚不確定免疫治療前T細胞特異性成像和免疫表型的預(yù)測價值。Kristensen等[32]開發(fā)了89Zr-DFO-CD4和89Zr-DFO-CD8a探針，在免疫檢查點抑制治療之前對多種同基因小鼠進行TIL體內(nèi)檢測和量化，發(fā)現(xiàn)模型間療效的差異與免疫狀態(tài)有關(guān)，在CD4+和CD8a+探針攝取較高的模型中(SA1N、4T1、CT26和MC38)腫瘤生長顯著減慢，而攝取較低的模型(B16F10和P815)對治療沒有反應(yīng)。

另外，腫瘤微環(huán)境中活化CTL成像可能對預(yù)測癌癥免疫療法的反應(yīng)更有價值。18F-AraG是一種活化CLT的PET顯像劑[33]，在MC38結(jié)直腸癌荷瘤小鼠模型中，Levi等[34]將其用于評估免疫檢查點抑制劑的治療效果，在治療48小時后成功區(qū)分了反應(yīng)者和無反應(yīng)者；同時還發(fā)現(xiàn)腫瘤引流淋巴結(jié)中的信號，為抗PD-1治療反應(yīng)提供了關(guān)鍵信息。顆粒酶B是一種由活化CTL釋放的絲氨酸蛋白酶，是導(dǎo)致腫瘤細胞凋亡的誘導(dǎo)蛋白之一[35]。免疫檢查點阻斷治療可導(dǎo)致顆粒酶B的表達增高，因此它是一種可靠的免疫治療早期反應(yīng)生物標志物。Larimer等[36,37]開發(fā)了靶向顆粒酶的PET顯像劑，并且能在CRC荷瘤小鼠腫瘤體積出現(xiàn)差異之前，非常準確地區(qū)分了免疫治療后的反應(yīng)者和無反應(yīng)者。與18F-FDG、18F-FEPPA、18F-FB-IL2相比，靶向顆粒酶B的PET顯像在免疫治療中具有較高的預(yù)測能力[38]。此外，監(jiān)測免疫狀態(tài)的動態(tài)和空間變化可以尋求免疫治療的最優(yōu)時間。Nguyen等[39]設(shè)計了一種顆粒酶B納米報告基因，它可以將免疫檢查點抑制劑傳遞到腫瘤并跟蹤顆粒酶的活性，作為監(jiān)測免疫反應(yīng)啟動的直接方法?？傊?，對T細胞的可視化研究可以早期監(jiān)測免疫治療效果，已經(jīng)成為發(fā)展免疫療法的重要工具。

3.檢測細胞凋亡

腫瘤免疫治療的好轉(zhuǎn)必然伴隨大量的細胞凋亡，而凋亡的發(fā)生可能提前于腫瘤解剖的大小改變，因此可以用來預(yù)測早期治療反應(yīng)。細胞凋亡PET成像可以無創(chuàng)性檢測體內(nèi)細胞死亡，可以幫助臨床醫(yī)師及時評估腫瘤對治療的反應(yīng)，從而選擇最有效的治療方法。作為細胞凋亡早期的關(guān)鍵介質(zhì)，caspase-3是細胞凋亡成像的重要分子靶點。近期Chen等[40]開發(fā)了一種新型改進的caspase3特異性PET示蹤劑——18F-C-SNAT4，研究者發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸癌皮下荷瘤小鼠模型中，接受化療和免疫治療的小鼠腫瘤示蹤劑的攝取與腫瘤凋亡水平及治療效果呈正相關(guān)。18F-C-SNAT4 PET成像可以監(jiān)測腫瘤對兩種不同治療方式的反應(yīng)，并預(yù)測早期治療效果。

結(jié)果及展望

運用多模態(tài)影像技術(shù)來確定腫瘤免疫表型，預(yù)測免疫治療的反應(yīng)和評估免疫相關(guān)不良事件仍然是一項具有挑戰(zhàn)性的工作。傳統(tǒng)影像技術(shù)具有明顯的局限性，放射組學(xué)及AI的進步將影像特征及數(shù)據(jù)處理相結(jié)合，為免疫治療早期預(yù)測開辟了新的可能性。分子成像技術(shù)的發(fā)展為免疫治療提供更準確和具體的信息。

目前CRC免疫診療研究多為臨床前研究，通過探針標記技術(shù)可以對復(fù)雜繁瑣的免疫過程可視化，無創(chuàng)性評估早期治療效果，為臨床提供了堅實的基礎(chǔ)。雖然與其它腫瘤免疫治療相比，結(jié)直腸腫瘤的免疫治療舉步維艱，但是針對MSI-H/dMMR患者的抗 PD-1療法取得突破，使我們已經(jīng)開始看到免疫療法的潛力。隨著對免疫系統(tǒng)了解的不斷加深以及醫(yī)學(xué)影像學(xué)新技術(shù)的助力，我們相信無論微衛(wèi)星不穩(wěn)定性/錯配修復(fù)狀態(tài)如何，CRC免疫治療均將發(fā)揮巨大作用，具有廣闊的前景。