結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性、外周血結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)陰性病例的臨床特征分析

付紅繼，杜鳳玲

（1. 宜都市第一人民醫(yī)院感染性疾病科，湖北 宜都 443300 ；2. 宜都市中醫(yī)醫(yī)院呼吸科，湖北 宜都 443300）

結(jié)核病是臨床上常見的慢性傳染病，由結(jié)核分枝桿菌（mycobacterium tuberculosis）感染所致。目前結(jié)核病在全球范圍內(nèi)的發(fā)病率和致死率不容樂(lè)觀，該病是導(dǎo)致人類死亡的十大因素之一。結(jié)核病的危險(xiǎn)程度相較于艾滋病來(lái)說(shuō)有過(guò)之而無(wú)不及，被廣大醫(yī)生稱之為傳染病中的頭號(hào)殺手。此病對(duì)患者的身心健康危害極大，因此臨床上建議對(duì)此病進(jìn)行及早診斷和治療，避免患者的病情惡化[1]。進(jìn)行病原學(xué)檢查是臨床上診斷結(jié)核病的“金標(biāo)準(zhǔn)”。酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)在結(jié)核病的診斷中應(yīng)用廣泛（至今為止已在臨床上應(yīng)用近20年），具有重要的診斷價(jià)值。但臨床上有少數(shù)患者進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)的結(jié)果呈陽(yáng)性，但進(jìn)行外周血結(jié)核感染T 細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)（T cell spottest of tuberculosis，T-SPOT.TB）的結(jié)果卻呈陰性，這給結(jié)核病的診斷帶來(lái)了一定困難。為提高結(jié)核病臨床診斷的準(zhǔn)確率，本研究分析并總結(jié)了進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)結(jié)果呈陽(yáng)性、外周血T-SPOT.TB結(jié)果呈陰性病例的臨床特征?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料和方法

1.1 基線資料

本文的研究對(duì)象是2019 年1 月至2020 年1月期間我院收治的65 例進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)結(jié)果呈陽(yáng)性、外周血T-SPOT.TB 結(jié)果呈陰性的患者及65 例進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)結(jié)果呈陽(yáng)性、外周血T-SPOT.TB 結(jié)果呈陽(yáng)性的患者。其納入標(biāo)準(zhǔn)是：病情符合結(jié)核病的診斷標(biāo)準(zhǔn)，且經(jīng)綜合檢查得到確診；進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)的結(jié)果呈陽(yáng)性；病歷資料完整；知曉本研究?jī)?nèi)容，并簽署了知情同意書。其排除標(biāo)準(zhǔn)是：合并有其他嚴(yán)重的器質(zhì)性疾病；存在認(rèn)知功能障礙；病歷資料缺失或中途退出本研究；病情持續(xù)惡化。將其中進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)結(jié)果呈陽(yáng)性、外周血T-SPOT.TB 結(jié)果呈陰性的65 例患者設(shè)為觀察組，將其中進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)結(jié)果呈陽(yáng)性、外周血T-SPOT.TB 結(jié)果呈陽(yáng)性的65 例患者設(shè)為對(duì)照組。在觀察組患者中，有男35 例，女30 例；其年齡為20 ～82 歲，平均年齡為（55.62±5.62）歲。在對(duì)照組患者中，有男32 例，女33 例；其年齡為21 ～80 歲，平均年齡為（55.17±5.38）歲。兩組患者的基線資料相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng) 采集標(biāo)本（包括痰液標(biāo)本、胸腔積液標(biāo)本、腹水標(biāo)本、尿液標(biāo)本、糞便標(biāo)本、組織標(biāo)本等），用羅氏培養(yǎng)基對(duì)標(biāo)本進(jìn)行培養(yǎng)，對(duì)培養(yǎng)結(jié)果進(jìn)行準(zhǔn)確的記錄，之后對(duì)培養(yǎng)得到的菌株進(jìn)行分離及鑒定。

1.2.2 外周血T-SPOT.TB 檢測(cè)所用的試劑盒為上海復(fù)星科技有限公司提供的試劑盒，基本操作流程如下：采集患者的外周靜脈血5 mL，將血液標(biāo)本置于枸櫞酸鈉抗凝試管中。分離外周血單核細(xì)胞，將細(xì)胞置于包被干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）的抗體微孔板上，用培養(yǎng)基濾過(guò)蛋白和結(jié)核分枝桿菌特異性抗原早期分泌的靶向抗原，在37 ℃的環(huán)境中培養(yǎng)24 h。洗去具有抗原致敏效應(yīng)的T 淋巴細(xì)胞，加入生物素標(biāo)記的二抗，經(jīng)酶聯(lián)顯色后于細(xì)胞因子分泌處形成斑點(diǎn)。檢驗(yàn)醫(yī)師通過(guò)記錄斑點(diǎn)數(shù)，對(duì)T 淋巴細(xì)胞的數(shù)量和結(jié)核分枝桿菌特異性抗原的致敏效應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果判斷如下：當(dāng)空白對(duì)照孔內(nèi)斑點(diǎn)數(shù)＜6 時(shí)，任何實(shí)驗(yàn)孔內(nèi)斑點(diǎn)數(shù)減去空白孔斑內(nèi)點(diǎn)數(shù)的結(jié)果≥6，則表示試驗(yàn)結(jié)果呈陽(yáng)性，反之則表示試驗(yàn)結(jié)果呈陰性；當(dāng)空白對(duì)照孔內(nèi)斑點(diǎn)數(shù)≥6 時(shí)，任何實(shí)驗(yàn)孔內(nèi)斑點(diǎn)數(shù)超過(guò)空白孔內(nèi)斑點(diǎn)數(shù)的2 倍，則表示試驗(yàn)結(jié)果呈陽(yáng)性，反之則表示試驗(yàn)結(jié)果呈陰性。

1.3 觀察指標(biāo)

比較兩組患者結(jié)核病的類型（肺結(jié)核和其他結(jié)核?。?。對(duì)兩組患者的年齡、體質(zhì)指數(shù)、病程、有無(wú)吸煙史、有無(wú)飲酒史、有無(wú)原發(fā)性疾病等一般資料進(jìn)行對(duì)比分析，總結(jié)導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌感染患者進(jìn)行T-SPOT.TB 結(jié)果呈陰性的危險(xiǎn)因素。比較兩組患者的各項(xiàng)血生化指標(biāo)，包括白細(xì)胞計(jì)數(shù)、血小板計(jì)數(shù)、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白和血漿白蛋白。白細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白的水平、血小板計(jì)數(shù)和血漿白蛋白的水平采用TOSHIBA accute-40 血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行檢測(cè)，淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)采用希森美康公司生產(chǎn)的sf3000 全自動(dòng)生化儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 21.0 軟件處理本研究中的數(shù)據(jù)，計(jì)量資料用±s表示，用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用% 表示，用χ2 檢驗(yàn)，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者結(jié)核病類型的對(duì)比

在觀察組患者中， 肺結(jié)核患者有47 例（ 占72.31%）， 其 他 結(jié) 核 病 患 者 有18 例（ 占27.69%）。在對(duì)照組患者中，肺結(jié)核患者有63 例（占96.92%），其他結(jié)核病患者有2 例（占3.08%）。觀察組患者肺結(jié)核的發(fā)病率低于對(duì)照組患者，其他結(jié)核病的發(fā)病率高于對(duì)照組患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌感染患者進(jìn)行T-SPOT.TB 結(jié)果呈陰性的危險(xiǎn)因素

在兩組患者中，有吸煙史、飲酒史及合并有原發(fā)性疾病患者的占比相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。觀察組患者中年齡≥65 歲患者的占比、體質(zhì)指數(shù)≥24 患者的占比和病程≥6 個(gè)月患者的占比均高于對(duì)照組患者中此類患者的占比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。詳見表1?？梢?，體重過(guò)重、高齡和病程超過(guò)6 個(gè)月可能是導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌感染患者進(jìn)行T-SPOT.TB 結(jié)果呈陰性的危險(xiǎn)因素。

表1 導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌感染患者進(jìn)行T-SPOT.TB 結(jié)果呈陰性的危險(xiǎn)因素[ 例（%）]

2.3 兩組患者各項(xiàng)血生化指標(biāo)的對(duì)比

兩組患者的白細(xì)胞計(jì)數(shù)及血小板計(jì)數(shù)相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。觀察組患者的淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白和血漿白蛋白的水平均低于對(duì)照組患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。詳見表2。

表2 兩組患者各項(xiàng)血生化指標(biāo)的對(duì)比（± s

表2 兩組患者各項(xiàng)血生化指標(biāo)的對(duì)比（± s

組別（n） 白細(xì)胞計(jì)數(shù)（×109/L）血紅蛋白（g/L）血小板計(jì)數(shù)（×109/L） 淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)（×109/L） 血漿白蛋白（g/L）觀察組（n=65） 7.65±3.51 120.26±5.05 232.56±6.52 0.98±1.85 32.50±5.62對(duì)照組（n=65） 7.45±3.23 132.92±5.67 233.64±6.67 1.86±1.62 35.62±5.75 t 值 0.338 13.443 0.934 2.885 3.129 P 值 0.736 ＜0.001 0.352 0.005 0.002

3 討論

目前臨床上診斷結(jié)核病的主要方式有免疫學(xué)檢查、影像學(xué)檢查、病理學(xué)檢查和病原學(xué)檢查等，不同的檢查方法均有其各自的優(yōu)勢(shì)和不足。例如，進(jìn)行病理學(xué)檢查需實(shí)施介入性操作，以此獲取組織標(biāo)本，有引發(fā)氣胸和出血的風(fēng)險(xiǎn)，患者普遍難以接受；進(jìn)行影像學(xué)檢查可對(duì)病灶的部位和大小進(jìn)行直觀地觀察，但診斷的準(zhǔn)確性不高且有射線輻射的風(fēng)險(xiǎn)；病原學(xué)檢查中的結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)（tuberculin skin test，TST）為體內(nèi)試驗(yàn)，診斷的敏感性較低，且純蛋白衍生物很有多種蛋白成分，與卡介苗和非結(jié)核分枝桿菌（NTM）存在交叉反應(yīng)，缺乏特異性[2-3]。病原學(xué)檢查中的T-SPOT.TB 為體外試驗(yàn)?；颊甙l(fā)生結(jié)核分枝桿菌感染后，其外周血中會(huì)產(chǎn)生特異性活化的效應(yīng)T 淋巴細(xì)胞，這些效應(yīng)T 淋巴細(xì)胞經(jīng)結(jié)核分枝桿菌特異性抗原ESAT-6、CFP-10 刺激后，可分泌IFN-γ，故進(jìn)行T-SPOT.TB 時(shí)通過(guò)體外檢測(cè)IFN-γ 的分泌情況可判斷機(jī)體是否感染結(jié)核分枝桿菌。ESAT-6和CFP-10 只存在于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群和少見的幾種結(jié)核分枝桿菌中，在卡介苗和大多數(shù)NTM中缺失，故用T-SPOT.TB 診斷結(jié)核分枝桿菌感染有著較高的敏感性和特異性。本研究中，對(duì)觀察組患者和對(duì)照組患者進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)的結(jié)果均呈陽(yáng)性，說(shuō)明其體內(nèi)均存在結(jié)核分枝桿菌活菌[4]。當(dāng)進(jìn)行T-SPOT.TB 的結(jié)果呈陽(yáng)性時(shí)，也不能確診患者發(fā)生結(jié)核分枝桿菌感染，還要考慮其是否存在NTM 感染。因此，臨床上應(yīng)將T-SPOT.TB 與菌種鑒定、病理學(xué)檢查等相結(jié)合來(lái)診斷結(jié)核分枝桿菌感染，特別是針對(duì)接受抗結(jié)核治療一段時(shí)間后肺部病灶無(wú)明顯吸收的患者，應(yīng)考慮其是否發(fā)生NTM 感染[5]。臨床研究表明，T 淋巴細(xì)胞免疫反應(yīng)與結(jié)核分枝桿菌的菌量負(fù)荷有著密切的聯(lián)系，活動(dòng)性肺結(jié)核患者體內(nèi)的T 淋巴細(xì)胞免疫反應(yīng)會(huì)隨著結(jié)核分枝桿菌菌量的增高與減少而產(chǎn)生相應(yīng)的變化。治療前，肺結(jié)核患者體內(nèi)結(jié)核分枝桿菌的菌量負(fù)荷越大，其T 淋巴細(xì)胞免疫反應(yīng)的水平就越高，治療后隨著患者體內(nèi)結(jié)核分枝桿菌菌量負(fù)荷的減少，其T 淋巴細(xì)胞免疫反應(yīng)的水平會(huì)逐漸下降[6-7]。綜上所述，結(jié)核病的診斷方式較多，但不少診斷方式的準(zhǔn)確性和特異性一般，而T-SPOT.TB 在結(jié)核病的診斷中被證實(shí)具有較高的價(jià)值。

本研究的結(jié)果證實(shí)，與進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)結(jié)果呈陽(yáng)性、外周血T-SPOT.TB 結(jié)果呈陽(yáng)性的患者相比，進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)結(jié)果呈陽(yáng)性、外周血T-SPOT.TB 結(jié)果呈陰性的患者肺結(jié)核的發(fā)病率較低，其他結(jié)核病的發(fā)病率較高，且其淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白和血漿白蛋白的水平均較低。體重過(guò)重、高齡和病程超過(guò)6 個(gè)月可能是導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌感染患者進(jìn)行T-SPOT.TB 結(jié)果呈陰性的危險(xiǎn)因素。