基于GEO數(shù)據(jù)庫挖掘與膜性腎病密切相關(guān)的關(guān)鍵基因

高燕 李葉 段雪婷 王倩 張海松 李銘

0 引言

膜性腎病(membranous nephropathy，MN)是一種組織特異性自身免疫病，它是除糖尿病外造成成年人腎病綜合征的主要病因[1-3]，也是原發(fā)性腎小球腎炎中導(dǎo)致終末期腎臟病第二位或第三位的病因[4]。MN在各年齡段均可發(fā)病，發(fā)病高峰主要集中在50～60歲[5]。MN的病理改變主要表現(xiàn)為腎小球基底膜不斷增厚，在電鏡下可以觀察到上皮下區(qū)域內(nèi)出現(xiàn)電子致密沉積物，足細胞足突融合[6-7]。所以發(fā)現(xiàn)IgG抗體顆粒樣沉積于腎小球毛細血管袢是MN的診斷依據(jù)[8]。臨床上患者主要表現(xiàn)為腎病綜合征或者無癥狀蛋白尿，蛋白尿量每天超過3.5 g，約有1/3的患者可以自愈，1/3的患者會發(fā)展為終末期腎病，另有1/3的患者表現(xiàn)為持續(xù)存在蛋白尿但腎功能仍可長期維持[1]。

自2002年以來與MN有關(guān)的自身抗原包括中性內(nèi)肽酶(neutral endopeptidase)[9]、M型磷脂酶A2受體(muscle-type phospholipase A2 receptor，PLA2R)[10]，以及2014年報道的1型血小板反應(yīng)蛋白結(jié)構(gòu)域7A(thrombospondin type-1 domain-containing 7A，THSD7A)[11]不斷被鑒定出來，為MN的診斷帶來了革命性的變革。但是這些自身抗原的發(fā)現(xiàn)并沒有揭示MN的發(fā)病機制，所以目前自身抗原對MN的形成發(fā)展機制尚不明確，因而在臨床上使用昂貴且具有潛在毒性的藥物針對抗原治療MN仍具有很大的挑戰(zhàn)性，也給患者和社會帶來沉重的經(jīng)濟負擔。

近年來興起的基因芯片以及生物信息學研究技術(shù)為揭示腎臟疾病的病例機制提供了新的研究策略。Rudnicki等[12]通過基因芯片結(jié)合生物信息學分析揭示了進行性腎病的microRNA以及mRNA的表達譜改變，Ju等[13]則通過對腎組織進行轉(zhuǎn)錄組學研究發(fā)現(xiàn)表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)可以作為慢性腎病進展的標記物。Garantziotis等[14]則通過生物信息學方法挖掘出一些新的與包括MN在內(nèi)的原發(fā)性腎小球病有關(guān)的藥物靶點。差異表達的miR-150-5p則被鑒定出來可以預(yù)測IgA腎病的進展情況[15]。由此可以看出轉(zhuǎn)錄組學結(jié)合生物信息學方法已成為深入研究腎臟相關(guān)疾病發(fā)病機制的有力工具。因此本研究依托GEO(Gene Expression Omnibus)數(shù)據(jù)庫中MN的相關(guān)表達芯片數(shù)據(jù)，通過差異基因表達分析，基因功能注釋、富集分析以及蛋白互作分析，最終獲得與MN密切相關(guān)的基因以及相關(guān)信號通路，為以后揭示MN的分子病理機制提供理論研究基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

在GEO數(shù)據(jù)庫檢索獲得數(shù)據(jù)集GSE108113，該數(shù)據(jù)集以GPL19983 [HuGene-2_1-st] Affymetrix Human Gene 2.1 ST Array [HuGene21st_Hs_ENTREZG_19.0.0] 為平臺，包含280個樣本，其中包含正常腎小球組織6例，正常腎小管組織5例，MN患者腎小球組織44例，MN患者腎小管組織43例，局灶性和節(jié)段性腎小球硬化患者腎小球和腎小管組織共76例，微小病變腎小球和腎小管組織34例，ANCA相關(guān)性小血管炎腎小球和腎小管組織共72例。從中提取獲得6例正常腎小球樣本和44例MN腎小球樣本的數(shù)據(jù)。

1.2 基因表達分析

首先對獲得的50個樣本進行層次聚類分析，檢測樣本之間的相關(guān)性，剔除離群樣本之后對數(shù)據(jù)集進行主成分分析(principal component analysis,PCA)。之后通過R包org.Hs.eg.db將芯片探針轉(zhuǎn)換為基因名后，再用R包limma進行分析獲取在正常腎小球組織和MN腎小球組織之間差異表達的基因，設(shè)置篩選條件為P<0.01，且log2FC>2 或 log2FC<-2，并通過R語言對差異表達基因繪制火山圖和熱圖進行展示。

1.3 基因功能注釋以及富集分析

通過R包clusterProfiler[16]對獲得的差異表達基因進行GO(gene ontology)功能注釋分析，設(shè)置閾值P<0.01，q<0.01，差異具有統(tǒng)計學意義。同樣的方法也進行了KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)信號通路分析富集，P<0.05，差異具有統(tǒng)計學意義。

1.4 篩選核心基因

將獲得的差異表達基因?qū)隨TRING(https：//string-db.org/)在線數(shù)據(jù)庫，繪制蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖，設(shè)置閾值maximum number of interactors=0，confidence score ≥ 0.4，并通過Cytoscape軟件進行可視化，運用Cytoscape中的MCODE(molecular complex detection)插件對整個蛋白互作網(wǎng)絡(luò)進行聚類分析，篩選得分最高的功能模塊，將其節(jié)點作為核心基因。

2 結(jié)果與分析

2.1 篩選MN組織與正常組織之間的差異表達基因

從GEO數(shù)據(jù)庫下載獲得數(shù)據(jù)集GSE108113，通過R軟件從中提取6例正常腎小球組織的數(shù)據(jù)以及44例MN腎小球組織的數(shù)據(jù)，首先對這50例樣本進行聚類分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)離群樣本GSM2889924[圖1(a)]，將其剔除之后再進行PCA分析，兩組樣本聚類結(jié)果一致[圖1(b)]。之后運用R軟件里的limma包對兩組樣本進行差異表達基因分析，通過篩選標準|log2FC|>2，P<0.01，共獲得上調(diào)差異表達基因36條，下調(diào)差異表達基因126條。最后對獲得的差異表達基因繪制火山圖以及熱圖展示其在兩組樣本中的分布，如圖1(c)和圖1(d)所示。

圖1 篩選與MN有關(guān)的差異表達基因Figure 1 Identification of differentially expressed genes in association with MN

2.2 GO分析

運用R軟件里的clusterProfiler包對獲取的差異表達基因進行GO分析，結(jié)果如圖2所示。發(fā)現(xiàn)在“分子功能”(molecular function,MF)方面，差異表達基因主要富集在珠蛋白結(jié)合、亞鐵血紅素結(jié)合、氧氣結(jié)合、四吡咯結(jié)合以及氧載體活性[圖2(a)]；差異表達基因在“生物過程”(biological process，BP)方面主要分布在藥物分解代謝以及血小板脫顆粒[圖2(b)]；差異表達基因富集到的“細胞組分”(cellular component，CC)主要包括血液微粒(blood microparticle)，細胞頂端(apical part of cell)及其質(zhì)膜(apical plasma membrane)，囊泡(vesicle lumen)以及胞質(zhì)囊泡(cytoplasmic vesicle lumen)等[圖2(c)]。

圖2 GO條目及其所包含的差異表達基因Figure 2 Including genes of the GO terms

2.3 KEGG通路分析

同樣通過R軟件里的clusterProfiler包對篩選出來的差異表達基因進行KEGG通路富集分析，結(jié)果如圖3所示，結(jié)果中紅色代表上調(diào)的差異表達基因富集的通路，其主要富集在吞噬體、瘧疾以及非洲錐蟲；藍色代表下調(diào)的差異表達基因富集的通路，其主要富集的信號通路包括細胞色素P450參與的藥物代謝、視黃醇代謝、PPAR信號通路以及糖代謝、脂肪代謝等。

紅色代表上調(diào)的差異表達基因富集的通路，藍色代表下調(diào)的差異表達基因富集的通路。圖3 KEGG富集分析的結(jié)果Figure 3 KEGG enrichment analysis of differentially expressed genes

2.4 蛋白互作分析

將獲得的162個差異表達基因輸入在線網(wǎng)站STRING構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖，之后將獲得結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape軟件進行可視化以及后續(xù)分析。最終獲得由60個節(jié)點117條邊構(gòu)成的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)復(fù)合體，其余的102個差異表達基因未被包含到蛋白互作網(wǎng)絡(luò)復(fù)合體中[圖4(a)]。接下來通過Cytoscape中的MCODE插件對所構(gòu)建的整個蛋白互作網(wǎng)絡(luò)進行聚類關(guān)聯(lián)分析，設(shè)置參數(shù)degree cutoff=2,node score cutoff=0.2，k-core=2 以及max. depth=100，并選擇分值最高的Cluster作為最終篩選出來的核心基因，該Cluster包含13個節(jié)點25條邊，得分為4.167[圖4(b)]，由此共得到13個核心基因(表1)。

圖4 蛋白互作復(fù)合體Figure 4 PPI network

表1 與MN有關(guān)的核心基因Table 1 The core genes related with MN

3 討論與結(jié)論

MN自然病程長，是一種慢性病，而近年來在我國PM2.5污染嚴重的城市MN的發(fā)病率升高明顯，已成為繼IgA腎病之后第二大原發(fā)性腎小球病[17]，給社會經(jīng)濟以及人們的日常生活帶來沉重負擔。因而揭示MN的發(fā)病機制，尋找有效的治療靶點成為急需解決的醫(yī)學問題。本研究通過生物信息學方法提取并分析了GEO數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)集GSE108113中關(guān)于MN的數(shù)據(jù)，最終獲得與MN密切相關(guān)的13個核心基因以及藥物代謝、視黃醇代謝等相關(guān)信號通路。

CYP3A5(cytochrome P450 family 3 subfamily A member 5)，CYP4A11(cytochrome P450 family 4 subfamily A member 11)，CYP2B6(cytochrome P450 family 2 subfamily B member 6)均屬于細胞色素P450家族，這3個基因廣泛參與到藥物代謝過程，在本研究中還富集到了視黃醇代謝過程。Déri等[18]也報道了在終末期腎病患者的腎組織里面細胞色素P450家族的基因表達下調(diào)，與本研究的變化趨勢一致，說明了細胞色素P450家族在腎病發(fā)生過程中發(fā)揮著重要作用。另外被富集到這2個通路的核心基因還有GSTA2(glutathione S-transferase alpha 2)和UGT1A6(UDP glucuronosyltransferase family 1 member A6)。GSTA2屬于谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶家族，是II期解毒酶家族。Kim等[19]在研究中發(fā)現(xiàn)非馬沙坦防治腎臟纖維化可能是通過上調(diào)GSTA2以降低腎臟的氧化損傷，因而高水平表達的GSTA2對于腎臟具有保護作用。UGT1A6則屬于UDP-葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶1家族的一員，它可以將激素、藥物等降解為水溶性的排泄物。Liu等[20]發(fā)現(xiàn)肝臟及腎臟的葡萄苷酸化作用很大程度上受到該家族基因表達的影響。因而UGT1A6表達降低可能會影響腎臟的正常功能。

其他的核心基因像NT5E(5′-nucleotidase ecto)是一種核苷酸酶，也參與藥物的代謝。而Cappelli等[21]也觀察到TGF-β可以激活腎小管上皮細胞表達NT5E以促進腎臟纖維化，而在糖尿病腎病患者尿液中NT5E含量升高可以作為預(yù)后不良的指標。激肽原1(KNG1，kininogen 1)在GO分析中被注釋到血液微粒、血小板脫顆粒以及胞質(zhì)囊泡中。Tang等[22]通過生物信息學方法發(fā)現(xiàn)KNG1與糖尿病患者的腎小管損傷有關(guān)。

本研究揭示了以CYP3A5、CYP4A11、CYP2B6

為代表的13個核心基因表達異常，以及藥物代謝和視黃醇代謝通路與MN之間存在的密切關(guān)聯(lián)。然而這些基因表達異常與MN發(fā)展形成的病理分子機制還有待深入研究。同時本研究中只選取一個數(shù)據(jù)集中的部分合適樣本，研究有一定局限性，后續(xù)還需要有更多的實驗數(shù)據(jù)驗證支持。本研究將為闡釋MN發(fā)生的病理機制提供新的研究視角和研究基礎(chǔ)。