水果中葡萄糖、果糖、蔗糖和山梨醇的測定*

匡立學(xué)，聶繼云，徐國鋒，李 靜，張建一，高貫威，程 楊

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部果品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室（興城），農(nóng)業(yè)農(nóng)村部果品及苗木質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心（興城），遼寧興城125100）（2 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)）

我國是水果生產(chǎn)大國，面積、產(chǎn)量均居世界第一[1-5]。根據(jù)國家統(tǒng)計局?jǐn)?shù)據(jù)，2019 年全國水果產(chǎn)量為2.568 8 億t[6]。水果中含有各類的糖類、有機(jī)酸、芳香物質(zhì)、維生素以及礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分，其中糖類占比對了解水果的風(fēng)味特征、綜合評價水果產(chǎn)品質(zhì)量都有重要意義[7-10]。葡萄糖、果糖、蔗糖和山梨醇是水果的主要糖組分，其含量與組成是水果營養(yǎng)和風(fēng)味的重要評價指標(biāo)[11-14]。4 種糖均為可溶性糖，其中，蔗糖為非還原糖，其余3 種為還原糖。4 種糖的甜度差異很大，分別為1.75、1、0.75 和0.4[15-18]。只有獲得水果中4 種糖組分的準(zhǔn)確含量數(shù)據(jù)，才能進(jìn)行水果營養(yǎng)和甜酸風(fēng)味的準(zhǔn)確評價。高效、準(zhǔn)確、穩(wěn)定的糖組分含量檢測方法將為水果糖組分測定和水果風(fēng)味評價提供重要的技術(shù)支撐。雖然我國制定有《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖的測定》（GB 5009.8—2016），但其測定參數(shù)不包括山梨醇[19]。同時，水果是有生命的活體，含有蔗糖轉(zhuǎn)化酶，采用該方法檢測時，樣品提取和樣液制備過程中蔗糖會水解轉(zhuǎn)化為葡萄糖和果糖，導(dǎo)致測定結(jié)果嚴(yán)重失真，無法準(zhǔn)確進(jìn)行水果營養(yǎng)和風(fēng)味評價。

鑒于此，筆者對水果中葡萄糖、果糖、蔗糖和山梨醇含量的測定開展了研究，根據(jù)不同種類的水果中各種糖組分含量的不同，選擇蘋果、梨、桃、李、藍(lán)莓、葡萄、橙、香蕉、火龍果和龍眼10 種代表性水果為試材，所選試樣涵蓋仁果類、核果類、漿果類、柑橘類和熱帶水果。并對前處理方法包括樣品制備方式、提取方式以及提取時間等方面進(jìn)行了優(yōu)化，以確保檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠。該研究旨在為水果中葡萄糖、果糖、蔗糖和山梨醇含量測定方法標(biāo)準(zhǔn)的制定提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

ICS-5000 多功能離子色譜儀（賽默飛世爾科技有限公司）；分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；冷凍研磨儀（德國萊馳公司）；超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；離心機(jī)（天美儀拓實驗室設(shè)備（上海）有限公司）。葡萄糖、果糖、蔗糖和山梨醇（純度為99%，美國Sigma 公司）；甲醇、50%氫氧化鈉溶液（色譜純，默克公司）。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制：分別稱取葡萄糖、果糖、蔗糖、山梨醇各50 mg 于4 個50 mL 容量瓶中，用水溶解并定容，配制成1.0 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制：分別量取0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 葡萄糖、果糖、蔗糖標(biāo)準(zhǔn)儲備液和0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL 山梨醇標(biāo)準(zhǔn)儲備液于6 個100 mL 容量瓶中，用水稀釋至刻度，配制成4 種糖組分的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中葡萄糖、果糖、蔗糖的濃度分別為5.0、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0 mg/L，山梨醇的濃度分別為2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 mg/L。

1.3 試樣的測定

稱取5.0 g 處理后的試樣于離心管中，加入提取劑，提取后的試樣用9 000 r/min 的離心機(jī)離心15 min，將上清液轉(zhuǎn)移至50 mL 容量瓶中，定容，得到樣品提取液。吸取1.0 mL 樣品提取液于50 mL 容量瓶中，用水定容至刻度進(jìn)行稀釋。依次用5 mL甲醇和5 mL 水預(yù)淋洗、活化固相萃取小柱。吸取5.0 mL 稀釋后的樣品提取液加入活化好的固相萃取小柱，棄去2 mL 初始濾液，收集濾液供離子色譜分析測定。

1.4 色譜條件

色譜柱：陰離子交換柱（PA10），250 mm×4.0 mm；柱溫：30 ℃；流動相：流動相A 為水，流動相B 為200 mmol/L 氫氧化鈉溶液；流速：1 mL/min；洗脫程序按表1 設(shè)置。

表1 洗脫程序

1.5 試驗設(shè)計

單因素試驗：以葡萄糖、果糖、蔗糖、山梨醇含量為指標(biāo)，分別考察試樣制備方式（勻漿和冷凍研磨）、提取溶劑（水提和醇提）、提取方式（水浴和超聲）對蘋果樣品中4 種糖組分含量的影響。

多因素試驗：在單因素試驗的基礎(chǔ)上，對不同影響因素進(jìn)行組合試驗，比較樣品不同前處理方式對檢測結(jié)果的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理方法的優(yōu)化

樣品的前處理主要包括樣品的制備和提取，根據(jù)參考文獻(xiàn)，果品中的營養(yǎng)功能組分的測定常采用勻漿和冷凍研磨2 種試樣制備方式，提取溶劑常為水提和醇提，提取方式常采用水浴和超聲2 種[20-22]。因80 ℃水浴提取會造成甲醇揮發(fā)，所以醇提只采用超聲方式。為了進(jìn)一步優(yōu)化試驗方案，我們首先以蘋果為試材對不同提取方式下的提取時間對糖組分提取效果的影響進(jìn)行了研究。

2.1.1 水浴不同提取時間對糖組分提取效果的影響

取24 個50 mL 塑料離心管，每個離心管稱取5 g 冷凍研磨的蘋果樣品，加水定容至50 mL，分別置于80 ℃和20 ℃水浴下提取，提取時間分別為10、20、30、40 min，提取后進(jìn)行離心、稀釋、過濾后上機(jī)測定。

比較不同提取時間對水果中糖組分含量的影響，并進(jìn)行差異顯著性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)水浴的不同提取時間對山梨醇含量的提取測定并無顯著差異；80 ℃水浴提取的葡萄糖含量顯著高于20 ℃提取的，80 ℃水浴下不同提取時間的葡萄糖含量并無顯著差異；80 ℃水浴10 min 和水浴20 min 的果糖含量略高于其他處理，顯著高于20 ℃水浴10 min提取含量，80 ℃水浴10 min 和水浴20 min 的果糖含量無顯著差異，但20 min 提取時平行樣之間的標(biāo)準(zhǔn)差較小，重復(fù)性好；80 ℃水浴20 min 蔗糖含量最高，提取效果最好。因此確定20 min 為其最佳水浴時間（表2）。

表2 水浴不同提取時間對蘋果樣品中糖組分含量的影響

2.1.2 超聲不同提取時間對糖組分提取效果的影響

取24 個50 mL 塑料離心管，每個離心管稱取5 g 冷凍研磨的蘋果樣品，12 個加水定容至50 mL，其余12 個加甲醇定容至50 mL，40 kHz 的頻率下室溫超聲提取，超聲時間分別10、20、30、40 min，提取后進(jìn)行離心、稀釋、過濾后上機(jī)測定。

試驗結(jié)果進(jìn)行差異顯著性分析，發(fā)現(xiàn)無論水提還是醇提，不同超聲時間下果糖、蔗糖和山梨醇含量并無顯著差異，超聲20、30、40 min 下葡萄糖含量無顯著差異（表3）。因此確定20 min 為其最佳超聲時間。

表3 不同超聲時間對蘋果樣品中糖組分含量的影響

2.1.3 不同前處理方式對糖組分提取效果的影響

通過前期的研究結(jié)果，我們確定了水浴和超聲的最佳提取時間均為20 min。在此基礎(chǔ)上，選用蘋果、李和藍(lán)莓為試材，進(jìn)一步比較了冷凍研磨和勻漿不同樣品制備方法、水提和甲醇2 種提取溶劑，以及20 min 超聲和80 ℃20 min 水浴的不同組合對果品中糖組分含量的影響，并進(jìn)行差異顯著性分析（表4）。因80 ℃水浴提取會造成甲醇揮發(fā)，所以醇提只采用超聲方式。

表4 不同前處理方式對糖組分含量的影響

由表4 可知，蘋果和李中4 種糖組分均有檢出，藍(lán)莓中未檢出山梨醇。對于同一種試材，不同提取方式下山梨醇含量無顯著差異，表明山梨醇很穩(wěn)定。對于蘋果樣品，研磨醇提超聲處理的葡萄糖和果糖含量顯著低于勻漿水提水浴處理的葡萄糖和果糖含量，研磨醇提超聲處理的蔗糖含量顯著高于勻漿水提水浴處理的蔗糖含量，其他處理間無顯著差異。對于李樣品，在樣品制備方式和提取方式一致的情況下，甲醇提取的葡萄糖和果糖含量顯著低于水提處理的葡萄糖和果糖含量，蔗糖含量顯著高于水提處理的蔗糖含量。對于藍(lán)莓樣品，不同處理間葡萄糖和果糖含量均無顯著差異，研磨醇提超聲處理的蔗糖含量為3.9 g/kg，其他處理方式均未檢出蔗糖。分析原因，可能是由于新鮮果實中存在蔗糖酶，在勻漿或前處理提取過程中酶發(fā)揮作用，造成蔗糖分解成葡萄糖和果糖，甲醇會使酶固化，活性降低或消失，所以，研磨醇提超聲處理方式蔗糖含量高于其他處理。不同的水果中蔗糖酶的含量和作用效果均不相同，對于蘋果樣品，勻漿和用水提取過程中蔗糖均會有少量分解，但差異不顯著。對于李樣品，勻漿過程中影響不明顯，用水提取過程中蔗糖含量減少明顯。對于藍(lán)莓樣品，因為藍(lán)莓樣品本身蔗糖含量較低，勻漿和用水提取過程中蔗糖均會完全分解，并且分解后葡萄糖和果糖含量增加得并不顯著。在樣品處理方式和提取溶劑一致的情況下，水浴和超聲2 種不同提取方式對水果中4 種糖組分含量無影響。綜合以上研究結(jié)果，試驗中最終確定研磨醇提超聲處理方式作為樣品前處理方式。

2.2 方法的線性

對4 種糖組分的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定，由低濃度到高濃度進(jìn)樣。每一濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液重復(fù)進(jìn)樣3 針，分別做4 種糖組分的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出回歸方程和相關(guān)系數(shù)。試驗表明這4 種糖組分在2～50 mg/L 范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)在0.999 2 以上（圖1～圖4）。

圖1 葡萄糖線性關(guān)系

圖2 果糖線性關(guān)系

圖3 蔗糖線性關(guān)系

圖4 山梨醇線性關(guān)系

2.3 方法的準(zhǔn)確度與精密度

選擇蘋果、桃、葡萄、橙、龍眼5 種有代表性水果為試材，分別對4 種糖組分進(jìn)行2、10、50 g/kg 3 種水平的添加回收率試驗，每個處理3 個平行進(jìn)行準(zhǔn)確度評價。結(jié)果表明，4 種糖組分在水果中添加回收率范圍在81.2%～113.1%（表5）。對蘋果、桃、葡萄、橙、龍眼每個樣品進(jìn)行5 次平行試驗，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差進(jìn)行精密度試驗，結(jié)果表明，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.8%～3.5%?？梢娫摲椒ǖ臏?zhǔn)確度和精密度良好，能滿足實際檢測需要。

表5 葡萄糖、果糖、蔗糖和山梨醇添加回收率

2.4 實際樣品的測定

采用本方法對市售的蘋果、梨、桃、李、藍(lán)莓、葡萄、橙、香蕉、火龍果和龍眼10 種水果進(jìn)行前處理后上機(jī)測定，葡萄糖、果糖、蔗糖和山梨醇的保留時間分別為6.600、7.584、10.450、2.117 min（圖5）。4 種糖組分含量具體見表6。

圖5 水果中4 種糖組分色譜圖

表6 水果樣品中4 種糖組分含量

3 討論與結(jié)論

本研究采用離子色譜法對水果中葡萄糖、果糖、蔗糖和山梨醇含量進(jìn)行了分析測定，并對樣品的制備方式、提取方式、提取溶劑和提取時間進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明，研磨醇提超聲處理方式作為樣品最佳的前處理方式。原因可能是因為樣品經(jīng)過冷凍研磨后提取得更充分，冷凍加醇提取的過程中使與糖分解有關(guān)的酶失活，抑制了糖組分的分解。此外，本研究還進(jìn)行了方法學(xué)驗證，方法的線性、精密度、準(zhǔn)確度等指標(biāo)的考察結(jié)果表明，4 種糖組分在2～50 mg/L 的范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)在0.999 2 以上。4 種糖組分在水果中添加回收率范圍81.2%～113.1%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差1.8%～3.5%。反映本標(biāo)準(zhǔn)方法具有良好的準(zhǔn)確性，能滿足實際檢測需要。該方法準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好，適用于各種水果中葡萄糖、果糖、蔗糖和山梨醇含量的測定。