抗菌肽在骨感染治療中的研究進展

王淦 張妍 崔宇韜 劉賀 田宇航 李少榮 范誼 吳丹凱 彭傳剛

0 引言

創(chuàng)傷或無菌操作不當會使細菌侵入骨組織引起骨髓炎，后續(xù)還可能形成更難處理的細菌生物膜。在治療骨感染時，首選的抗生素對生物膜并不能有效解決，且傳統(tǒng)抗生素長期使用時難免遇到細菌耐藥性和對機體的潛在肝、腎毒性問題。因此解決耐藥菌感染，開辟新的抗菌策略勢在必行[1]。

抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPs)是一種小分子多肽，分子量一般不超過50個氨基酸，平均疏水性殘基含量為42%，具有良好的熱穩(wěn)定性[2]。所有的AMPs都具有線狀或環(huán)狀結(jié)構(gòu)，它的基礎結(jié)構(gòu)具有兩親性，帶有陽離子正電荷。線性結(jié)構(gòu)體現(xiàn)為α螺旋，環(huán)狀結(jié)構(gòu)是由一個或者多個二硫鍵形成的β折疊所組成[3]。AMPs能夠破壞細菌細胞膜、激活免疫因子和調(diào)節(jié)機體免疫反應[4]，大多數(shù)通過非特異性免疫途徑對抗病原體，這種抗菌機制是其有效對抗耐藥菌，且不易產(chǎn)生細菌耐藥性的原因之一。AMPs還可以通過中和主要包括內(nèi)毒素脂多糖和脂磷壁酸的病原體相關分子來預防強烈的炎癥反應[5]。AMPs的研究較為熱門，其用途也十分廣泛。此外，不斷更新的研究證據(jù)表明，AMPs也可以通過特異性免疫途徑表現(xiàn)出抗菌性[6]。因此，AMPs為克服抗生素副作用及耐藥菌的治療提供了備選方案[7]。

與大多數(shù)藥物一樣，AMPs的劑量、持續(xù)時間、給藥途徑、配方、靶組織和宿主微生物區(qū)系決定了AMPs的有效性。感染性骨缺損時，骨組織因大段骨缺損和細菌活動的原因，修復能力嚴重下降。因此研究者使用了具有穩(wěn)定性和生物相容性的可搭載AMPs骨組織工程生物材料。這些生物材料的優(yōu)勢在于能將藥物可控和可持續(xù)地釋放至靶點，從而充分發(fā)揮AMPs強大的抗菌療效[8-9]。

課題組將在簡述AMPs結(jié)構(gòu)分類及對抗細菌機制的基礎上介紹藥物遞送載體搭載AMPs應用于骨感染治療的研究情況，以期為未來研究和臨床應用指明方向。

1 AMPs的結(jié)構(gòu)分類和抗菌機制

1.1 AMPs的結(jié)構(gòu)分類

根據(jù)AMPs的結(jié)構(gòu)特點可以被分為3類。第1種亞類α螺旋肽源于兩棲類的細胞外基質(zhì)，是陽離子小分子蛋白，其酰胺化的碳末端會增強AMPs對細菌膜的正負電荷吸引作用，對細菌的抑制具有重要意義[10]。研究較多的蛙皮素2是從非洲爪蟾的皮膚中分離出的一種α螺旋肽，能通過與細菌膜中豐富的陰離子磷脂相互作用而發(fā)揮抑菌性[11]。機體內(nèi)源性抗菌肽家族的LL-37，是來源于人類重要的宿主防御肽，主要存在于中性粒細胞中[12]，是由hCAP18前體蛋白的碳端通過蛋白水解剪切生成的線性多肽，帶有正電荷，含有豐富的疏水性氨基酸，呈堿性，若不在水溶液環(huán)境下會折疊成兩親性的α螺旋結(jié)構(gòu)，它們具有殺死微生物，趨化性和趨化因子誘導，調(diào)節(jié)炎癥反應以及促進血管生成和傷口愈合的作用[13]。

第2種亞類β折疊由二硫鍵形成，具有環(huán)狀反平行的β-折疊結(jié)構(gòu)，通過兩個雙鍵結(jié)合在一起，發(fā)現(xiàn)于吞噬細胞和上皮組織。脫離水環(huán)境時，半胱氨酸殘基可使它保持穩(wěn)定結(jié)構(gòu)[14]。能通過陽離子的L-精氨酸與細菌膜表面的陰離子脂質(zhì)靜電作用，以形成膜孔通道的方式破壞細菌。防御素家族是這種結(jié)構(gòu)的重要組成部分。依據(jù)基因和蛋白質(zhì)水平上的結(jié)構(gòu)特點將其分類，已于脊椎動物中鑒定出3個防御素：α-防御素、β-防御素和θ-防御素。其中β防御素有4種：人β防御素-1和人β防御素-2表達于上皮組織，它們主要對革蘭氏陰性菌產(chǎn)生抗菌活性；而同樣表達于上皮組織的人β防御素-3和在睪丸與胃竇發(fā)現(xiàn)的人β防御素-4對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均具有抗菌性[15]。這種AMPs還可以促進單核-巨噬細胞的化學吸收，刺激免疫細胞產(chǎn)生細胞因子，刺激血管形成，并且對激素也可產(chǎn)生反應[16]。

第3種AMPs具有獨特的線圈樣延伸或延展結(jié)構(gòu)，大多數(shù)源于機體內(nèi)源性抗菌肽家族，由兩個及以上的脯氨酸殘基酰胺化構(gòu)成。其中indolicidin(由13個氨基酸組成的小分子多肽)具有豐富的色氨酸，從牛嗜中性粒細胞中分離得到，僅含有13個氨基酸。磁共振色譜表明indolicidin在存在膠束的情況下會形成獨特的“膜相關肽結(jié)構(gòu)”，即為明確的延展結(jié)構(gòu)[17]。Falcao等[18]發(fā)現(xiàn)苦豆素的碳末端殘基可對革蘭陰性菌產(chǎn)生抗菌活性及抗腫瘤活性。

1.2 AMPs的抗菌機制

1.2.1 AMPs對細菌細胞膜的作用

大多數(shù)致病細菌的細胞膜常因磷脂羥基化，使膜表面呈現(xiàn)負電性，吸引了陽離子抗菌肽，而大多數(shù)帶負電荷的真核生物細胞膜脂質(zhì)頭基團都面向膜內(nèi)側(cè)。另外，真核生物細胞膜中的固醇分子通常呈電中性還會增加膜的剛性，從而減少了AMPs的插入。但AMPs對真核細胞的細胞毒作用呈劑量依賴性,高濃度也可能引起真核細胞細胞膜破裂或其他細胞毒性作用[19]。

人們提出了多種模型來描述抗菌肽抗菌機制，如桶狀模型、地毯模型、分子電穿孔模型、界面活性模型。AMPs在達到一定的閾值濃度后，會發(fā)生聚集，它們最多見的跨膜機制是AMPs滲透帶有負電荷的細菌細胞膜。在膜表面形成孔導致膜破裂或使胞內(nèi)物質(zhì)流出，隨即細菌被破壞并死亡[20]。在桶壁模型中，AMPs以α-螺旋結(jié)構(gòu)結(jié)合到膜上，在膜表面以低密度結(jié)合狀態(tài)互相識別，AMPs單體聚集相互作用并跨膜，垂直插入膜的疏水區(qū)域中，其疏水域與脂質(zhì)雙層對齊，這樣，它們形成了一個類似于離子通道樣的管腔，肽的親水部分排列在管腔中，膜脂雙層的親水和疏水結(jié)構(gòu)排列對應平齊[21]。在環(huán)形孔模型中，AMPs的親水部分與膜外層脂質(zhì)親水側(cè)相互作用，并誘導脂質(zhì)單層連續(xù)彎曲，這時抗菌肽插入脂質(zhì)頭偏側(cè)，然后彎曲形成直徑1～2 nm的環(huán)形孔。環(huán)形孔模型也稱為蟲洞模型。和桶狀結(jié)構(gòu)相比，環(huán)形孔模型使得被影響的膜脂雙層親水和疏水區(qū)域不再平齊[21]。在分子電穿孔模型中， AMPs與細菌膜的靜電吸引及AMPs本身的親水和疏水性促進了跨膜的電勢差，會在膜上形成一個孔，隨即引起細菌內(nèi)外離子自由交換，破壞膜電位，使細菌細胞膜和細胞器膜通透性加強并造成胞內(nèi)離子平衡紊亂和細胞質(zhì)成分的泄露[3]。對于地毯模型，AMPs所要求的閾濃度較高，它們會聚集貼附在膜脂質(zhì)頭基團表面，并與脂質(zhì)層平行，就像平鋪在地板上的地毯，分子旋轉(zhuǎn)導致疏水殘基重新定向于膜的疏水核心，改變脂雙層膜曲率使膜崩解，而后AMPs將整齊的膜結(jié)構(gòu)腐蝕分解，包裹著被破壞的膜磷脂碎片離開膜，它們并沒有形成膜孔或者通道樣結(jié)構(gòu)[22]。近年來提出的界面活性模型，認為在膜雙分子層之間的碳氫化合物類似于有機烴，由脂質(zhì)極性基團、水、烴化合物和緩沖離子構(gòu)成，可對極性或帶有電荷的溶質(zhì)產(chǎn)生不可通過的屏障。Wiener等[23]把此區(qū)域稱為“化學混亂異質(zhì)性區(qū)域”，即界面區(qū)，每個區(qū)域厚度為10～15 ?(10 ?=1 nm)。而AMPs以理化驅(qū)動力的作用使雙分子層變形，并對烴核區(qū)域進行破壞，它的親水基團與脂質(zhì)頭部分混合，但是這種被稱為界面活性肽的AMPs有由芳香族殘基為主的疏水性片段，不足以跨過膜雙層，主要是與界面區(qū)結(jié)合。與其他模型相比，界面活性肽不需要閾濃度下的自組裝。低濃度肽也可使脂雙層變形移位，較高濃度使瞬時肽、脂質(zhì)、極性溶質(zhì)跨膜滲透加強。

1.2.2 AMPs對細菌細胞壁的作用

細菌脂多糖可分為特異多糖(O抗原)、核心多糖和脂質(zhì)A 3個特異區(qū)， O抗原和核心多糖組成了多糖鏈并從膜表面向外環(huán)境突出。脂多糖的主要成分為脂質(zhì)A，是膜脂雙層的外層結(jié)構(gòu)，由長鏈脂肪酸和磷酸基團連接到碳水化合物骨架上[14]。 脂質(zhì)A分子帶負電荷，外膜結(jié)構(gòu)由二價陽離子結(jié)合在一起[24]，已有驗證脂質(zhì)A的二磷?；糠趾虯MPs靜電結(jié)合具有重要作用[14]。另外AMPs可導致脂多糖發(fā)生結(jié)構(gòu)紊亂[25]。

像革蘭陽性菌，磷壁酸帶負電的磷酸基團把氫質(zhì)子束縛在細胞壁中，形成酸性環(huán)境，此時自溶素活性保持較低水平，而陽離子的AMPs可以和磷壁酸的磷酸基團發(fā)生強烈的靜電作用，釋放質(zhì)子，隨即局部pH升高，使自溶素激活，溶解糖苷鍵和肽結(jié)合鏈，從而破壞細胞壁。相對于陰性菌，陽性菌表面帶有較少的負電荷，且肽聚糖層較厚，像防御素類的AMPs，在革蘭陽性菌表面形成孔通道需要更多時間，因此防御素類AMPs對陽性菌的活性較弱[26]。

2 AMPs在骨感染治療中的研究和應用

共價固定化AMPs對酶的穩(wěn)定性差，對組織周圍未接觸的細菌活性低，給藥途徑會顯著影響AMPs的療效，因此，AMPs的局部給藥更受歡迎。由于AMPs直接暴露在體液中易被酶降解，這時AMPs需使用藥物載體遞送至靶點免于分解，有了載體保護，AMPs的抗菌活性更強，同時顯示出它的細胞毒性比直接給藥更低[27]。針對骨感染的治療，目前搭載AMPs的藥物遞送載體主要有以下幾種。

2.1 骨水泥搭載AMPs治療骨感染的研究現(xiàn)狀

骨科常見的基礎材料骨水泥是聚甲基丙烯酸甲酯，可以自由聚合填充在缺損部位與植入物的間隙中，能有效固定患肢。其可用做AMPs的載體，在粉末狀態(tài)下即可與AMPs混合[28]。Gatin等[29]將多粘菌素與局部骨水泥結(jié)合并聯(lián)合系統(tǒng)性抗生素使用，能十分有效地對抗腸桿菌科的耐碳青霉烯酶菌引起的關節(jié)假體感染。Faber等[30]做了兔的慢性耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(對慶大霉素敏感)骨髓炎的模型，他們將源于人乳鐵蛋白片段的抗菌肽人乳鐵蛋白1-11與磷酸鈣骨水泥粉末混合注射入清創(chuàng)后的兔脛骨腔中，使其形成局部藥物遞送系統(tǒng)。與對照組相比，人乳鐵蛋白1-11在影像學、微生物學和組織學方面的臨床結(jié)果大大改善，可能的機制是高濃度的AMPs對細菌的直接殺傷作用以及免疫刺激。盡管骨水泥可以顯示出作為載體的前景，但由于其無法在體內(nèi)降解，易碎裂產(chǎn)生碎片而在局部產(chǎn)生多余炎癥，且去除需要額外的手術(shù)，因此人們將目光放在了可降解生物材料上，以更加貼合臨床需要[31]。

2.2 鈦合金搭載AMPs治療骨感染的研究現(xiàn)狀

鈦合金載體的機械強度、耐腐蝕性和生物相容性良好，與周圍組織可以密切融合，是骨外科常見的骨缺損植入物。然而植入物表面細菌生物膜的黏附及抗生素耐藥菌的產(chǎn)生很難祛除，使其有效性能下降。為了對抗細菌生物膜的形成，研究者設計了在局部鈦假體上使用抗生素涂層，然而高水平的抗生素濃度會對周圍組織產(chǎn)生細胞毒性還會導致耐藥菌的產(chǎn)生。為了避免這種情況，已有研究將AMPs涂層與鈦假體枝接聯(lián)合使用，Trzcińska等[32]設計并合成了源自人內(nèi)源性抗菌肽LL-37的抗菌肽KR-12類似物，將聚多巴胺底物偶聯(lián)涂層到鈦Ti6Al4V表面，并將設計的抗菌肽KR-12類似物與聚多巴胺共價結(jié)合。體外實驗中，產(chǎn)物可對大腸桿菌、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌產(chǎn)生抗菌活性，人骨肉瘤細胞在該材料具有良好的黏附性和增殖性。Chen等[33]設計了幾種鈦合金接多肽的植入物系統(tǒng)，固定有多巴胺表面修飾的二氧化鈦納米管的鈦植入物盒，裝有抗菌肽HHC36，并以分子門聚甲基丙烯酸修飾封閉，以實現(xiàn)AMPs的持續(xù)和按需釋放。細菌感染時會產(chǎn)生像乳酸和乙酸的酸性底物，當pH值降低以模擬感染條件時，分子門崩塌，打開納米管，從而釋放出足夠數(shù)量的肽，最終殺死細菌；之后又通過硼氫化鈉催化的疊氮炔環(huán)加成反應固定含有HHC36抗菌序列和QK血管生成序列的融合肽與鈦合金結(jié)合。這種鈦植入物具有“靜態(tài)多功能”，在沒有任何外界刺激的情況下能同時表現(xiàn)出生物相容性、體外成骨活性和血管生成活性。另外在兔脛骨骨髓炎模型體內(nèi)實驗中表明，該系統(tǒng)在植入后的急性感染期內(nèi)抑制了細菌感染，并表現(xiàn)出良好的生物相容性，證明了鈦合金假體與抗菌肽的結(jié)合較為優(yōu)秀地克服了抗生素耐藥和載體機械強度問題，在骨與關節(jié)感染的應用中具有廣闊的前景。

2.3 水凝膠搭載AMPs治療骨感染的研究現(xiàn)狀

水凝膠材料擁有三維聚合物網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)，是如今較為常用的細胞外基質(zhì)替代物。作為支架材料，可模仿天然組織微環(huán)境的結(jié)構(gòu)，生物相容性良好，對人類紅細胞很少有溶血作用，并可通過3D打印來調(diào)節(jié)匹配所需要的空間孔隙大小和形狀[25]。它的多孔網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)促進了營養(yǎng)物質(zhì)交換并引導細胞黏附，精巧的設計可受控地釋放載體AMPs，有利于損傷的骨組織愈合，減少炎癥反應，控制感染[34]。Pal等[35]驗證了非交聯(lián)的彈性蛋白多肽-膠原蛋白復合物聯(lián)合多西環(huán)素和rhBMP-2在體外實驗中可對抗銅綠假單胞菌、溶血性鏈球菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌并促進人脂肪來源干細胞的成骨分化。Yang等[36]證明了RADA16自組裝水凝膠與AMPs結(jié)合在體內(nèi)和體外實驗中可穩(wěn)定釋放AMPs，抑制金黃色葡萄球菌的生長并促進骨髓間充質(zhì)干細胞的增殖。Salick等[25]以兩條由纈氨酸和賴氨酸通過四肽序列交替構(gòu)成的8個殘基鏈組成了MAX1水凝膠自組裝抗菌肽，它的β-折疊結(jié)構(gòu)可以自組裝產(chǎn)生具有機械剛性的結(jié)構(gòu)。當其溶解在溶液里時，會發(fā)揮出陽離子抗菌肽對抗細菌的廣譜性，他們認為其原理還是通過靜電作用黏附細菌細胞膜上的負電荷，對革蘭陽性和陰性菌產(chǎn)生殺菌作用。由于水凝膠在感染性骨缺損應用的機械剛度還是不足，因此需聯(lián)合理化方法加強其力學性能。已有研究者開發(fā)了雙網(wǎng)水凝膠、交聯(lián)水凝膠、雜化水凝膠和膠原蛋白水凝膠等聯(lián)合機械增強劑用于骨缺損的修復，水凝膠的使用也可與鈦合金假體聯(lián)合使用，以加強其力學穩(wěn)定性。

2.4 納米粒子搭載AMPs治療骨感染的研究現(xiàn)狀

納米粒子是近年來在生命科學領域新興起的治療材料。在局部藥物遞送系統(tǒng)方面，總體性能取決于它們的理化性質(zhì)。與傳統(tǒng)的治療物質(zhì)相比，納米粒子具有特定的靶向性，可以加強藥物釋放效率，提高治療效果并減少毒副作用。第一種用作藥物載體的納米粒子是脂質(zhì)體，自此以后，大量的納米粒子被用于藥物遞送[37]，有的納米粒子自身即具有抗菌性。此外作為一種能與AMPs結(jié)合使用的載體，通常是物理包埋或?qū)MPs與自身枝接。He等[38]采用分層紡絲和電噴涂技術(shù)，制備了一種含有羥基磷灰石納米顆粒和負載有抗菌肽Pac-525的聚乳酸微球明膠殼聚糖復合膜。其實驗證實了納米粒子和AMPs結(jié)合使用具有指導骨再生和抑制常見細菌感染的功能。一些無機納米顆粒具有一定的細胞毒性，因此可生物降解的有機脂質(zhì)納米顆粒是具有發(fā)展前景的?？咕腖L-37已成功整合封裝在脂質(zhì)納米顆粒中，并展現(xiàn)出了對大腸桿菌的抗菌活性，在局部骨創(chuàng)處使用具有很大的潛力[39]。酪氨酸菌素作為商業(yè)常用的防腐劑，已成功在臨床上使用，鑒于其在生理環(huán)境下(pH: 7.35～7.45)的低溶解度和穩(wěn)定性，酪氨酸菌素可與納米載體結(jié)合使用以弱化其短處，Lewies等[40]將酪氨酸菌素 Z裝載在脂質(zhì)納米顆粒中，成功測試了材料對常見細菌如金黃色葡萄球菌的抗菌性。另外，納米粒子還可通過骨組織高親和力配體如阿侖膦酸鈉和鈣離子來支持藥物靶向運輸至靶點[41]，使載體藥物持續(xù)緩慢釋放，從而令局部感染部位的藥物有效濃度達到長期穩(wěn)定狀態(tài)[42]。納米粒子具有作為骨與關節(jié)感染藥物載體的極大潛力。

3 小結(jié)與展望

AMPs不僅具有快速殺菌能力，且因其非特異性免疫作用機制而具有廣譜抗菌性，還不易引起細菌耐藥，這些因素，再加上免疫調(diào)節(jié)等生物活性功能，使得AMPs成為治療骨髓炎和根除骨感染的有效藥物，令人們看到了非常有前途的抗生素替代藥物的應用潛力。目前AMPs的主要抗菌機制是整合到細菌細胞膜或細胞壁中破壞其完整性，對于細菌細胞膜，人們使用多種模型來表現(xiàn)其抗菌機制，如桶狀模型、地毯模型、分子電穿孔模型和界面活性模型；對于細菌細胞壁，AMPs作用于磷壁酸的磷酸基團，提高局部pH，激活自溶素，溶解糖苷鍵和肽結(jié)合鏈，從而破壞細胞壁。由于AMPs對環(huán)境敏感的原因而選擇結(jié)合藥物載體治療骨感染。隨著技術(shù)發(fā)展，已出現(xiàn)許多不同類型的載體，為抗菌療法提供了選擇。目前研究使用的骨水泥、鈦合金假體、水凝膠以及近年來發(fā)展較快的納米粒子皆是優(yōu)秀的局部藥物遞送載體，具有良好的生物相容性、機械強度和穩(wěn)定性，能有效利用AMPs的優(yōu)勢并將其遞送至局部靶點。

盡管AMPs具有優(yōu)秀的抗菌屬性，但其應用還面臨著不小的挑戰(zhàn)，包括提取成本較高、肽的生物利用度和有效性等相關的問題。學者需通過更多基礎研究發(fā)現(xiàn)低成本、易生產(chǎn)的抗菌肽，設計可用的藥物載體和受控系統(tǒng)，使用適當?shù)纳锬Ｐ?，模擬體內(nèi)外條件，來測試新的抗菌藥物和生物材料，以期解決這些復雜難題，進而為臨床應用提供嚴謹科學的理論依據(jù)。