MEBT/MEBO 通過(guò)mTORC 信號(hào)通路對(duì)慢性難愈合創(chuàng)面MMP-3、 MMP-8 表達(dá)水平的影響

唐習(xí)強(qiáng) 韋 騁 王雪玲 包崇嬋 田馨如 葛星月 唐乾利

慢性難愈合創(chuàng)面是臨床常見的慢性疾病, 多由創(chuàng)傷、 燒傷、 手術(shù)及各種內(nèi)科疾病引起創(chuàng)面遷延不愈所致, 具有難治愈、 易復(fù)發(fā)等特點(diǎn), 可導(dǎo)致患者殘疾甚至死亡。 目前, 慢性難愈合創(chuàng)面的愈合機(jī)制尚不完全明確［1］, 部分研究學(xué)者認(rèn)為其修復(fù)效果與細(xì)胞外基質(zhì) (extracellular matrix, ECM) 的表達(dá)水平密切相關(guān), 且基質(zhì)金屬蛋白酶 (matrix metalloproteinase, MMP) 在慢性難愈合創(chuàng)面ECM 的動(dòng)態(tài)平衡中發(fā)揮了重要作用。 而皮膚再生醫(yī)療技術(shù)(moist exposed burn treatment/moist exposed burn ointment, MEBT/MEBO) 是近年來(lái)被廣泛應(yīng)用于急慢性創(chuàng)面治療的方法之一, 其因能夠促進(jìn)血管再生、 加快肉芽組織生長(zhǎng), 在多種原因?qū)е碌穆噪y愈合創(chuàng)面治療中取得了滿意的臨床療效［2－4］, 且具體的促進(jìn)創(chuàng)面愈合作用機(jī)制的相關(guān)研究也已有初步進(jìn)展, 但其與MMP-3、 MMP-8 的相關(guān)性研究卻鮮見報(bào)道［5－6］。 鑒于此, 本研究筆者研究探討了MEBT/MEBO 通過(guò)哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物(mammalian target of rapamycin complex, mTORC)信號(hào)通路對(duì)大鼠慢性難愈合創(chuàng)面組織中MMP-3、MMP-8 表達(dá)水平的影響, 現(xiàn)報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

12 周齡健康 SPF 級(jí)雄性 Wistar 大鼠60 只, 體質(zhì)量220 ～250 g, 均購(gòu)自長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司 ［許可證號(hào): SCXK (湘) 2014-0011］, 并飼養(yǎng)于清潔級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室內(nèi), 室溫控制在20 ～25 ℃,相對(duì)濕度控制在40% ～60%。 本研究經(jīng)右江民族醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑與設(shè)備

濕潤(rùn)燒傷膏 (moist exposed burn ointment,MEBO): 汕頭市美寶制藥有限公司生產(chǎn), 國(guó)藥準(zhǔn)字Z20000004； 重組牛堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(recombinant bovine basic fibroblast growth factor,rb-bFGF) 凝膠: 珠海億勝生物制藥有限公司生產(chǎn),國(guó)藥準(zhǔn)字S20040001； 醋酸氫化可的松注射液: 上海通用藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn), 國(guó)藥準(zhǔn)字H31021290； 蘇木素染色液BA-4041: 珠海貝索生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)； Masson 三色染色試劑盒G1340: 北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn)； 二氨基聯(lián)苯胺 (diaminobenzidin,DAB) 顯色劑ZLI-9018: 北京諾博萊德科技有限公司生產(chǎn)； MMP-3、 MMP-8 免疫組化試劑盒 (一抗): 美國(guó) Novus Biologicals 公司生產(chǎn)； MMP-3、MMP-8 免疫組化試劑盒 (二抗): 北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)； 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定 (enzyme linked immunosorbent assay, ELISA) 試劑盒: 上海酶聯(lián)生物科技有限公司生產(chǎn)； HS-3345 型組織切片機(jī): 北京萊博聯(lián)泰科技有限公司生產(chǎn)； VHX-7000 系列光學(xué)顯微鏡: 北京普瑞賽司儀器有限公司生產(chǎn)。

2 方法

2.1 模型制備與分組

將60 只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d 后, 按照隨機(jī)數(shù)表法將其隨機(jī)分為空白組、 對(duì)照組、 模型組、rb-bFGF組、 MEBO 組, 每組 12 只, 所有大鼠均于腹腔注射10%水合氯醛溶液麻醉后備皮； 對(duì)照組、模型組、 rb-bFGF 組、 MEBO 組在外科無(wú)菌條件下參照單云龍等［7］的造模方法于脊柱兩側(cè)做2 處類圓形深達(dá)筋膜的全層皮膚缺損創(chuàng)面, 建立急性創(chuàng)面模型； 繼而, 模型組、 rb-bFGF 組、 MEBO 組立即注射醋酸氫化可的松 (80 mg/100 g), 建立慢性難愈合創(chuàng)面模型。

2.2 局部處理

模型建立后, 空白組大鼠備皮處皮膚及對(duì)照組大鼠創(chuàng)面依次覆蓋生理鹽水紗布及無(wú)菌紗布包扎固定； 模型組、 rb-bFGF 組、 MEBO 組大鼠創(chuàng)面于1∶5000呋喃西林溶液清洗后, 模型組依次覆蓋生理鹽水紗布及無(wú)菌紗布包扎固定, rb-bFGF 組均勻涂抹rb-bFGF 后依次覆蓋rb-bFGF 藥紗及無(wú)菌紗布包扎固定, MEBO 組均勻涂抹MEBO 后依次覆蓋MEBO藥紗及無(wú)菌紗布包扎固定, 每天換藥2 次。

2.3 觀察創(chuàng)面愈合情況

分別于藥物干預(yù)第3、 7、 14 天, 在固定焦距下對(duì)創(chuàng)面進(jìn)行拍照, 并采用Image J 軟件測(cè)量創(chuàng)面面積, 計(jì)算創(chuàng)面愈合率。 創(chuàng)面愈合率＝ (初始創(chuàng)面面積－時(shí)相點(diǎn)創(chuàng)面面積) /初始創(chuàng)面面積×100%。

2.4 皮膚/創(chuàng)面組織病理學(xué)觀察

分別于藥物干預(yù)第3、 7、 14 天, 采集相同位點(diǎn)皮膚/創(chuàng)面組織常規(guī)予以脫水、 石蠟包埋、 切片、脫蠟后, 進(jìn)行Masson 染色 (嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書依次行核染液染色1 min、 沖洗液沖洗30 s、 質(zhì)染液染色 10 s、 沖洗液沖洗 30 s、 分化液分化8 min、 復(fù)染 3 min)、 100% 乙醇脫水、 二甲苯透明、 中性樹膠封片； 200 倍普通光學(xué)顯微鏡下觀察組織細(xì)胞情況。

2.5 Western blotting 法檢測(cè)皮膚/創(chuàng)面組織中MMP-3、 MMP-8、 mTORC 蛋白表達(dá)水平

分別于藥物干預(yù)第3、 7、 14 天, 采集相同位點(diǎn)皮膚/創(chuàng)面組織50 mg, 剪碎后于液氮中研磨至細(xì)粉末狀； 置于離心管中, 加入500 μl RIPA 裂解液后于4 ℃恒溫環(huán)境中充分反應(yīng)； 裂解完全后12000 r/min離心10 min, 取上層液體用Western blotting 法檢測(cè)MMP-3、 MMP-8、 mTORC 蛋白含量, Image J 圖像分析軟件分析蛋白條帶灰度值。

2.6 RT-PCR 技術(shù)檢測(cè)皮膚/創(chuàng)面組織中MMP-3、MMP-8、 mTORC mRNA 表達(dá)水平

分別于藥物干預(yù)第3、 7、 14 天, 采集相同位點(diǎn)皮膚/創(chuàng)面組織, 根據(jù)試劑盒說(shuō)明書采用Trizol法提取總RNA, 并在10 μl 反轉(zhuǎn)錄體系 (10 g DNA Eraser Buffer 1μl、 gDNA Eraser 0.5μl、 RNA Template 110 pg ～1 μg, 加 RNase-Free Water 至 10 μl)中反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 后進(jìn)行PCR 擴(kuò)增, 以GAPDH作為內(nèi)參基因, 采用2-△△Ct法計(jì)算 mRNA 相對(duì)表達(dá)量。 MMP-3 引物序列為 F: 5’-TCTGAAGGAGAGGC TGACATAAT-3’, R: 5’-AGTGAAAGAGACCCAGG GAGTG-3’； MMP-8 引物序列為 F: 5’-CGACTCTG GTGATTTCTTGCTA-3’, R: 5’-GTTGATGTCTGCTT CTCCCTCT-3’； mTORC 引物序列為 F: 5’-TTGGA GAACCAGCCCATAAGAAA-3’, R: 5’-TGAGAGAA ATCCCGACCAGTGA-3’； GAPDH 引物序列為 F:5’-CAAGTTCAACGGCACAGTCAA-3’, R: 5’-CAC AAACATGGGGGCATCAG-3’。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析, 符合正態(tài)分布的結(jié)果數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差() 表示, 多組間比較采用單因素方差分析,兩組間比較采用q檢驗(yàn), 均以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠創(chuàng)面愈合率對(duì)比

干預(yù)第 3 天, 對(duì)照組、 模型組、 rb-bFGF 組、MEBO 組組間創(chuàng)面愈合率對(duì)比, 除rb-bFGF 組明顯高于模型組 (P＜0.05) 外, 其余各組間均無(wú)明顯差異 (P均 ＞0.05)； 干預(yù)第 7、 14 天, 對(duì)照組、rb-bFGF 組、 MEBO 組大鼠創(chuàng)面愈合率均明顯高于模型組 (P均＜0.05), 詳見表1。

表1 各組大鼠創(chuàng)面愈合率對(duì)比 （%， ）Table 1 Comparison of wound healing rates between different groups （%，）

表1 各組大鼠創(chuàng)面愈合率對(duì)比 （%， ）Table 1 Comparison of wound healing rates between different groups （%，）

注: rb-bFGF 為重組牛堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子, MEBO 為濕潤(rùn)燒傷膏； 對(duì)照組與模型組采用生理鹽水紗布換藥處理, rb-bFGF組采用rb-bFGF 換藥處理, MEBO 組采用MEBO 換藥處理。 各組大鼠創(chuàng)面愈合率組間兩兩對(duì)比, 其中與對(duì)照組對(duì)比, aP ＜0.05, 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義； 與模型組對(duì)比, bP ＜0.05, 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義Note: rb-bFGF: recombinant bovine basic fibroblast growth factor,MEBO: moist exposed burn ointment； Control group and model group were managed with dressing change of normal saline gauzes, rb-bFGF group and MEBO group were respectively managed with dressing change of rb-bFGF and MEBO. The wound healing rates of rats in each group were compared between every two of the four groups, and statistically significant differences were observed as compared with control group (aP ＜0.05)and with model group (bP ＜0.05)

組別Group只數(shù)Number of rats第3 天Day 3第7 天Day 7第14 天Day 14對(duì)照組Control group 12 10.26 ± 1.95 48.29 ± 2.56 84.39 ± 5.68模型組Model group 12 9.02 ± 1.08 35.55 ± 3.39a 77.25 ± 6.28a rb-bFGF 組rb-bFGF group 12 11.03 ± 2.21b 49.62 ± 1.95b 86.28 ± 5.53b MEBO 組MEBO group 12 10.15 ± 1.86 49.52 ± 2.13b 86.55 ± 5.26b F 值F value 2.474 84.700 6.997 P 值P value 0.074 ＜0.001 ＜0.001

3.2 各組大鼠皮膚/創(chuàng)面組織病理學(xué)變化

干預(yù)第3 天, 模型組、 rb-bFGF 組及 MEBO 組大鼠創(chuàng)面組織形態(tài)相似, 均有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn), 組織水腫明顯, 無(wú)新生毛細(xì)血管。 干預(yù)第7 天, rb-bFGF組和MEBO 組大鼠創(chuàng)面組織中炎癥細(xì)胞明顯減少,可見新生毛細(xì)血管及毛囊結(jié)構(gòu)； 模型組大鼠創(chuàng)面組織中炎癥細(xì)胞未見明顯減少, 且新生毛細(xì)血管較少。 干預(yù)第 14 天, rb-bFGF 組和 MEBO 組大鼠創(chuàng)面組織中可見毛細(xì)血管、 成熟皮脂腺和毛囊緊密排列； 模型組大鼠創(chuàng)面組織中炎癥細(xì)胞明顯較少, 而成纖維細(xì)胞明顯增多, 詳見圖1。

圖1 干預(yù)第3、 7、 14 天, 各組大鼠皮膚/創(chuàng)面組織Masson 染色圖 ( ×200)Fig.1 Masson staining images of rat skin or wound tissues in each group respectively on day 3,7 and 14 of interventions ( ×200)

3.3 各組大鼠皮膚/創(chuàng)面組織中MMP-3、 MMP-8、p-mTORC 蛋白表達(dá)水平對(duì)比

干預(yù)第 3、 7、 14 天, 對(duì)照組、 rb-bFGF 組、MEBO 組 大 鼠 創(chuàng) 面 組 織 中 MMP-3、 MMP-8、p-mTORC蛋白表達(dá)水平均呈先升高后降低的趨勢(shì),而模型組呈持續(xù)升高的趨勢(shì)； 干預(yù)第 3、 7 天,rb-bFGF組和 MEBO 組大鼠創(chuàng)面組織中 MMP-3、MMP-8、 p-mTORC 蛋白表達(dá)水平均明顯高于模型組 (P均 ＜0.05), 且 rb-bFGF 組 MMP-3、 MMP-8蛋白表達(dá)水平均明顯低于MEBO 組 (P均＜0.05)；而干預(yù)第14 天, rb-bFGF 組和MEBO 組大鼠創(chuàng)面組織中MMP-3、 MMP-8、 p-mTORC蛋白表達(dá)水平均明顯低于模型組 (P均 ＜0.05), 且 rb-bFGF 組和MEBO 組間無(wú)明顯差異 (P均＞0.05), 詳見表2、圖2。

圖2 各組大鼠皮膚/創(chuàng)面組織中MMP-3、 MMP-8、 p-mTORC 蛋白表達(dá)水平條帶圖Fig.2 Histogram of expression levels of MMP-3, MMP-8 and p-mTORC in rat skin or wound tissues in each group

表2 各組大鼠皮膚/創(chuàng)面組織中MMP-3、 MMP-8、 p-mTORC 蛋白表達(dá)水平對(duì)比 （）Table 2 Comparison of expression levels of MMP-3， MMP-8 and p-mTORC in rat skin or wound tissues between different groups （）

表2 各組大鼠皮膚/創(chuàng)面組織中MMP-3、 MMP-8、 p-mTORC 蛋白表達(dá)水平對(duì)比 （）Table 2 Comparison of expression levels of MMP-3， MMP-8 and p-mTORC in rat skin or wound tissues between different groups （）

注: rb-bFGF 為重組牛堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子, MEBO 為濕潤(rùn)燒傷膏, MMP-3 為基質(zhì)金屬蛋白酶-3, MMP-8 為基質(zhì)金屬蛋白酶-8,mTORC 為哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物； 空白組、 對(duì)照組與模型組采用生理鹽水紗布換藥處理, rb-bFGF 組采用rb-bFGF 換藥處理,MEBO組采用 MEBO 換藥處理。 各組大鼠創(chuàng)面組織中 MMP-3、 MMP-8、 p-mTORC 蛋白表達(dá)水平組間兩兩對(duì)比, 其中與空白組對(duì)比,aP ＜0.05, 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義； 與對(duì)照組對(duì)比, bP ＜0.05, 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義； 與模型組對(duì)比, cP ＜0.05, 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義； 與rb-bFGF組對(duì)比, dP ＜0.05, 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義Note: rb-bFGF: recombinant bovine basic fibroblast growth factor,MEBO:moist exposed burn ointment,MMP-3:matrix metalloproteinase-3,MMP-8:matrix metalloproteinase-8, mTORC: mammalian target of rapamycin complex； Blank group, control group and model group were managed with dressing change of normal saline gauzes, rb-bFGF group and MEBO group were respectively managed with dressing change of rb-bFGF and MEBO. The expression levels of MMP-3, MMP-8 and p-mTORC in rat skin or wound tissues in each group were compared between every two of the five groups, and statistically significant differences were observed as compared with blank group (aP ＜ 0.05), control group (bP ＜ 0.05), model group (cP ＜ 0.05) and rb-bFGF group (dP ＜0.05)

組別Group只數(shù)Number of rats MMP-3MMP-8p-mTORC第3 天Day 3第7 天Day 7第14 天Day 14第3 天Day 3第7 天Day 7第14 天Day 14第3 天Day 3第7 天Day 7第14 天Day 14 Blank group 12 0.15 ±0.03空白組0.18 ±0.03 0.12 ±0.01 0.23 ±0.05 0.21 ±0.05 0.14 ±0.03 0.07 ±0.01 0.09 ±0.02 0.11 ±0.01 Control group 12 0.70 ±0.03a 0.98 ±0.06a對(duì)照組0.47 ±0.04a 0.61 ±0.05a 0.60 ±0.09a 0.41 ±0.06a 0.31 ±0.03a 0.58 ±0.05a Model group 12 0.37 ±0.04ab 0.64 ±0.05ab rb-bFGF 組0.27 ±0.04a模型組0.49 ±0.04ab 0.75 ±0.06ab 0.31 ±0.02ab 0.33 ±0.04ab 0.60 ±0.03ab 0.18 ±0.03ab 0.35 ±0.03ab rb-bFGF group 12 0.56 ±0.02abc 0.27 ±0.02ac MEBO 組0.91 ±0.04abc 0.43 ±0.07ac 0.52 ±0.02abc 0.59 ±0.08ac 0.40 ±0.05ac 0.34 ±0.03abc 0.47 ±0.06abc MEBO group 12 0.67 ±0.02abcd 0.30 ±0.04ac F 值F value 755.000 858.258 235.606 273.097 104.243 169.137 201.136 191.564 367.452 1.01 ±0.04acd 0.44 ±0.05ac 0.57 ±0.02abcd 0.66 ±0.06acd 0.38 ±0.04ac 0.35 ±0.04abc 0.47 ±0.06abc P 值P value ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

3.4 各組大鼠皮膚/創(chuàng)面組織中MMP-3、 MMP-8、mTORC mRNA 表達(dá)水平對(duì)比

干預(yù)第 3、 7、 14 天, 對(duì)照組、 rb-bFGF 組、MEBO 組大鼠創(chuàng)面組織中 MMP-3、 MMP-8 mRNA 表達(dá)水平均呈先升高后降低的趨勢(shì), 而模型組呈持續(xù)升高的趨勢(shì)； 干預(yù)第3、 7 天, rb-bFGF 組和 MEBO組大鼠創(chuàng)面組織中 MMP-3、 MMP-8 mRNA 表達(dá)水平均明顯高于模型組 (P＜0.05), 而干預(yù)第14 天,rb-bFGF 組和 MEBO 組大鼠創(chuàng)面組織中 MMP-3、MMP-8 mRNA 表達(dá)水平均明顯低于模型組 (P均＜0.05), 且 rb-bFGF 組和 MEBO 組間無(wú)明顯差異(P均 ＞ 0.05)； 干預(yù)第 3、 7、 14 天, 各組大鼠創(chuàng)面組織中mTORC mRNA 表達(dá)水平均無(wú)明顯變化(P均 ＞0.05), 詳見表 3。

表3 各組大鼠皮膚/創(chuàng)面組織中MMP-3、 MMP-8、 mTORC mRNA 表達(dá)水平對(duì)比 （）Table 3 Comparison of expression levels of mRNA of MMP-3， MMP-8 and mTORC in rat skin or wound tissues between different groups （）

表3 各組大鼠皮膚/創(chuàng)面組織中MMP-3、 MMP-8、 mTORC mRNA 表達(dá)水平對(duì)比 （）Table 3 Comparison of expression levels of mRNA of MMP-3， MMP-8 and mTORC in rat skin or wound tissues between different groups （）

注: rb-bFGF 為重組牛堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子, MEBO 為濕潤(rùn)燒傷膏, MMP-3 為基質(zhì)金屬蛋白酶-3, MMP-8 為基質(zhì)金屬蛋白酶-8,mTORC 為哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物； 空白組、 對(duì)照組與模型組采用生理鹽水紗布換藥處理, rb-bFGF 組采用rb-bFGF 換藥處理,MEBO組采用MEBO 換藥處理。 各組大鼠創(chuàng)面組織中MMP-3、 MMP-8、 mTORC mRNA 表達(dá)水平組間兩兩對(duì)比, 其中與空白組對(duì)比, aP ＜0.05,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義； 與對(duì)照組對(duì)比, bP ＜0.05, 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義； 與模型組對(duì)比, cP ＜0.05, 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義Note: rb-bFGF: recombinant bovine basic fibroblast growth factor,MEBO:moist exposed burn ointment,MMP-3:matrix metalloproteinase-3,MMP-8:matrix metalloproteinase-8, mTORC: mammalian target of rapamycin complex； Blank group, control group and model group were managed with dressing change of normal saline gauzes, rb-bFGF group and MEBO group were respectively managed with dressing change of rb-bFGF and MEBO. The expression levels of mRNA of MMP-3,MMP-8 and mTORC in rat skin or wound tissues in each group were compared between every two of the five groups,and statistically significant differences were observed as compared with blank group (aP ＜ 0.05), control group (bP ＜ 0.05) and model group (cP ＜ 0.05)

組別Group只數(shù)Number of rats MMP-3MMP-8mTORC第3 天Day 3第7 天Day 7第14 天Day 14第3 天Day 3第7 天Day 7第14 天Day 14第3 天Day 3第7 天Day 7第14 天Day 14 Blank group 12 0.98 ±0.10空白組1.20 ±0.12 1.01 ±0.11 1.08 ±0.14 1.16 ±0.09 0.99 ±0.13 1.07 ± 0.12 1.10 ± 0.13 0.99 ± 0.11 Control group 12 2.30 ±0.17a對(duì)照組3.47 ±0.25a 1.81 ±0.17a 2.85 ±0.27a 4.31 ±0.27a 1.98 ±0.14a 1.24 ± 0.14 1.28 ± 0.08 1.19 ± 0.09 Model group 12 1.30 ±0.12ab模型組2.05 ±0.21ab 2.61 ±0.15ab 1.56 ±0.19ab 2.55 ±0.30ab 3.32 ±0.25ab 1.24 ± 0.07 1.30 ± 0.15 1.09 ± 0.11 rb-bFGF group 12 2.08 ±0.19abc rb-bFGF 組3.24 ±0.21abc 1.76 ±0.12ac 2.62 ±0.29ac 4.00 ±0.28abc 1.91 ±0.14ac 1.15 ± 0.13 1.19 ± 0.14 1.20 ± 0.14 MEBO group 12 1.97 ±0.20abc MEBO 組3.12 ±0.32abc 1.80 ±0.07ac 2.69 ±0.35ac 4.03 ±0.16abc 1.82 ±0.22abc 1.02 ± 0.12 1.21 ± 0.14 1.06 ± 0.09 F 值F value 145.168 207.371 232.225 111.650 389.705 251.795 8.402 4.468 7.930 P 值P value ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 0.003 ＜0.001

4 討論

MEBT/MEBO 是以 MEBO 為核心藥物、 生理性濕潤(rùn)環(huán)境為基礎(chǔ)的創(chuàng)面再生醫(yī)療技術(shù), 可加快壞死組織液化排除, 擴(kuò)張創(chuàng)面毛細(xì)血管, 促進(jìn)創(chuàng)面組織原位再生, 進(jìn)而加速創(chuàng)面愈合［8－9］, 在各種慢性難愈合創(chuàng)面的治療中取得了顯著療效［10］。 相關(guān)研究顯示, MMP-3、 MMP-8 可通過(guò)參與創(chuàng)面修復(fù)過(guò)程中血管基底膜的降解與重塑［11－13］, 促進(jìn)血管生芽,從而促使新生血管形成, 在創(chuàng)面組織修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用［14－15］。 本研究筆者為進(jìn)一步探究MEBO 在慢性難愈合創(chuàng)面中的作用機(jī)制, 觀察了MEBO 通過(guò)mTORC 信號(hào)通路對(duì)大鼠慢性難愈合創(chuàng)面組織中MMP-3、 MMP-8 表達(dá)水平的影響。

創(chuàng)面修復(fù)過(guò)程中需要大量對(duì)創(chuàng)面愈合至關(guān)重要的蛋白質(zhì), 而參與調(diào)控蛋白質(zhì)翻譯、 細(xì)胞增殖和分化及血管生成作用的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路一旦異常, 可阻礙創(chuàng)面愈合。 mTORC 是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一, 具有調(diào)控核酸轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)翻譯等作用,可在細(xì)胞生長(zhǎng)、 存活、 增殖、 凋亡和血管生成等多項(xiàng)活動(dòng)中發(fā)揮作用［16］。 如研究發(fā)現(xiàn), mTORC 可通過(guò)激活磷脂酰肌醇-3-羥激酶并對(duì)蛋白激酶產(chǎn)生磷酸化作用而進(jìn)一步活化下游分子mTORC1, 參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、 代謝及血管的新生； 活化后的mTORC可快速磷酸化真核細(xì)胞翻譯起始因子4E 結(jié)合蛋白1 (eIF4E-binding protein 1, 4E-BP1) 和調(diào)節(jié)因子核糖體蛋白S6 激酶, 進(jìn)而激活效應(yīng)蛋白S6K1, 促進(jìn)mRNA 基因轉(zhuǎn)錄, 且磷酸化的4E-BP1 可快速失活、 分離并釋放出真核細(xì)胞翻譯起始因子 4E(eukaryotic initiation factor 4E, eIF4E), 再結(jié)合eIF4A 和eIF4G 形成三聚體 eIF4F, 進(jìn)而啟動(dòng)蛋白質(zhì)翻譯, 促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成［17－19］。 本研究結(jié)果顯示, 干預(yù)第3、 7 天 rb-bFGF 組和 MEBO 組大鼠創(chuàng)面組織中MMP-3、 MMP-8 蛋白及 mRNA 表達(dá)水平均高于模型組, 至干預(yù)第14 天恢復(fù)至近似生理水平, 而模型組卻呈持續(xù)升高的狀態(tài), 且干預(yù)第7、14 天rb-bFGF 組和MEBO 組大鼠創(chuàng)面愈合率明顯高于模型組、 新生毛細(xì)血管明顯多于模型組、 炎癥細(xì)胞明顯少于模型組。 可見, 大鼠慢性難愈合創(chuàng)面應(yīng)用rb-bFGF 和MEBO 治療, 可快速增加創(chuàng)面組織中 MMP-3、 MMP-8 蛋白及其 mRNA 表達(dá)水平, 從而加速創(chuàng)面愈合。 本研究結(jié)果還顯示, rb-bFGF 組和 MEBO 組大鼠創(chuàng)面組織中 MMP-3、 MMP-8、p-mTORC蛋白及 MMP-3、 MMP-8 mRNA 表達(dá)水平均呈先升高后降低的趨勢(shì), 而模型組則呈持續(xù)升高的趨勢(shì)。 可見, 大鼠慢性難愈合創(chuàng)面形成初期, 在慢性創(chuàng)面信號(hào)的持續(xù)刺激下, mTORC 信號(hào)通路激活受阻, 影響了創(chuàng)面組織修復(fù)的相關(guān)生物學(xué)進(jìn)程,與李利青等［20］的研究結(jié)果相似； 而經(jīng)過(guò) rb-bFGF、MEBO 治療后的慢性難愈合創(chuàng)面mTORC 信號(hào)通路逐漸被激活, MMP-3、 MMP-8、 p-mTORC 蛋白表達(dá)水平逐漸升高, 考慮與mTORC 信號(hào)通路激活后可促進(jìn) MMPs 的表達(dá)有關(guān)［21－22］。 此外, 本研究結(jié)果顯示, 干預(yù)第3、 7 天 MEBO 組大鼠創(chuàng)面組織中MMP-3、 MMP-8 蛋白表達(dá)水平均明顯高于rb-bFGF組, 而干預(yù)第 3、 7、 14 天 rb-bFGF 組和 MEBO 組大鼠創(chuàng)面組織中 MMP-3、 MMP-8 mRNA 表達(dá)水平均無(wú)明顯差異, 說(shuō)明MEBO 促進(jìn)創(chuàng)面愈合的效果可能更好, 而兩組間干預(yù)第3、 7 天 MMP-3、 MMP-8蛋白與mRNA 表達(dá)水平不一致可能與本研究樣本量較小有關(guān), 有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

綜上所述, MEBT/MEBO 可通過(guò)調(diào)控mTORC信號(hào)通路增加創(chuàng)面組織中MMP-3 和MMP-8 的表達(dá)水平, 進(jìn)而促進(jìn)慢性難愈合創(chuàng)面的愈合。