強還原土壤滅菌對煙草種植前后土壤化學(xué)性質(zhì)及微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

滕 凱，張清壯，彭鏡先，陳前鋒，田明慧，巢 進，李 鑫*

1.湖南省煙草公司湘西自治州公司，湖南省湘西土家族苗族自治州吉首市人民南路118號 416000 2.湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，長沙市芙蓉區(qū)遠大二路892號 410128 3.湖南省蔬菜研究所，長沙市芙蓉區(qū)遠大二路890號 410128

作物生產(chǎn)過程常伴隨著過度施肥、集約灌溉和單一連作的現(xiàn)象，這會導(dǎo)致土壤品質(zhì)下降，如土壤酸化、板結(jié)以及土傳病害的發(fā)生等［1-2］。為了有效緩解土壤酸化和控制土傳病害，曾嘗試短期淹水［3］、水旱輪作［4］以及使用化學(xué)殺菌劑［5］等措施。然而，這些措施對改良土壤的效果并不顯著，且耗費大量時間與費用［6-8］。而且，隨著人們對食品安全和環(huán)境污染的日益關(guān)注，傳統(tǒng)的且土壤消毒效果較好的化學(xué)殺菌劑也已逐漸被限制使用［9］。因此，尋找一種能夠同時控制土傳病害和克服土壤連作障礙的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)管理措施勢在必行［10］。對此，荷蘭和日本的學(xué)者提出了土壤強還原滅菌（Reductive soil disinfestation，RSD）的生物學(xué)方法，在土壤-植物-微生物的關(guān)系中創(chuàng)造有利于作物生長而不利于病原微生物繁殖的土壤環(huán)境條件，達到減少化學(xué)藥劑使用和解決土壤連作問題的目的［11-13］。

與傳統(tǒng)的物理化學(xué)方法相比，RSD技術(shù)具有環(huán)境友好、成本低廉等優(yōu)點。RSD處理是通過改變NH4+-N和NO3--N的相對比例來調(diào)節(jié)土壤pH，減輕土壤酸化問題［14］。此外，RSD處理能增加土壤中的總碳和總氮含量（質(zhì)量分數(shù)），并將添加的有機質(zhì)通過微生物分解為有機酸和小分子物質(zhì)而提高土壤肥力，減少養(yǎng)分流失，緩解連作障礙［15-16］。在控制土傳病害方面，目前已有許多研究證實RSD處理能有效防治多種植物土傳病害，如由立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）引起的植物立枯病，青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的青枯病，疫霉屬（Phytophthora）真菌引起的植物晚疫病等［13］。其中，青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的細菌性青枯病是一種在世界范圍內(nèi)發(fā)生廣泛的植物病害。近年來，煙草青枯病在我國主要產(chǎn)煙區(qū)的發(fā)病率呈明顯增長趨勢，成為煙草生產(chǎn)上重要的土傳病害，嚴重威脅煙草產(chǎn)業(yè)的安全和可持續(xù)發(fā)展［17］。目前關(guān)于植煙前后RSD處理土壤化學(xué)性質(zhì)及微生物群落的變化尚鮮見報道。為此，采用RSD技術(shù)，以豆渣為有機物料，研究植煙前后RSD處理土壤化學(xué)性質(zhì)及微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性的變化，并對煙草農(nóng)藝性狀和青枯病發(fā)病率進行調(diào)查，旨在為構(gòu)建健康和諧的煙田生態(tài)系統(tǒng)以及RSD技術(shù)的推廣應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗地位于湘西土家族苗族自治州鳳凰縣煙區(qū)千工坪鎮(zhèn)（28°02'N，109°50'E），煙草連作多年且病害發(fā)生較嚴重。田間采用豆渣物料，總碳411.09 g/kg，全氮16.07 g/kg，物料被施入土壤前，已經(jīng)過干燥、粉碎并過270μm孔徑的篩子。供試烤煙品種為當?shù)刂髟云贩N云煙87。

1.2 試驗設(shè)計

采用田間試驗，設(shè)置3個處理：CK1處理（原始土壤，不進行任何處理）；CK2處理（覆膜并飽和水分處理）；RSD處理（添加豆渣、覆膜并飽和水分處理）。每個處理3次重復(fù)，共9個小區(qū)，每個小區(qū)面積50 m2，各處理用田壟隔斷，總面積共450 m2。厭氧處理時間為冬閑時間段（2019年11月8日實施至2020年3月18日）。處理完成后，揭膜晾曬至無明顯水分時，在每小區(qū)中采用梅花布點法（7點）采集表層土壤樣品（0～20 cm），并將每小區(qū)樣品混合均勻作為1份土壤樣本。土壤取樣完成后種植煙草，其栽培管理和施肥措施均按當?shù)貎?yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)技術(shù)規(guī)范實施。煙葉成熟后，同樣采用梅花布點法（7點）采集煙株根系附近的表層土壤樣品，并將每小區(qū)樣品混合均勻作為1份土壤樣本。每份樣本均勻分成兩份，一份用于土壤化學(xué)性質(zhì)指標的測定，另一份用于土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的分析。RSD處理結(jié)束時采集的土壤樣品分別標記為CK1、CK2和RSD。煙葉成熟后采集煙株根系周圍的土樣樣本，分別標記為CK1-C、CK2-C和RSD-C。

1.3 土壤化學(xué)性質(zhì)指標的測定

按照文獻［18］描述的方法測定土壤pH、全氮、有效磷、速效鉀、有機質(zhì)、NH4+-N和NO-3-N含量（質(zhì)量分數(shù)）等理化性質(zhì)指標：采用pH計測定土壤pH［18］；凱式定氮法測土壤全氮［18］；用0.5 mol/L NaHCO3溶液浸提后，采用鉬銻抗比色測定土壤有效磷［18］；用1 mol/L NH4OAc溶液浸提后，采用火焰分光光度法測定土壤速效鉀，采用重鉻酸鉀滴定法測定土壤有機質(zhì)［18］；用2 mol/L KCl浸提并采用靛酚藍比色法測定土樣中NH4+-N含量，用飽和CaSO4·2H2O提取，酚二磺酸比色法測定土樣中NO3--N含量［18］。

1.4 土壤DNA提取與群落檢測

使用土壤DNA提取試劑盒E.Z.N.A.?soil DNA kit（廣州飛揚生物工程有限公司）進行土壤微生物總DNA的提取。選擇16S rRNA基因高變區(qū)序列進行細菌群落測序，測序引物為338F（5'-ACTCC TACGGGAGGCAGCA-3'）/806R（5'-GGACTACHV GGGTWTCTAAT-3'），測序區(qū)域為V3～V4區(qū)；真菌選擇ITS 1F（5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'）/ITS 2R（5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'）作為基因引物進行真菌群落測序，測序區(qū)域為ITS1區(qū)。然后進行PCR擴增，合并引物接頭，使用瓊脂糖電泳對PCR產(chǎn)物進行純化、定量和均一化并合成測序文庫。對建好的文庫進行質(zhì)檢，并在Illumina MiSeq 2500平臺完成高通量測序［19］。

1.5 微生物多樣性分析

使用Fastp 0.19.6軟件進行微生物序列質(zhì)量控制后，以97%序列相似性將剩余序列聚類到OTU中。再使用Qiime軟件將序列與Silva和Unite數(shù)據(jù)庫比對，并在各分類水平分析樣本的群落物種組成。采用Mothur 1.30.2軟件計算群落多樣性指數(shù)香農(nóng)指數(shù)（Shannon）和群落豐富度指數(shù)Ace和Chao1。基于OTU豐度表計算微生物群落豐度組成，并用Origin 8.5軟件繪圖。采用Canoco 5軟件完成主坐標分析（PCoA）、主成分分析（PCA）和冗余分析（RDA）并繪圖。

1.6 煙株農(nóng)藝性狀調(diào)查

在各處理中選擇具有代表性的5～10株煙株進行掛牌標記，按YC/T 142—2010［20］標準方法，定點定株在煙株旺長期測定煙株的農(nóng)藝性狀指標，包括煙株的株高、莖圍、有效葉片數(shù)和最大葉面積。

1.7 病害調(diào)查

按GB/T 23222—2008［21］標準方法調(diào)查煙株青枯病發(fā)病情況，病害調(diào)查與烤煙農(nóng)藝性狀指標測定同步進行。從煙株發(fā)病初期開始調(diào)查，每隔6 d調(diào)查1次，連續(xù)調(diào)查8次。

計算公式：

1.8 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2019軟件計算平均值與標準差，用SPSS 19.0軟件采用Duncan’s新復(fù)極差法進行處理間的差異顯著性檢驗。分別采用Excel及Origin 8.5軟件制表和繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對土壤pH與養(yǎng)分含量的影響

表1顯示：與CK1和CK2相比，RSD處理能顯著提高土壤pH，植煙后各處理土壤pH較植煙前變化不顯著。植煙前RSD處理的土壤NO3--N含量較CK1顯著降低，而土壤NH4+-N含量則增加，其中NO3--N含量RSD處理較CK1減少66.00%，NH4+-N含量RSD處理較CK1增加22.71%。此外，RSD處理土壤有效磷含量也顯著增加。植煙后RSD-C處理的有效磷、速效鉀和NH4+-N含量較CK1-C和CK2-C均有顯著提高，分別比CK1-C提高204.35%、37.57%和65.68%，分別比CK2-C提高70.40%、36.70%和34.60%。

表1 不同處理土壤p H和主要養(yǎng)分含量變化①Tab.1 Changes of soil pH and major nutrient contents under different treatments

2.2 不同處理對土壤微生物群落的豐富度和多樣性的影響

從18個土壤樣品中，分別得到885 485和1 026 323條細菌和真菌有效序列，總長度分別為370 370 081 bp和237 294 043 bp，片段平均長度分別為418 bp和231 bp。根據(jù)97%的相似度閾值對微生物群落進行聚類與物種注釋，共得到6 692個細菌OTUs和1 556個真菌OTUs。其中，細菌歸屬于44門，140綱，332目，516科，947屬和2 076種；真菌歸屬于14門，45綱，107目，221科，387屬和614種。

基于OTUs對微生物多樣性指數(shù)香農(nóng)指數(shù)和豐富度指數(shù)Ace、Chao1指數(shù)進行估算。結(jié)果（表2）顯示，除RSD-C處理真菌群落Chao1顯著低于CK1外，其余土壤微生物群落豐富度指數(shù)無顯著差異。植煙前RSD處理土壤的細菌和真菌香農(nóng)多樣性指數(shù)均顯著低于CK1，而植煙后RSD-C處理土壤的真菌香農(nóng)多樣性指數(shù)則顯著降低。

表2 微生物群落多樣性和豐富度指數(shù)①Tab.2 Diversity and richness indexes of microbial communities

2.3 不同處理對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

2.3.1 細菌群落組成

不同處理細菌群落在門和屬水平的相對豐度如圖1所示。各處理中豐度大于1%的細菌門為變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteriota）、酸桿菌門（Acidobacteriota）、綠彎菌門（Chloroflexi）、厚壁菌門（Firmicutes）、芽單胞菌門（Gemmatimonadota）、Myxococcota、嗜甲基菌門（Methylomirabilota）、擬桿菌門（Bacteroidota）、Latescibacterota、硝化螺旋菌門（Nitrospirota）（圖1A），表明植煙前后RSD處理土壤細菌門結(jié)構(gòu)組成沒有改變，但優(yōu)勢種群比例發(fā)生明顯變化。在門水平上（圖1A），RSD處理土壤中的變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteriota）、厚壁菌門（Firmicutes）和擬桿菌門（Bacteroidota）的相對豐度與對照（CK1、CK2）相比存在顯著差異。其中，RSD處理土壤中酸桿菌門（Acidobacteriota）、厚壁菌門（Firmicutes）和擬桿菌門（Bacteroidota）的相對豐度顯著高于CK1和CK2，而變形菌門（Proteobacteria）的相對豐度卻顯著低于CK1和CK2。在屬水平上（圖1B），植煙前RSD處理土壤中Flavisolibacter屬、芽胞桿菌屬（Bacillus）及糞球菌屬（Coprococcus）的相對豐度顯著高于CK1和CK2，而雷爾氏菌屬（Ralstonia）顯著降低。植煙后RSD-C土壤中Flavisolibacter、雷爾氏菌屬（Ralstonia）的相對豐度較CK1-C和CK2-C顯著減少，而芽胞桿菌屬（Bacillus）、糞球菌屬（Coprococcus）顯著增加。

圖1 細菌門（A）和優(yōu)勢菌屬（B）的相對豐度比較Fig.1 Relative abundances of bacterial phyla（A）and dominant genera（B）

2.3.2 真菌群落組成

不同處理真菌群落在門和屬水平的相對豐度如圖2所示。各處理主要真菌門包括子囊菌門（Ascomycota）、擔子菌門（Basidiomycota）和被孢霉門（Mortierellomycota）（圖2A）。在屬水平上（圖2B），RSD處理柄孢殼菌屬（Podospora）及被孢霉屬（Mortierella）的相對豐度顯著增加，鐮刀菌屬（Fusarium）、絲核菌屬（Rhizoctonia）和原隱球菌屬（Saitozyma）的相對豐度顯著降低。植煙后RSD-C處理柄孢殼菌屬（Podospora）、毛殼菌屬（Chaetomium）和被孢霉屬（Mortierella）的相對豐度顯著增加，而鐮刀菌屬（Fusarium）及原隱球菌屬（Saitozyma）的相對豐度則顯著降低（圖2B）。

圖2 真菌門（A）和優(yōu)勢菌屬（B）的相對豐度Fig.2 Relative abundances of fungal phyla（A）and dominant genera（B）

2.4 土壤微生物群落與土壤環(huán)境因子之間的關(guān)系

對環(huán)境因子與主要菌門進行PCoA、PCA和RDA分析，結(jié)果見圖3。由圖3a和3b可知，CK1和CK2的群落結(jié)構(gòu)分別在細菌群落和真菌群落中表現(xiàn)相似，而RSD處理土壤菌群較CK1和CK2變化顯著。植煙后土壤處于好氧條件下，土壤中NH4+-N、有機質(zhì)、速效鉀和有效磷含量顯著影響微生物的群落結(jié)構(gòu)（圖3c和3d）。土壤環(huán)境因子與微生物優(yōu)勢菌門的RDA結(jié)果分析表明，微生物群落結(jié)構(gòu)變化與環(huán)境因子間存在一定的相關(guān)性。細菌RDA分析（圖3e）發(fā) 現(xiàn)，土 壤NH4+-N與嗜甲基菌門（Methylomirabilota）、酸桿菌門（Acidobacteriota）的變化呈正相關(guān)，土壤有機質(zhì)、速效鉀、有效磷與放線菌門（Actinobacteriota）、厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）和綠彎菌門（Chloroflexi）的變化呈正相關(guān)。真菌RDA分析（圖3f）發(fā)現(xiàn)，被孢霉門（Mortierellomycota）、子囊菌門（Ascomycota）和擔子菌門（Basidiomycota）分別受土壤NH4+-N、全氮和有機質(zhì)含量的影響較大。

2.5 不同處理對煙草農(nóng)藝性狀和發(fā)病率的影響

不同處理煙草農(nóng)藝性狀和發(fā)病率如表3所示。RSD處理土壤煙株株高、有效葉片數(shù)和最大葉面積均顯著高于CK1和CK2，分別較CK1增加3.6%、9.4%和9.3%，分別較CK2增加2.9%、8.0%和1.2%。RSD處理煙株發(fā)病率均顯著低于CK1和CK2，分別較CK1、CK2降低59.0%、49.6%。

表3 不同處理煙草農(nóng)藝性狀和發(fā)病率比較①Tab.3 Agronomic traits and incidence rate of tobacco under different treatments

3 討論

長期連作會導(dǎo)致土壤養(yǎng)分含量減少以及土傳病原菌的發(fā)生，而對土壤進行單一淹水的物理消毒法所創(chuàng)造的厭氧環(huán)境下的微生物代謝活動較弱，不能有效改良土壤品質(zhì)和抑制土傳病害［22］。研究表明，通過在厭氧環(huán)境中添加適量有機物料，不僅能夠在短時間內(nèi)改善酸化土壤，而且還增加土壤養(yǎng)分含量［23］。本研究中RSD處理創(chuàng)造的強還原環(huán)境能使土壤pH顯著增加，表明RSD處理可緩解土壤酸化，與前人研究結(jié)果基本一致［24］。RSD處理土壤NH4+-N含量顯著增加，NO3--N含量顯著降低。其中，土壤NH4+-N含量的增加可歸因于RSD處理中有機物料的礦化導(dǎo)致NH4+-N的產(chǎn)生［24］，土壤中NO3--N含量降低則歸因于RSD處理創(chuàng)造的強還原土壤環(huán)境，促進NO3-的還原進而導(dǎo)致NO3--N含量降低［15，25］。RSD處理還可顯著提高土壤中有效磷含量，這可能是因為在RSD處理的土壤厭氧環(huán)境下，添加的有機物料被厭氧微生物分解，促進了有機磷向無機磷的轉(zhuǎn)化，從而增加土壤中磷的有效性［26-27］，這與劉亞男等［23］的研究結(jié)果相似。本研究中RSD處理的植煙土壤中的有效磷、速效鉀和NH4+-N含量較未處理和僅淹水覆膜處理土壤有所增加，同時，煙草的農(nóng)藝性狀也得到了改善，其原因可能是土壤恢復(fù)好氧環(huán)境，經(jīng)過RSD處理已經(jīng)改變的土壤微生物群落對土壤中有機質(zhì)的分解能力及養(yǎng)分活化能力增強［24，28］，從而增加土壤養(yǎng)分含量并改善煙草的農(nóng)藝性狀，這與Huang等［28］在黃瓜上的研究結(jié)果一致。

本研究中PCoA分析結(jié)果表明，RSD處理后土壤微生物群落發(fā)生顯著變化，這一方面歸因于RSD處理在較短的時間內(nèi)創(chuàng)造的強還原、厭氧和高溫等土壤環(huán)境［29］，另一方面是由于添加外源的有機物料所致。根據(jù)土壤環(huán)境因子與微生物群落之間的關(guān)聯(lián)分析（PCA、RDA）結(jié)果，RSD處理后土壤中養(yǎng)分含量發(fā)生變化也促進土壤微生物群落的改變。此外，RSD處理創(chuàng)造的特殊的強還原土壤環(huán)境還可殺滅土壤中一些病原微生物，這主要歸因于RSD處理土壤產(chǎn)生的一些有機酸和揮發(fā)性氣體等物質(zhì)，他們對于病原微生物有顯著抑制作用［29］。在本研究中，雷爾氏菌屬（Ralstonia）的相對豐度及煙草青枯病發(fā)病率在RSD處理后顯著降低，這表明RSD處理有效抑制了雷爾氏菌屬（Ralstonia）的生長，這與Mowlick等［30］和劉亞男等［23］的研究結(jié)果相似。同時，RSD-C處理創(chuàng)造的厭氧土壤環(huán)境使煙株青枯病的發(fā)病率顯著低于未處理土壤以及僅淹水覆膜的土壤，這再次證明了RSD處理對土壤青枯病的顯著滅菌效果。

RSD處理后細菌的優(yōu)勢菌屬包括芽胞桿菌屬（Bacillus）、糞球菌屬（Coprococcus）和Flavisolibacter。已有研究證實了芽胞桿菌屬（Bacillus）在作物生長過程中具有拮抗病原真菌的作用［31］，且芽胞桿菌屬（Bacillus）作為一種可還原Fe3+和Mn4+的細菌，其代謝物（H2S、NH3、Fe2+和Mn2+）也具有殺滅病原體的效果［28，32］。同時，這些代謝物在土壤恢復(fù)有氧狀態(tài)時，H2S和NH3將被分解和硝化，而Fe2+和Mn2+將被轉(zhuǎn)化，因此不會對植物產(chǎn)生毒害作用［28，32］。糞球菌屬（Coprococcus）是有機酸的生產(chǎn)者，如乙酸、丁酸和丙酸［33］，這些酸類物質(zhì)的產(chǎn)生也是RSD處理期間發(fā)揮消滅病原菌作用的關(guān)鍵因素［34］。此外，有研究表明Flavisolibacter在利用易分解有機碳源時能夠釋放多種功能酶，如葡β-萄糖苷酶（β-glucosidase）和N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶（N-acetyl-β-glucosaminidase），能夠輔助有機質(zhì)的降解［35-36］。

此外，RSD處理顯著影響了真菌群落結(jié)構(gòu)，其中柄孢殼菌屬（Podospora）及被孢霉屬（Mortierella）的相對豐度顯著增加。柄孢殼菌屬（Podospora）是健康土壤中含量最高的真菌屬之一［37］，可抑制植物黃萎病的發(fā)生［38］。被孢霉屬（Mortierella）對土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化和有效性具有重要貢獻。例如，被孢霉屬（Mortierella）具有通過釋放多種有機酸來溶解土壤磷的潛力［39］，在果園土壤中添加被孢霉（Mortierellasp.）可顯著增加有效磷、鉀、鈣、鎂和硼含量［40］。這表明RSD處理能促進有益微生物群落的構(gòu)建，降低土壤中的病原菌數(shù)量，增加土壤肥力從而為作物生長創(chuàng)造良好的土壤生態(tài)環(huán)境。

土壤滅菌處理完成后，隨著煙草的種植土壤微生物群落再次發(fā)生顯著變化，一是因為好氧環(huán)境的恢復(fù)以及高溫環(huán)境的消除［13］；二是因為在植物的生長過程中，植物根系釋放的分泌物具有一定能力驅(qū)動及選擇特定的微生物［14，41］。在本研究中，植煙后RSD-C處理中毛殼菌屬（Chaetomium）相對豐度顯著增加。毛殼菌屬（Chaetomium）作為一種需氧微生物，對許多植物病原菌具有潛在的生物防治作用，可作為土傳和種傳病原菌的拮抗物［42-43］，在生命活動過程中產(chǎn)生抗真菌化合物（如四氫呋喃）［44］，還可以通過重寄生作用、胞外酶溶菌作用、次生代謝產(chǎn)物的抑菌作用、誘發(fā)植物的保衛(wèi)反應(yīng)等方式殺死病原菌［45-46］。本研究中還發(fā)現(xiàn)，RSD技術(shù)的關(guān)鍵在于有機物料與厭氧環(huán)境同時存在才能起到良好的滅菌效果，降低青枯病的發(fā)病率，同時改善煙草的農(nóng)藝性狀。單純的淹水覆膜處理（CK2）創(chuàng)造的厭氧環(huán)境并不能起到改良土壤的效果，這與朱同彬等［24］的研究結(jié)果相似。

4 結(jié)論

①應(yīng)用RSD技術(shù)可顯著影響植煙土壤pH及養(yǎng)分含量，即RSD處理可增加土壤NH4+-N及有效磷養(yǎng)分含量，提高土壤pH。②RSD技術(shù)可顯著影響植煙土壤的微生物群落結(jié)構(gòu)組成，RSD處理后的土壤中Flavisolibacter、芽胞桿菌屬（Bacillus）、糞球菌屬（Coprococcus）、柄孢殼菌屬（Podospora）和被孢霉屬（Mortierella）等功能微生物菌屬的相對豐度顯著提高，而青枯病致病菌屬如雷爾氏菌屬（Ralstonia）的相對豐度顯著降低。植煙后土壤中有益微生物群落豐度仍然維持較高水平。③RSD處理植煙土壤可通過改善土壤理化性質(zhì)及土壤微生物群落結(jié)構(gòu)來改善煙株農(nóng)藝性狀從而降低煙株青枯病的發(fā)病率。