細(xì)菌纖維素/明膠復(fù)合止血海綿的制備與性能研究

萬(wàn) 嘉，吳擢彤，王寶秀，韓志良，陳仕艷

(東華大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，纖維材料改性國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201620)

血液是人體的重要組成部分，在人體內(nèi)起到運(yùn)輸營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和廢物、調(diào)節(jié)人體滲透壓和酸堿平衡、調(diào)節(jié)體溫等功能[1]。研究表明，過(guò)度失血導(dǎo)致的死亡占全世界死亡率的30%[2]。因此，若是能夠在救援人員到達(dá)之前使用高效的止血材料快速止血，減少傷者血液流失，其存活率可大大提高。

BC具有純度高、可再生、生物相容性好等優(yōu)良特性[3]，廣泛應(yīng)用于醫(yī)用材料。由于BC具有很強(qiáng)的分子間氫鍵及高結(jié)晶度[4]，這使其具有良好的力學(xué)性能，如高拉伸強(qiáng)度和彈性模量[5]，可以應(yīng)用于各種復(fù)合材料中提升其力學(xué)性能[6]。目前已有許多學(xué)者將其作為增強(qiáng)材料應(yīng)用于聚合物復(fù)合材料的合成與制備中，得到了性能優(yōu)異的復(fù)合材料[7]。明膠海綿是一種常見(jiàn)的醫(yī)用止血材料，具有疏松的三維立體多孔結(jié)構(gòu)，可以吸收傷口處的血液，自身體積膨脹對(duì)傷口進(jìn)行機(jī)械壓迫或填塞，達(dá)到止血效果，但明膠止血海綿的結(jié)構(gòu)疏松，力學(xué)性能不好，用作敷料時(shí)創(chuàng)面的黏合能力不強(qiáng)[8]。

因此，本研究使用EPTAC對(duì)BC進(jìn)行季銨化改性[9]，使BC可以通過(guò)陽(yáng)離子凝聚血紅細(xì)胞形成血栓促進(jìn)止血，將其與明膠(Gel)進(jìn)行復(fù)合制備止血海綿，以改善明膠海綿多孔結(jié)構(gòu)帶來(lái)的力學(xué)性能差的問(wèn)題。在控制海綿良好的壓縮性能以及吸水性能的同時(shí)，具有良好的抗菌性能。

1 試 驗(yàn)

1.1 原料與試劑

BC，CP，上海奕方農(nóng)業(yè)科技股份有限公司；EPTAC，RG，上海泰坦科技股份有限公司；氫氧化鈉，AR，平湖化工試劑廠(chǎng)；異丙醇，AR，上海沃凱生物技術(shù)有限公司；無(wú)水乙醇，AR，上海凌峰化學(xué)試劑公司；1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽，AR，北京百靈威科技有限公司；N-羥基琥珀酰亞胺，AR，sigma-aldrich有限公司；抗凝兔血，BR，河南巨石生物科技有限公司；明膠，CP，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；2-(N-瑪琳代)乙磺酸，AR，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；戊二醛，BR，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器設(shè)備

場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡，S4800型，Hitachi公司；傅里葉紅外光譜儀，Nicolet-670型，Spectrometer公司；納米粒度儀，Malvern Instruments Ltd型，Malvern公司；紫外分光光度計(jì)，Evolution 201型，Spectrometer公司；電子萬(wàn)能材料試驗(yàn)機(jī)，Instron 5969型，Instron公司。

1.3 試驗(yàn)過(guò)程

1.3.1 纖維素季銨化

稱(chēng)取1 g BC(干重)加入10 mL去離子水和30 mL 異丙醇分散，再加入20 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的氫氧化鈉溶液，于65 ℃下加入9 g EPTAC，在磁力攪拌條件下反應(yīng)10 h。將反應(yīng)體系溶液多次高速離心，洗滌，得到季銨化BC，記為CABC。

1.3.2 復(fù)合海綿的制備

稱(chēng)取明膠溶解，與CABC混合，制備成固含量為2%的復(fù)合溶液，充分混合后脫泡，置于培養(yǎng)皿中冷凍干燥，制得不同比例的復(fù)合海綿，CABC與明膠的比例分別為4∶6、5∶5、6∶4。

1.3.3 復(fù)合海綿的交聯(lián)

稱(chēng)取等摩爾量的1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)溶于pH為5.5的0.5 mol/L的MES緩沖液和乙醇混合溶液中，MES緩沖液與乙醇體積比為3∶2，制得交聯(lián)液。將復(fù)合海綿浸泡于之前配置好的交聯(lián)液中，浸泡24 h后，用去離子水清洗直至完全去除交聯(lián)液后冷凍干燥得到復(fù)合海綿。

1.4 分析測(cè)試

1.4.1 吸水率測(cè)量

將制得的復(fù)合海綿干燥稱(chēng)重，然后將其在去離子水中浸泡5 min，吸去表面水分后稱(chēng)重，根據(jù)公式計(jì)算其吸水率，公式如下[10]：

(1)

式中W為吸水率，%；M1為干燥樣品質(zhì)量，g；M2為充分浸濕樣品質(zhì)量，g。

1.4.2 孔隙率測(cè)量

將制得的復(fù)合海綿干燥稱(chēng)重，然后將其浸沒(méi)于盛滿(mǎn)乙二醇溶液的密度瓶中，除去氣泡，再加滿(mǎn)乙二醇，用濾紙拭去密度瓶表面的乙二醇并稱(chēng)重，取出樣品稱(chēng)重，根據(jù)公式計(jì)算其孔隙率，公式如下[11]：

(2)

式中P為材料孔隙率，%；M1為干燥樣品質(zhì)量，g；M2為充分浸濕樣品質(zhì)量，g；M3為裝滿(mǎn)乙二醇的密度瓶質(zhì)量，g；M4為裝有樣品和乙二醇的密度瓶質(zhì)量，g。

1.4.3 凝血指數(shù)(BCI)測(cè)試

稱(chēng)取10 mg海綿，37 ℃恒溫孵育，加入100 μL抗凝兔血和20 μL的0.2 mol/L的CaCl2溶液，5 min后加入25 mL蒸餾水，在37 ℃下以50 r/min的轉(zhuǎn)速恒溫?fù)u勻，5 min后取出溶液，用紫外分光光度計(jì)測(cè)量其在波長(zhǎng)545 nm下的吸光度值(abs)。設(shè)立不加入海綿作為對(duì)照組，BCI值計(jì)算公式如下：

(3)

式中abs樣品為實(shí)驗(yàn)組的吸光度值，L/(g·cm)；abs對(duì)照為對(duì)照組的吸光度值，L/(g·cm)。

1.4.4 海綿的動(dòng)態(tài)凝血測(cè)試

取10 mg海綿，37 ℃恒溫孵育，加入100 μL抗凝兔血和20 μL的0.2 mol/L的CaCl2溶液，分別在0、5、10、15、20、25和30 min時(shí)加入25 mL蒸餾水，在37 ℃恒溫50 r/min轉(zhuǎn)速下，搖勻后取出溶液，用紫外分光光度計(jì)測(cè)量其在波長(zhǎng)545 nm下的abs。

1.4.5 海綿的血細(xì)胞吸附測(cè)試

取抗凝兔血，2 000 r/min離心，移去上層血漿，下層的紅細(xì)胞用PBS緩沖液稀釋到原來(lái)濃度的10%，海綿置于24孔板中，在37 ℃恒溫環(huán)境中孵育5 min，加入300 μL紅細(xì)胞稀釋液，在37 ℃恒溫環(huán)境中孵育30 min后，用PBS緩沖液洗掉未被吸附的紅細(xì)胞，用2.5%的戊二醛固定30 min，分別用40%、50%、60%、70%、80%、90%和100%的乙醇溶液梯度洗脫15 min，最后樣品自然風(fēng)干，噴金處理后用掃描電子顯微鏡觀(guān)察紅細(xì)胞的吸附情況。

1.4.6 海綿的抑菌性能測(cè)試

分別將革蘭氏陰性大腸桿菌、革蘭氏陽(yáng)性金黃色葡萄球菌于37 ℃下，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，然后取細(xì)菌懸液與樣品在PBS緩沖液中震蕩培養(yǎng)24 h，分別稀釋100倍和1 000倍后均勻涂布于固體培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)24 h，統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)基上的菌落數(shù)，計(jì)算其抗菌率η[12]，公式如下所示。

(4)

式中N0為對(duì)照組菌落數(shù)，個(gè)；N1為實(shí)驗(yàn)組菌落數(shù)，個(gè)。

1.4.7 海綿的細(xì)胞毒性測(cè)試

將細(xì)胞置于加有海綿浸出液的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，然后使用CCK-8試劑對(duì)其細(xì)胞活性進(jìn)行測(cè)量。計(jì)算公式如圖所示[13]：

(5)

式中R為細(xì)胞存活率，%；abs樣品為實(shí)驗(yàn)孔吸光度值(培養(yǎng)過(guò)細(xì)胞的培養(yǎng)基、CCK-8、待測(cè)物質(zhì))，L/(g·cm)；abs空白為空白孔吸光度值(未培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基、CCK-8)，L/(g·cm)；abs陰性對(duì)照組為對(duì)照組吸光度值(培養(yǎng)過(guò)細(xì)胞的培養(yǎng)基、CCK-8、不含待測(cè)物質(zhì))，L/(g·cm)。

1.4.8 其他測(cè)試

采用傅里葉紅外光譜儀，溴化鉀壓片法對(duì)季銨化BC、純BC、EPTAC進(jìn)行FT-IR測(cè)試，設(shè)定波長(zhǎng)范圍為4 000～400 cm-1。

以去離子水為溶劑采用納米粒度儀對(duì)季銨化BC進(jìn)行Zeta電位測(cè)量。

采用場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡在加速電壓為15.0 kV的條件下對(duì)樣品的微觀(guān)形貌和結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。

使用電子萬(wàn)能材料試驗(yàn)機(jī)測(cè)量樣品的壓縮模量及壓縮循環(huán)，設(shè)定壓縮速率為10 mm/min，最大壓縮量為50%。

2 結(jié)果與討論

2.1 BC季銨化改性及表面電性

EPTAC、BC、CABC傅里葉紅外光譜圖如圖1所示。

圖1 EPTAC、BC、CABC傅里葉紅外光譜圖

通過(guò)比較CABC與BC的紅外光譜圖可知，經(jīng)過(guò)改性后的CABC與BC仍然存在相似的峰型，但在1 480 cm-1附近出現(xiàn)一個(gè)吸收峰，對(duì)應(yīng)EPTAC的CH3振動(dòng)峰[14]。

使用Zeta電位來(lái)評(píng)估CABC的表面電性，如圖2所示。

圖2 BC、CABC的Zeta電位圖

從圖2可以看出，所得CABC的Zeta電位為40 mV，與純BC的Zeta電位-16.75 mV相比，季銨化改性后的BC帶有一定量的正電荷，帶同種電荷的CABC分子鏈產(chǎn)生相互排斥的靜電力，避免了纖維素納米纖維間的纏結(jié)發(fā)生，同時(shí)抵抗BC的重力使其均勻地分散在溶液中不發(fā)生沉降，這使得CABC在水中的分散性較好[15]。

2.2 吸水率和孔隙率分析

不同質(zhì)量比的CABC/明膠復(fù)合海綿孔隙率、吸水率如圖3所示。

根據(jù)不同比例的CABC/明膠復(fù)合海綿的孔隙率、吸水率關(guān)系圖可以看出，隨著CABC含量由40%增加至60%，復(fù)合海綿的孔隙率由83.4%下降至70.45%，這是由于BC的納米纖維與明膠孔壁存在較強(qiáng)的界面作用力，隨著CABC含量的增加，其作用力增強(qiáng)，CABC/明膠復(fù)合海綿的結(jié)構(gòu)也越加緊密，導(dǎo)致孔隙率下降。

由于隨著CABC含量的增加，復(fù)合海綿的孔隙率下降，其吸水率也由3 131%下降至2 463%，與孔隙率的變化趨勢(shì)相同。通過(guò)纖維素納米纖維的引入，可以調(diào)控明膠海綿的孔隙結(jié)構(gòu)，從而控制止血過(guò)程中過(guò)多的血液流失，解決商用明膠海綿在臨床應(yīng)用過(guò)程中血液流失過(guò)多的問(wèn)題。

2.3 海綿微觀(guān)形貌觀(guān)察

在掃描電鏡下對(duì)不同比例的CABC/明膠復(fù)合海綿進(jìn)行觀(guān)察，結(jié)果如圖4所示。

圖4 不同質(zhì)量比的CABC/明膠復(fù)合海綿表面SEM圖CABC：明膠分別為4∶6(a、b)，5∶5(c、d)，6∶4(e、f)

從圖4(a、c、e)中可以看到復(fù)合海綿表面具有若干片狀結(jié)構(gòu)堆疊，這使復(fù)合海綿具有一定的吸水性。當(dāng)傷口出血時(shí)，復(fù)合海綿可以吸收流失的血液和組織液，發(fā)生輕微的膨脹壓迫傷口組織多余的生物流體流失，并同時(shí)提供濕潤(rùn)的愈合環(huán)境。另外，從圖4(b、d、f)中可以看出，海綿內(nèi)部孔壁的表面附著了大量的纖維素納米纖維，作為材料骨架為復(fù)合海綿提供了支撐作用，使其能夠適應(yīng)更為復(fù)雜的臨床環(huán)境，而不至于塌陷變形。與單獨(dú)的明膠相比，納米纖維的引入提高了材料表面的粗糙度，提高了細(xì)胞的黏附[16]，使得復(fù)合海綿能夠黏附更多的血漿和血細(xì)胞，促進(jìn)血液的凝結(jié)[17]。隨著CABC含量上升，復(fù)合海綿的孔徑逐漸減小，纖維素納米纖維也越發(fā)致密，這也是孔隙率和吸水率隨CABC含量下降而略有下降的原因。

2.4 海綿凝血情況分析

對(duì)復(fù)合海綿進(jìn)行全血凝血指數(shù)分析，結(jié)果如圖5所示。

圖5 CABC/明膠復(fù)合海綿全血凝血指數(shù)

BCI反應(yīng)材料的凝血性能，其數(shù)值越小，材料的凝血效果越好。通過(guò)測(cè)量，不同比例的CABC/明膠復(fù)合海綿的BCI分別為15.8%、10.3%、13.7%，其中質(zhì)量比為5∶5的復(fù)合海綿數(shù)值最低，證明其凝血性能最好。這是因?yàn)橘|(zhì)量比為4∶6復(fù)合海綿結(jié)構(gòu)松散，孔洞太大，難以實(shí)現(xiàn)血液的吸附固定，使血液無(wú)法快速凝結(jié)，導(dǎo)致BCI過(guò)高；而質(zhì)量比為6∶4的復(fù)合海綿的結(jié)構(gòu)致密，孔徑較小，導(dǎo)致血液無(wú)法快速滲入海綿內(nèi)部，只浮在海綿表面，無(wú)法促進(jìn)血液凝結(jié)，導(dǎo)致BCI偏高。因此，質(zhì)量比為5∶5的復(fù)合海綿BCI最小，凝血效果最好。

圖6為CABC/明膠復(fù)合海綿動(dòng)態(tài)凝血分析。

圖6 CABC/明膠復(fù)合海綿動(dòng)態(tài)凝血分析

通過(guò)動(dòng)態(tài)凝血實(shí)驗(yàn)觀(guān)察到在0～5 min內(nèi)吸光度迅速下降，而后趨于平緩，這說(shuō)明在5 min內(nèi)復(fù)合海綿和純明膠海綿都促進(jìn)了血液的快速凝結(jié)，隨著時(shí)間的增加，吸光度趨于平緩，這證明凝血過(guò)程基本完成。無(wú)論是何種比例的CABC/明膠復(fù)合海綿的吸光度都低于同時(shí)期的純明膠海綿，證明CABC的引入可以促進(jìn)血液的凝固，綜合來(lái)看CABC與明膠質(zhì)量比為5∶5的復(fù)合海綿凝血效果最好。

2.5 海綿的血細(xì)胞吸附

不同質(zhì)量比的復(fù)合海綿的血細(xì)胞吸附SEM圖如圖7所示。

從圖中可以看出，質(zhì)量比為5∶5的海綿血細(xì)胞吸附最多；質(zhì)量比為4∶6海綿由于結(jié)構(gòu)松散，孔洞太大，血細(xì)胞難以吸附固定；質(zhì)量比為6∶4的海綿結(jié)構(gòu)致密，孔徑較小，血細(xì)胞難以快速滲入海綿內(nèi)部進(jìn)行吸附固定，這與之前測(cè)量的全血凝血指數(shù)和動(dòng)態(tài)凝血分析結(jié)果一致。

2.6 海綿的力學(xué)性能分析

對(duì)不同纖維素和明膠比例的復(fù)合海綿及明膠海綿進(jìn)行了力學(xué)性能分析，應(yīng)力應(yīng)變曲線(xiàn)如圖8所示。

從圖8可以看出，與明膠海綿相比，復(fù)合海綿的壓縮應(yīng)力有了較大的提高，質(zhì)量比為4∶6、5∶5、6∶4的復(fù)合海綿壓縮模量(圖9)分別達(dá)6.96、8.56和6.17 kPa，是明膠海綿的壓縮模量(2.44 kPa)的3倍左右，這說(shuō)明BC的引入對(duì)明膠海綿的三維多孔狀結(jié)構(gòu)起到了支撐作用，達(dá)到了力學(xué)增強(qiáng)的效果。

圖9 不同質(zhì)量比的復(fù)合海綿與明膠海綿的壓縮模量圖

選擇力學(xué)增強(qiáng)效果最好的質(zhì)量比為5∶5的樣品，對(duì)其進(jìn)行了壓縮循環(huán)性能測(cè)試，如圖10所示。

圖10 CABC與明膠質(zhì)量比為5∶5的復(fù)合海綿壓縮循環(huán)圖

從圖10中可以看出，隨著應(yīng)變的逐漸增加，應(yīng)力也逐漸增加。在釋放壓力后，海綿可以回復(fù)到初始狀態(tài)。雖然在第一循環(huán)后應(yīng)力稍微有點(diǎn)降低，但在隨后的壓縮循環(huán)中幾乎保持不變，說(shuō)明能夠承受一定的變形，并具有良好的循環(huán)穩(wěn)定性。

2.7 海綿的抑菌性能分析

對(duì)復(fù)合海綿進(jìn)行了抗菌性能表征，如圖11、12所示。

圖11 復(fù)合海綿的抑菌實(shí)驗(yàn)a) 大腸桿菌對(duì)照組；b) 實(shí)驗(yàn)組；c) 金黃色葡萄球菌對(duì)照組；d) 實(shí)驗(yàn)組

圖12 復(fù)合海綿對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌率

從圖11可以看出，對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌來(lái)說(shuō)，實(shí)驗(yàn)組的菌落數(shù)都顯著少于空白對(duì)照組的菌落數(shù)，這證明其對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌都有一定的抑菌性，其抑菌率分別為65.0%、87.6%(圖12)這是因?yàn)镹+陽(yáng)離子的引入會(huì)與負(fù)電荷的細(xì)菌細(xì)胞膜表面產(chǎn)生靜電作用，導(dǎo)致膜表面電荷分布不均勻，使得細(xì)菌喪失正常生理功能，從而導(dǎo)致細(xì)菌死亡。止血海綿優(yōu)異的抗菌性給予了海綿更大的應(yīng)用潛力，在傷口的止血過(guò)程中，預(yù)防傷口感染是不可避免的問(wèn)題，傳統(tǒng)的抗菌防感染的策略多是輔以藥物和抗菌劑，但無(wú)形中提高了材料的制作成本和應(yīng)用難度，而具有本征抗菌能力的CABC以及其制備的復(fù)合海綿很好地彌補(bǔ)了這一缺陷，并為抗菌海綿的制備提供了新的研究思路和指導(dǎo)意義。

2.8 海綿的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)

對(duì)不同比例的復(fù)合海綿進(jìn)行了的細(xì)胞活性表征，如圖13所示。

從圖13可以看出，CABC與明膠比例為4∶6、5∶5、6∶4的復(fù)合海綿的細(xì)胞活性分別為100%、90%、87%，根據(jù)GB/T 16886.5—2017醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)第5部分：體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)要求，細(xì)胞活性下降大于30%被認(rèn)為有細(xì)胞毒性反應(yīng)。因此，可以認(rèn)為制備的復(fù)合海綿無(wú)細(xì)胞毒性，具有用于生物體止血的應(yīng)用基礎(chǔ)。細(xì)胞活性隨CABC含量上升而下降可能是因?yàn)榻又α岁?yáng)離子的CABC在水中少量電離出陽(yáng)離子對(duì)細(xì)胞活性產(chǎn)生影響。

3 結(jié) 論

a) 使用EPTAC對(duì)BC進(jìn)行改性，成功制備出了CABC，陽(yáng)離子的引入減少了BC之間的纏結(jié)，顯著提高了纖維素的分散性。

b) 成功制備了不同比例的CABC/明膠復(fù)合海綿，并對(duì)其止血性能、抗菌性能以及細(xì)胞毒性進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果表明CABC與明膠質(zhì)量比為5∶5的海綿綜合性能最好。

c) BC與明膠具有良好的生物相容性，BC的引入很好的地改善了明膠海綿的力學(xué)性能，同時(shí)陽(yáng)離子的引入增加了其抗菌性，在制備高效止血海綿方面具有良好的應(yīng)用前景。