HMGB1抑制劑預(yù)處理對大鼠心肺復(fù)蘇后腦缺血再灌注損傷及TLR4/NF-κB信號通路的影響

王華杰 蘇醒 麥葉 吳遠(yuǎn)怡 顧勇

心跳驟停及心肺復(fù)蘇可造成腦缺血再灌注損傷，導(dǎo)致神經(jīng)損傷和腦功能障礙，出現(xiàn)永久性腦損傷[1-2]。烏司他丁可減輕心肺復(fù)蘇后腦損傷，但烏司他丁于臨床應(yīng)用中可出現(xiàn)粒細(xì)胞減少、腹瀉和肝功能損傷等不良反應(yīng)[3]，因此找到更為安全有效的藥物治療心肺復(fù)蘇后腦損傷具有重要意義。高遷移率族蛋白1(high-mobility group box 1，HMGB1)在機(jī)體各組織中廣泛表達(dá)，可調(diào)控免疫炎癥、細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激等多種生理、病理過程[4]，其抑制劑甘草酸可減輕急性心肌梗死大鼠炎癥反應(yīng)，保護(hù)心肌組織[5]，還可改善創(chuàng)傷性顱腦損傷后神經(jīng)功能[6]。Toll樣受體4(toll- like receptor 4，TLR4)/核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear transcription factor-κB，NF-κB)是HMGB1調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的下游信號通路[7]，抑制其表達(dá)，可減輕小膠質(zhì)誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥[8]，減輕腦腦缺血再灌注損傷[9]，推測下調(diào)TLR4/NF-κB通路可能是HMGB1抑制劑降低大鼠心肺復(fù)蘇后腦缺血再灌注損傷的藥理機(jī)制之一。本文擬通過建立心肺復(fù)蘇大鼠模型，探討HMGB1抑制劑對心肺復(fù)蘇后大鼠的腦缺血再灌注損傷是否具有治療效果，并闡明其內(nèi)在機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1動物：SPF級SD大鼠〔康美華大基因技術(shù)有限公司，許可證號SYXK(粵)2019-0205〕，雄性，體重200～240 g。飼養(yǎng)室飼養(yǎng)(光照交替12 h/12 h，25℃，濕度50%)，自由飲食，確保室內(nèi)通風(fēng)且環(huán)境清潔。

1.1.2試劑及儀器：甘草酸(貨號：SG8600)購自上海恒斐生物科技有限公司；烏司他丁(國藥準(zhǔn)字：H19990134)購自廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司；大鼠中樞神經(jīng)特異性蛋白(S100β) ELISA試劑盒(貨號：YS04063B)購自上海雅吉生物科技有限公司；大鼠神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)ELISA試劑盒(貨號：SBJ-R0081)購自南京森貝伽生物科技有限公司；大鼠IL-6、TNF-α ELISA試劑盒、NF-κB p65一抗、羊抗兔二抗(貨號：ab100772、ab16502、ab150077)購自美國Abcam Plc公司。酶標(biāo)儀(XElx800)購自美國Perkin Elmer股份有限公司；蛋白電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀(Mini PROTEAN)購自美國Bio-Rad公司；凝膠成像系統(tǒng)(2500)購自上海天能生物科技有限公司；離心機(jī)(Centrifuge 5424R)購自德國Eppendorf股份公司。

1.2 方法

1.2.1動物模型制備及分組給藥：依據(jù)參考文獻(xiàn)方法構(gòu)建模型[10]，所有大鼠腹腔注射2.5%戊巴比妥鈉(45 mg/kg)麻醉大鼠，將其以仰臥位固定于操作臺上，頸部備皮，以16 G鞘管經(jīng)口氣管插管后連接動物呼吸機(jī)進(jìn)行心電監(jiān)護(hù)，在頸部中間做一約1 cm切口暴露位于左側(cè)的股動脈，插入留置管監(jiān)測各組大鼠血壓。于呼氣結(jié)束時用動脈夾封閉氣管，封閉時間3～4 min，同時注射冰氯化鉀(0.5 mol/L)至頸動脈，待心電圖走勢趨于直線后馬上機(jī)械通純氧(80次/min，潮氣量6 mg/kg)，同時按壓胸外心臟(180次/min)，直至心跳恢復(fù)。以平均動脈壓>50 mmHg且持續(xù)10 min為構(gòu)模成功，將模型構(gòu)建成功的大鼠共60只隨機(jī)分為模型組、甘草酸低劑量組、甘草酸中劑量組、甘草酸高劑量組、烏司他丁組，每組各12只。另設(shè)假手術(shù)組12只，參照上文操作，僅暴露氣管，隨后立即縫合。

配制不同濃度的甘草酸溶液(1、2、3 mg/mL，生理鹽水稀釋)，甘草酸低、中、高劑量組大鼠分別灌胃上述稀釋的溶液10 mL/kg，按體重1 mL/kg尾靜脈注射生理鹽水；烏司他丁組大鼠尾靜脈注射烏司他丁注射液(50000 U/mL)1 mL/kg[11]，并按體重予生理鹽水10 mL/kg灌胃；假手術(shù)組、模型組同時按體重生理鹽水10 mL/kg灌胃并1 mL/kg尾靜脈注射，各組均持續(xù)7 d。

1.2.2血液指標(biāo)檢測：末次給藥24 h后，采集各組所有大鼠尾靜脈血1.5 mL，靜置20 min后4℃下以1000 r/min、離心半徑10 cm，離心15 min，取上清液，分別按照大鼠S100β、NSE ELISA試劑盒方法檢測S100β、NSE水平。

1.2.3神經(jīng)功能缺損評分：尾靜脈采血后，各組所有大鼠采用Longa分級法[13]進(jìn)行評分：神經(jīng)功能無明顯損傷，0分；前爪伸展困難且不完全，1分；行走時出現(xiàn)轉(zhuǎn)圈現(xiàn)象，2分；行走時出現(xiàn)傾倒現(xiàn)象，3分；喪失正常行為能力，4分；死亡，5分。

1.2.4腦組織指標(biāo)檢測：評分結(jié)束后，迅速麻醉大鼠并處死，剝離腦組織，每組隨機(jī)選取6只大鼠稱重(濕重)，隨后烘干，稱量干重，得出腦組織含水量=(濕重-干重)/濕重×100%。

各組剩余的6只大鼠大腦中剪取約1 g腦組織，加入蛋白裂解液、勻漿、4℃離心25 min(3000 r/min，離心半徑10 cm)、吸出上清液，以BCA試劑盒測得蛋白總濃度，然后從中取500 μL分別按照相應(yīng)ELISA試劑盒方法檢測IL-6、TNF-α水平。

(1)Western blot法檢測：參照SDS-PAGE凝膠制備試劑盒方法配制濃縮膠、分離膠，取含有20 μg總蛋白的樣品液進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)膜處理。5%脫脂奶粉封閉2 h，依次進(jìn)行TLR4、MyD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65一抗、二抗孵育，滴加顯色液處理，凝膠成像系統(tǒng)拍照。Quantity One軟件分析條帶圖像，定量其灰度值，以GAPDH作為內(nèi)參，計算各組蛋白與GAPDH蛋白的灰度值的比值，記作蛋白相對表達(dá)量。

(2)HE染色檢測：將剩余大腦組織用生理鹽水洗凈，4%多聚甲醛固定，不同濃度酒精由低到高梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋制作切片(4 μm)若干。脫蠟后不同濃度酒精由高到低梯度處理，按照試劑盒方法染色，蒸餾水洗凈后脫水處理并封片，置于400倍光學(xué)顯微鏡下，觀察神經(jīng)元受損程度。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腦損傷情況比較具體見圖1、表1。假手術(shù)組大鼠神經(jīng)元完好無損傷，胞漿、核、核仁結(jié)構(gòu)均正常，神經(jīng)功能缺損評分為0。與假手術(shù)組相比，模型組大鼠神經(jīng)元受損明顯，存在變性、核皺縮等現(xiàn)象，神經(jīng)功能缺損評分、血清S100β、NSE水平明顯升高(P<0.05)。與模型組相比，烏司他丁組、甘草酸低劑量組、甘草酸中劑量組、甘草酸高劑量組大鼠神經(jīng)元損傷逐漸恢復(fù)，神經(jīng)功能缺損評分、血清S100β、NSE水平降低，且甘草酸各劑量組間隨劑量增高而降低(P<0.05)。甘草酸高劑量組與烏司他丁組相比上述指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

注：A：假手術(shù)組；B：模型組；C：甘草酸低劑量組；D：甘草酸中劑量組；E：甘草酸高劑量組；F：烏司他丁組 圖 1 各組大鼠腦組織神經(jīng)元損傷情況比較(HE×400)

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分及血清S100β、NSE水平比較

2.2 各組大鼠腦組織相關(guān)指標(biāo)比較與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腦組織IL-6及TNF-α水平，p-NF-κB p65/NF-κB p65及TLR4、MyD88蛋白表達(dá)及腦組織含水量明顯升高(P<0.05)。與模型組相比，甘草酸低劑量組、甘草酸中劑量組、甘草酸高劑量組、烏司他丁組大鼠腦組織IL-6及TNF-α水平，p-NF-κB p65/NF-κB p65，TLR4、MyD88蛋白表達(dá)及腦組織含水量降低，且甘草酸各劑量組間隨劑量增高而降低(P<0.05)。甘草酸高劑量組與烏司他丁組相比上述指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。具體見圖2、表2。

注：A：假手術(shù)組；B：模型組；C：甘草酸低劑量組；D：甘草酸中劑量組；E：甘草酸高劑量組；F：烏司他丁組；TLR4：Toll樣受體4；MyD88：髓樣分化因子88；NF-κB：核轉(zhuǎn)錄因子-κB；GAPDH：內(nèi)參 圖 2 各組大鼠腦組織TLR4/NF-κB通路蛋白表達(dá)量(Western blot)

表2 各組大鼠腦組織檢測指標(biāo)比較

3 討論

腦復(fù)蘇是心跳驟停患者心肺復(fù)蘇后預(yù)后的關(guān)鍵因素，減輕心肺復(fù)蘇時引起的腦缺血再灌注損傷是促進(jìn)腦復(fù)蘇的途徑之一[13]。本文通過建立心肺復(fù)蘇大鼠模型對心肺復(fù)蘇后腦缺血再灌注損傷進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，模型組大鼠腦組織神經(jīng)元損傷嚴(yán)重，具有典型變性、核皺縮現(xiàn)象，神經(jīng)功能缺損評分及腦組織含水量明顯升高；腦損傷指標(biāo)S100β和NSE以及腦炎癥因子IL-6、TNF-α水平也明顯升高，表明模型大鼠在心肺復(fù)蘇過程中血腦屏障破壞，腦組織內(nèi)產(chǎn)生炎癥，引發(fā)神經(jīng)元損傷和水腫，具有明顯的再灌注損傷癥狀，表明模型構(gòu)建成功。

HMGB1參與介導(dǎo)腦缺血再灌注損傷的病理生理過程[14]，其抑制劑甘草酸可通過抑制炎癥減輕腦水腫、神經(jīng)元損傷等病理癥狀，修復(fù)腦功能，因此推測甘草酸對心肺復(fù)蘇后腦缺血再灌注損傷可能有治療作用。本文選用不同劑量甘草酸處理，發(fā)現(xiàn)甘草酸可減輕大鼠腦神經(jīng)元細(xì)胞損傷，降低其神經(jīng)功能缺損評分、腦組織含水量、血清中S100β及NSE水平、腦組織IL-6及TNF-α水平，隨著甘草酸劑量升高，效果愈加明顯，且高劑量甘草酸的功效與陽性對照藥烏司他丁相似，這表明甘草酸可減輕心肺復(fù)蘇大鼠腦水腫及炎癥反應(yīng)，降低神經(jīng)元損傷，恢復(fù)神經(jīng)功能，并隨劑量升高而作用增強。

既往研究發(fā)現(xiàn)，TLR4/NF-κB信號通路參與腦缺血再灌注損傷過程，抑制其表達(dá)可減輕腦損傷[15]，因此TLR4/NF-κB信號是減輕心肺復(fù)蘇后腦缺血再灌注損傷的潛在作用靶點。本研究觀察HMGB1抑制劑甘草酸是否可以調(diào)控心肺復(fù)蘇后腦損傷過程中TLR4/NF-κB通路表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甘草酸可降低模型大鼠腦組織中TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表達(dá)，且隨著甘草酸劑量升高，效果愈加明顯，表明其可下調(diào)TLR4/NF-κB信號通路蛋白表達(dá)，保護(hù)心肺復(fù)蘇后腦組織免于損傷。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示HMGB1抑制劑甘草酸對心肺復(fù)蘇后腦缺血大鼠模型具有緩解腦水腫和炎癥反應(yīng)，恢復(fù)神經(jīng)損傷，保護(hù)神經(jīng)功能，其藥理機(jī)制可能是通過抑制TLR4/NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)而下調(diào)TLR4/NF-κB信號表達(dá)，這可能為治療相關(guān)疾病提供了新的思路，但HMGB1抑制劑作用方式多樣，還可能通過調(diào)控其他通路間接影響疾病發(fā)展，具體有待后續(xù)的深入研究。