兔眼角膜膠原交聯(lián)后角膜動(dòng)態(tài)響應(yīng)參數(shù)的變化*

袁子維，曾正，李冬果，張海霞，李林△

(1.首都醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，北京 100069； 2.首都醫(yī)科大學(xué) 臨床生物力學(xué)應(yīng)用基礎(chǔ)研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100069)

引言

角膜生物力學(xué)特性與角膜在眼內(nèi)壓作用下的變形相關(guān)。近年來，角膜生物力學(xué)相關(guān)性參數(shù)逐漸成為一個(gè)重要的指標(biāo)來評(píng)估和診斷角膜擴(kuò)張性疾病[1-4]、對(duì)青光眼的診斷也有輔助作用[5-6]。角膜屈光手術(shù)前后角膜生物力學(xué)的檢測對(duì)于避免并發(fā)癥、評(píng)估手術(shù)效果尤為重要[7]。

角膜膠原交聯(lián)最早由Spoerl于1998年提出[8]，其通過增加角膜纖維間的共價(jià)鍵連接來增強(qiáng)角膜的機(jī)械強(qiáng)度，是目前臨床上有效阻止角膜擴(kuò)張的一種方法。離體拉伸實(shí)驗(yàn)已證實(shí)，交聯(lián)后角膜的力學(xué)性質(zhì)會(huì)發(fā)生變化[9]。臨床研究顯示，交聯(lián)處置后基于可視化角膜生物力學(xué)分析儀(corneal visualisation scheimpflug technology，Corvis ST)獲取的角膜動(dòng)態(tài)響應(yīng)參(dynamic corneal response parameters，DCRs)有不同程度地變化[10-11]。

Corvis ST是一款新型可視化角膜生物力學(xué)分析儀，采用高速Scheimpflug相機(jī)，每秒采集超過4 000幀圖像，利用空氣脈沖作用于角膜，動(dòng)態(tài)記錄并分析角膜受壓形變的全過程，獲得的DCRs在某種程度上可以反映角膜生物力學(xué)特性。Corvis ST具有良好的精確性和可重復(fù)性，可以將Corvis ST角膜動(dòng)態(tài)響應(yīng)參數(shù)視為實(shí)際角膜生物力學(xué)因素的替代指標(biāo)[12-13]。

通過離體測試了解角膜生物力學(xué)性質(zhì)無法用于臨床實(shí)踐，基于Corvis ST獲得角膜動(dòng)態(tài)響應(yīng)參數(shù)可以評(píng)估膠原交聯(lián)角膜的力學(xué)特性，因此，本研究對(duì)正常兔眼角膜與膠原交聯(lián)后不同時(shí)間角膜動(dòng)態(tài)響應(yīng)參數(shù)的差異進(jìn)行分析，探討角膜膠原交聯(lián)后生物力學(xué)特性的變化，為交聯(lián)處置術(shù)式的個(gè)性化和評(píng)估交聯(lián)手術(shù)術(shù)后效果提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

選取健康新西蘭白兔20只，選擇左眼進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，由首都醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。所有實(shí)驗(yàn)均獲得當(dāng)?shù)貍惱砦瘑T會(huì)的批準(zhǔn)，并遵循《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》及ARVO聲明。

1.2 方法

術(shù)前對(duì)兔子進(jìn)行眼部檢查以排除相關(guān)疾病。20只健康新西蘭白兔左眼為手術(shù)眼，右眼為對(duì)照眼。對(duì)實(shí)驗(yàn)兔耳緣靜脈注射4 mL 3%戊巴比妥鈉進(jìn)行全身麻醉后，將兔置于手術(shù)臺(tái)。對(duì)實(shí)驗(yàn)眼滴1～2 滴鹽酸奧布卡因滴眼液，實(shí)施表面麻醉。而后用經(jīng)酒精消毒的金屬墊片圈定實(shí)驗(yàn)眼角膜中央約8 mm區(qū)域，注射器滴加75%醫(yī)用酒精，使角膜中央被酒精充分浸泡30 s。用無菌棉簽吸取剩余酒精，PBS反復(fù)沖洗，經(jīng)棉簽擦拭后可見角膜上皮剝脫，重復(fù)清洗三至四次。去除上皮后，滴加0.1%核黃素溶液，2 min一次，每次1～2 滴，使角膜充分浸泡和滲透20 min。浸泡完成后，使用UV-X TM 2000 角膜交聯(lián)系統(tǒng)對(duì)術(shù)眼進(jìn)行紫外光照射，波長為365 nm，能量密度為 3 mW/cm2，照射時(shí)長為30 min，照射過程中保持角膜的核黃素浸潤。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，送回動(dòng)物房分籠飼養(yǎng)。術(shù)后1周給予實(shí)驗(yàn)眼妥布霉素地塞米松滴眼液點(diǎn)眼，每日2次，以防止眼部發(fā)生感染。

術(shù)后3 d(5眼)、1周(11眼)、2周(7眼)、3周(9眼)、4周(14眼)、8周(6眼)、12周(3眼)進(jìn)行Corvis ST在體測試。獲得角膜動(dòng)態(tài)響應(yīng)參數(shù)，見表1。在本研究中，將可以反映角膜硬度的參數(shù)SP-A1、IR、DA Ratio 1、DA Ratio 2、SSI與角膜彈性模量E定義為角膜生物力學(xué)參數(shù)。

表1 角膜動(dòng)態(tài)響應(yīng)參數(shù)

(表1)續(xù)

角膜彈性模量計(jì)算方法參考前期研究[14]，不做詳細(xì)描述。根據(jù)式(1)計(jì)算角膜彈性模量，式中E為彈性模量；f是作用于角膜頂點(diǎn)的空氣脈沖力；δ為角膜前表面在空氣脈沖下的位移；R為角膜前表面在水平方向上的曲率半徑，ν是泊松比，在本研究中ν取0.49；μ由ν、R、t和空氣柱半徑rp根據(jù)式(2)確定，參數(shù)c的計(jì)算方法由前期研究中得到。

(1)

(2)

角膜交聯(lián)部分彈性模量計(jì)算方法參考前人研究[15]，對(duì)角膜彈性性質(zhì)的分布進(jìn)行假設(shè)：交聯(lián)部分的彈性模量沿其深度是恒定的，非交聯(lián)部分的彈性模量也一樣。把交聯(lián)后角膜分成兩層，根據(jù)式(3)計(jì)算角膜交聯(lián)部分彈性模量，估計(jì)交聯(lián)效果，式中EmCXL是交聯(lián)后角膜平均彈性模量，即式(1)中計(jì)算的E；ECXL是交聯(lián)部分平均彈性模量；Emc是交聯(lián)前角膜平均彈性模量，在本研究中Emc取0.24 MPa；t是角膜厚度，本研究中t取410 μm；h是角膜交聯(lián)深度，本研究中h取210 μm。

EmCXL×t=ECXL×h+Emc×(t-h)

(3)

采用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。使用Shapiro-Wilk檢驗(yàn)各組數(shù)據(jù)正態(tài)性。正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述，應(yīng)用單因素方差分析(ANOVA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并用Sidak法做兩兩比較分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。偏態(tài)分布數(shù)據(jù)計(jì)算中位數(shù)和變異范圍進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述，應(yīng)用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Bonferroni校正的Mann-Whitney U方法進(jìn)行組間兩兩比較。對(duì)bIOP、CCT與反映角膜生物力學(xué)特性的參數(shù)E、SP-A1、IR等進(jìn)行Pearson和Spearman相關(guān)性分析，以P<0.05為顯著相關(guān)。

2 結(jié)果

本研究共選取20只實(shí)驗(yàn)兔，對(duì)左眼進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)膠原交聯(lián)手術(shù)。所有實(shí)驗(yàn)兔術(shù)前基礎(chǔ)信息見表2。

表2 實(shí)驗(yàn)兔基本信息

2.1 交聯(lián)術(shù)前與術(shù)后不同時(shí)間角膜動(dòng)態(tài)響應(yīng)參數(shù)變化結(jié)果

交聯(lián)術(shù)前與術(shù)后不同時(shí)間角膜動(dòng)態(tài)響應(yīng)參數(shù)變化,見圖1—圖2。交聯(lián)后3 d、1周各測量參數(shù)變化較大，但不穩(wěn)定，并未表現(xiàn)出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。CCT在交聯(lián)后12周較3、4周顯著升高；HCR在交聯(lián)后3 d較術(shù)前顯著升高，交聯(lián)后3周較3 d顯著下降；HCL在交聯(lián)后1周較術(shù)前顯著升高，IR在交聯(lián)后12周較術(shù)前、交聯(lián)后3周顯著下降。其它參數(shù)并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

根據(jù)角膜交聯(lián)部分彈性模量計(jì)算方法，對(duì)交聯(lián)后4周的交聯(lián)效果進(jìn)行估計(jì)。交聯(lián)后4周計(jì)算得到角膜整體彈性模量平均值為0.332 MPa，據(jù)此計(jì)算得到角膜交聯(lián)部分的彈性模量為0.429 MPa，交聯(lián)部分的彈性模量比整個(gè)交聯(lián)角膜平均彈性模量高出30%，比交聯(lián)前高出78.7%。

2.2 角膜生物力學(xué)參數(shù)與角膜bIOP、CCT的相關(guān)關(guān)系

對(duì)角膜bIOP、CCT與反映角膜生物力學(xué)特性的參數(shù)E、SP-A1、DA Ratio 1、DA Ratio 2、IR、SSI進(jìn)行Pearson和Spearman相關(guān)性分析，結(jié)果見表3。E與CCT呈負(fù)相關(guān)，與bIOP呈正相關(guān)；SP-A1與CCT、bIOP呈正相關(guān)；DA Ratio 1與CCT呈負(fù)相關(guān)，與bIOP呈正相關(guān)；DA Ratio 2與CCT呈負(fù)相關(guān)，與bIOP呈正相關(guān)；IR與CCT呈負(fù)相關(guān)，與bIOP無顯著相關(guān)性；SSI與CCT無顯著相關(guān)性，與bIOP呈正相關(guān)。

圖1 角膜基本形變參數(shù)變化圖

注：正態(tài)分布數(shù)據(jù)用折線圖描述，偏態(tài)數(shù)據(jù)用箱線圖描述。橫坐標(biāo)為時(shí)間分組；3 d、1周、2周、3周、4周、8 周、12周分別表示交聯(lián)后3 d、1周、2周、3周、4周、8周、12周?？v坐標(biāo)為各測量參數(shù)值。*：P<0.05；**：P<0.01。

表3 角膜生物力學(xué)參數(shù)與CCT、bIOP相關(guān)關(guān)系

3 討論

準(zhǔn)確評(píng)估角膜的生物力學(xué)特性對(duì)于交聯(lián)處置術(shù)式的個(gè)性化設(shè)計(jì)和術(shù)后效果評(píng)估至關(guān)重要。本研究對(duì)兔眼進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)膠原交聯(lián)手術(shù)，應(yīng)用Corvis ST于術(shù)后不同時(shí)間進(jìn)行了在體測試，并計(jì)算角膜彈性模量，探討角膜生物力學(xué)參數(shù)隨時(shí)間的變化。由圖1、圖2可知，角膜交聯(lián)前后各組角膜動(dòng)態(tài)響應(yīng)參數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差不大，組內(nèi)各樣本一致性較好。結(jié)果顯示，術(shù)后1周內(nèi)角膜動(dòng)態(tài)響應(yīng)參數(shù)變化明顯，術(shù)后2～3月開始趨于穩(wěn)定。

在標(biāo)準(zhǔn)的膠原交聯(lián)手術(shù)中，有研究觀察到人眼角膜在交聯(lián)后1、2月后CCT顯著下降[16-17]。本研究中觀察到交聯(lián)后3 d和1周時(shí)CCT平均值短暫升高，且組內(nèi)CCT標(biāo)準(zhǔn)差較大，可能是部分兔角膜水腫所致，到交聯(lián)后4周、2月、3月，角膜水腫逐漸恢復(fù)，組內(nèi)CCT值標(biāo)準(zhǔn)差減小，CCT平均值與術(shù)前相比無明顯變化，說明交聯(lián)手術(shù)改變角膜厚度主要是手術(shù)中去除角膜上皮引起的。

Bak-Nielsen等[18]對(duì)8名圓錐角膜患者(9眼)交聯(lián)前后進(jìn)行Corvis在體測試，發(fā)現(xiàn)DA、HCT、A2T有顯著上升。Fuchsluger等[19]對(duì)圓錐角膜、交聯(lián)角膜和健康角膜進(jìn)行測試，發(fā)現(xiàn)交聯(lián)后A2V、DA顯著上升，各組間HCR、CCT也有顯著差異。Herber等[20]發(fā)現(xiàn)豬眼在交聯(lián)后IR、DA顯著減小，IOP、SP-A1顯著升高。以上研究顯示，交聯(lián)后A2V、HCR、HCT有顯著上升，DA也有顯著差異，但各研究結(jié)果不一致，可能是DA存在較大個(gè)體變異性所致。本研究中交聯(lián)后HCR、HCL較術(shù)前有顯著升高，A2V有上升但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，DA無明顯變化。

數(shù)據(jù)顯示，反映角膜硬度的參數(shù)DA Ratio、IR和SP-A1在交聯(lián)后均有所變化，SSI變化較小。角膜交聯(lián)后3 d，DA Ratio 1、DA Ratio 2、IR下降，SP-A1升高，Vinciguerra等[21]也得到類似的結(jié)果，SP-A1、SP-HC顯著上升，IR、DA Ratio顯著下降。DA Ratio 1、DA Ratio 2表示角膜頂點(diǎn)與1 mm、2 mm位置最大形變幅度比值，IR表示反向凹面半徑曲線下面積，反映了角膜整體硬度，SP-A1是角膜剛度參數(shù)，這些參數(shù)的變化提示交聯(lián)手術(shù)是有效的，角膜硬度升高。

角膜是一種生物軟組織，其應(yīng)力-應(yīng)變關(guān)系是非線性的[22]，在體角膜受到眼內(nèi)壓的作用，呈現(xiàn)球形前凸?fàn)顟B(tài)。目前，通過在體測試識(shí)別角膜生物力學(xué)依然非常困難。如果將角膜空氣沖壓測試過程看做薄球殼受壓模型，我們前期建立了一種基于Corvis測試結(jié)果計(jì)算角膜彈性模量的方法，給出了正常兔眼角膜彈性模量為0.16～0.35 MPa[14]。本研究利用該方法，由交聯(lián)術(shù)后兔Corvis ST測試參數(shù)計(jì)算得到角膜彈性模量E為0.09～0.75 MPa，與文獻(xiàn)結(jié)果量綱一致。本研究的結(jié)果顯示交聯(lián)術(shù)后3周E較術(shù)前有增加，與角膜交聯(lián)后經(jīng)單軸拉伸實(shí)驗(yàn)和原子力顯微鏡壓痕實(shí)驗(yàn)得到的彈性模量增大的研究結(jié)果一致[23-24]?？紤]到角膜膠原交聯(lián)效果僅在前部角膜，而后部角膜并未發(fā)生交聯(lián)[25]，因此，可以認(rèn)為交聯(lián)后角膜前部彈性模量增大而后部保持不變，把角膜視為交聯(lián)前部與非交聯(lián)后部的兩層，估算角膜交聯(lián)部分的彈性模量，本研究依此計(jì)算了兔角膜交聯(lián)后4周交聯(lián)部分的彈性模量，結(jié)果顯示，交聯(lián)后4周交聯(lián)部分的彈性模量比整個(gè)交聯(lián)角膜平均彈性模量高出30%，比交聯(lián)前高出78.7%，與Wollensak等[23]計(jì)算得到兔眼楊氏模量顯著增加78.4%～87.4%相一致，說明交聯(lián)是有效的。

我們對(duì)角膜生物力學(xué)參數(shù)與角膜bIOP、CCT的相關(guān)關(guān)系進(jìn)行了研究，分析角膜生物力學(xué)性質(zhì)與角膜厚度、眼壓的相互作用，為了解角膜生物力學(xué)參數(shù)如何反映在體角膜生物力學(xué)提供幫助。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，計(jì)算的彈性模量E與角膜CCT和bIOP均有相關(guān)性，反映角膜硬度的參數(shù)與CCT和bIOP也有顯著相關(guān)關(guān)系。Laplace定律指出，壁面張力是內(nèi)壓的函數(shù)。對(duì)眼球而言，眼球壁張力會(huì)隨著眼壓的升高而增加，故角膜和鞏膜會(huì)在高眼壓作用下變硬[26]。此外，統(tǒng)計(jì)分析交聯(lián)前后E均有較大變異幅度，而CCT一致性較好，這些信息提示我們角膜硬度不僅僅取決于角膜厚度，高眼壓下的軟角膜可能比低眼壓下的硬角膜表現(xiàn)出更硬的特征，同時(shí)在眼壓測量過程，也要考慮到角膜硬度的影響。

本研究也有一定的局限性。由于各組樣本數(shù)量有所差異，且樣本數(shù)量少，兔個(gè)體差異導(dǎo)致術(shù)后實(shí)驗(yàn)眼恢復(fù)情況不同，對(duì)結(jié)果造成一定影響。此外，Corvis ST還提供了生物力學(xué)指數(shù)(corvis biomechanical index，CBI)和水平方向Ambrosio厚度(ambrosio relational thickness horizontal，ARTh)。ARTh表示最薄點(diǎn)角膜厚度與厚度變化率比值，其值越小表明角膜厚度薄或由中心向外周變化幅度大，對(duì)于研究急性圓錐角膜有重要意義[27]。CBI目前已成為臨床上診斷圓錐角膜的一個(gè)指標(biāo)，有較好的診斷性能[27-28]。本研究選用動(dòng)物正常角膜，未涉及圓錐角膜，故未重點(diǎn)關(guān)注這兩個(gè)參數(shù)。

4 總結(jié)

綜上所述，Corvis ST測得角膜動(dòng)態(tài)參數(shù)可以反映出角膜交聯(lián)后生物力學(xué)變化特征，有助于評(píng)估交聯(lián)手術(shù)的效果。未來還需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本來觀察分析角膜膠原交聯(lián)后彈性模量、生物力學(xué)參數(shù)及形態(tài)的變化。