高分泌型無賴百當(dāng)煙草8306突變材料的創(chuàng)制與分析

李旖梅，王召軍，閆筱筱，張洪映，任書樂，李雪君，孫計(jì)平，崔 紅*

1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院，鄭州市金水區(qū)文化路95號(hào) 450002 2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，河南省許昌市魏都區(qū)青梅路與永昌大道交叉口 461000

煙草葉片表面布滿表皮毛即煙草腺毛，按有無分泌功能可分為分泌型腺毛和保護(hù)毛，煙草腺毛占總表皮毛的85%左右［1］。煙草腺毛是葉面分泌物的主要合成和分泌場所，分泌的葉面化合物主要有二萜化合物、蔗糖酯和蠟質(zhì)等［2］。二萜化合物和蔗糖酯是煙草香味物質(zhì)的重要前體物，且對(duì)害蟲有一定的趨避作用［3］，使煙草具有一定的自我防護(hù)能力。煙草腺毛是葉面化合物形成積累的基礎(chǔ)，葉面分泌物隨著煙草生長發(fā)育積累到一定程度才能對(duì)煙葉品質(zhì)產(chǎn)生作用。煙草葉面腺毛形成受遺傳、生態(tài)和栽培等因素的影響，具有不同的腺毛種類和密度，從而形成特定的香氣品質(zhì)和香氣風(fēng)格［4］。因此，煙草香氣品質(zhì)的提高可以通過調(diào)控?zé)煵菹倜芏葋韺?shí)現(xiàn)。

植物腺毛的發(fā)生機(jī)制已有相關(guān)報(bào)道。擬南芥中CycB1和CycB2基因使單細(xì)胞腺毛突變?yōu)閰采亩嗉?xì)胞腺毛，且在腺毛中特異性表達(dá)［5］。番茄中B型細(xì)胞周期蛋白基因SlCycB2，當(dāng)該基因過表達(dá)時(shí)，分泌型和非分泌型腺毛顯著減少；該基因受抑制時(shí)，非分泌型腺毛顯著增多，而分泌型腺毛消失［6-7］。孟盈等［8］對(duì)K326烤煙品種的NtCycB2基因進(jìn)行了敲除和過表達(dá)研究，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)植株葉片和莖表面光滑少毛，而敲除植株的分泌型腺毛顯著增加。潘陽等［9］通過敲除K326的NtCycB2基因創(chuàng)制了高腺毛密度的HK326純合材料，對(duì)腺毛密度統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，腺毛密度約為對(duì)照的3倍，對(duì)葉面化學(xué)成分含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）檢測發(fā)現(xiàn)，總含量提高近2倍。因此，NtCycB2基因?qū)煵莘置谛拖倜陌l(fā)生具有明顯的負(fù)調(diào)控作用。曹寧［10］、蔡傳斌［11］和吳擁軍等［12］研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)煙草葉片轉(zhuǎn)化ChIFN-γ基因，其后代植株葉片腺毛密度顯著提高，表明ChIFN-γ基因也參與調(diào)控?zé)煵菹倜陌l(fā)育，可見調(diào)控?zé)煵莘置谛拖倜姆肿诱{(diào)控機(jī)制比較復(fù)雜。煙草分泌型腺毛的發(fā)育同樣也受遺傳和外界環(huán)境條件的綜合影響。薛曉明等［13］和查宏波等［14］研究表明，不同煙草品種間，腺毛密度越大，腺毛分泌物含量越高。Bogdanieski等［15］試驗(yàn)提出，大田灌水量增加會(huì)降低煙草的腺毛密度。于衛(wèi)松等［16］研究發(fā)現(xiàn)，煙草施加豆餅等有機(jī)肥可顯著促進(jìn)煙葉腺毛生長，進(jìn)而提高煙草葉面分泌物含量。因此可通過調(diào)整煙草種植的外界環(huán)境和農(nóng)藝措施來提高煙草的葉面腺毛密度和分泌物含量。

煙草8306是河南農(nóng)業(yè)大學(xué)選育的高分泌型烤煙品系，其葉面分泌物含量顯著高于K326等烤煙品種［17］。8306品系具有晾曬煙香氣特點(diǎn)，晾曬煙香氣特性受NtCPS2基因的調(diào)控，NtCPS2基因是萜類代謝途徑中調(diào)控賴百當(dāng)二萜合成的基因，且8306品系的雜交后代，如豫煙11號(hào)也具有一定的晾曬煙香氣特點(diǎn)［18］。為彰顯8306品系的烤煙風(fēng)格，促進(jìn)其在高香氣烤煙育種中的應(yīng)用，在前期試驗(yàn)基礎(chǔ)上對(duì)8306品系的NtCPS2基因進(jìn)行敲除，使純合突變材料8306-1中賴百當(dāng)化合物的生物合成受到抑制，但腺毛分泌物總量并無顯著變化［19］。為進(jìn)一步提高8306-1株系腺毛分泌物含量，創(chuàng)制高香氣烤煙育種材料，對(duì)8306-1株系的NtCycB2基因進(jìn)行敲除，獲得了腺毛密度增加的純合突變株系8306-2，并對(duì)8306品系進(jìn)行了農(nóng)藝性狀、煙草腺毛、葉面化學(xué)成分和基因表達(dá)等分析，旨在創(chuàng)制高品質(zhì)和高香氣的育種材料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

煙草8306和8306-1種子由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)國家煙草栽培生理生化研究基地實(shí)驗(yàn)室保存。培養(yǎng)條件：種子經(jīng)消毒后在人工氣候箱萌發(fā)成無菌苗，溫度（26±2）℃，相對(duì)濕度（65±3）%，光照強(qiáng)度1 400 lx，進(jìn)行16 h的光照和8 h的黑暗交替培養(yǎng)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1NtCycB2基因敲除載體的構(gòu)建和菌株轉(zhuǎn)化

采用孟盈等［8］構(gòu)建的NtCycB2基因敲除載體，將獲得的NtCycB2基因敲除質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌EHA105中，在含有潮霉素YKR固體的培養(yǎng)基上均勻涂布，挑選多個(gè)單獨(dú)的菌斑用于PCR抗性檢測。對(duì)陽性菌液進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，用于遺傳轉(zhuǎn)化侵染。

1.2.2 煙草遺傳轉(zhuǎn)化與分子鑒定

采用葉盤法［20］對(duì)煙草8306-1株系進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。使用農(nóng)桿菌EHA105菌液侵染葉片，在MS培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)2d后轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基（MS+Cef 0.50000g/L+Hyg0.008 00g/L+6-BA 0.00100 g/L+NAA 0.00015 g/L）上，剪去3 cm左右的不定芽轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基（MS+Hyg 0.008 00 g/L+NAA 0.000 10 g/L）中培養(yǎng)。使用DNA提取試劑盒［天根生化（北京）科技有限公司］提取抗性植株的DNA，使用NtCycB2特異引物序列［19］進(jìn)行PCR擴(kuò)增，由北京擎科生物科技有限公司鄭州分公司對(duì)回收擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列測定。將得到的陽性植株自交獲得T1代種子。采用漂浮育苗，提取煙草幼苗的DNA，使用潮霉素抗性基因篩選出無標(biāo)記的單株幼苗。利用潮霉素抗性基因擴(kuò)增引物（F3：5'-CGAGAGCCTGACCTATTGCAT-3'，R3：

5'-CTGCTCCATACAAGCCAACCAC-3'）對(duì)T1代單株進(jìn)行鑒定，最終得到通過抗性篩選的陽性單株。

1.2.3 農(nóng)藝性狀調(diào)查

將8306和創(chuàng)制的兩個(gè)株系在河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所培育成幼苗，在適宜移栽期移栽到專門設(shè)置的基因編輯材料試驗(yàn)田，并由河南省農(nóng)科院煙草研究所統(tǒng)一栽培和管理，依據(jù)煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)［21］測定并記錄煙草的株高、葉數(shù)和節(jié)距等指標(biāo)。

1.2.4 葉片腺毛形態(tài)學(xué)觀察與密度統(tǒng)計(jì)

在煙草旺長期選取第5片（從上往下數(shù)）葉長15 cm左右（葉尖至葉基長度）的煙葉，選定葉片從葉尖到葉基第5脈和第6脈間的區(qū)域進(jìn)行染色，參考Lin等［22］的方法對(duì)煙葉腺毛組織進(jìn)行化學(xué)染色。使用體積分?jǐn)?shù)為0.2%的羅丹明B溶液對(duì)葉片浸染0.5 h，用蒸餾水漂洗4～5次，吸干葉片表面水分并放置在室溫下晾干，使用超景深顯微鏡（VHR-5000，日本基恩士公司）對(duì)葉片上表面進(jìn)行觀察，隨機(jī)選定平整區(qū)域內(nèi)10個(gè)左右的視野，對(duì)腺毛進(jìn)行形態(tài)觀察和拍照，并統(tǒng)計(jì)記錄不同類型腺毛的數(shù)量。

1.2.5 葉面化學(xué)成分分析

選取移栽后60 d中部第10～13葉位（從下往上數(shù)）煙葉提取葉面分泌物。煙葉取樣和前處理參考韓錦峰等［23］和李艷華等［24］的方法。使用500 mL左右的有機(jī)溶劑二氯甲烷溶液浸提煙葉，浸提后加入15 g左右的無水硫酸鈉除水過濾，過濾液中加入1 mL內(nèi)標(biāo)（2.542 mg/mL的正十七烷醇和2.020 mg/mL的蔗糖八乙酸酯的混合溶液），然后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，使用氮?dú)馔耆蹈蓺埩舻亩燃淄?。之后分別加入250μL的DMF和BSTFA，待瓶中固體溶解后進(jìn)行水浴1 h，再加入吡啶和N,O-雙乙酰胺，常溫下放置，待液體完全澄清無沉淀即為待測分析液，如果不立即測定則于4℃保存，檢測之前放置到室溫下即可。使用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Agilent公司，質(zhì)譜儀型號(hào)vc-70SE，色譜儀型號(hào)HP-5890）進(jìn)行葉面化合物成分檢測分析，儀器條件參數(shù)設(shè)定參考王霄龍等［25］的方法，采用內(nèi)標(biāo)定量法（相對(duì)校正因子為1）進(jìn)行定量分析。

1.2.6 熒光定量PCR檢測

使用熒光定量試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）進(jìn)行熒光定量PCR操作。PCR程序：95℃10 min；95℃10 s，60℃30 s，循環(huán)40次。反應(yīng)體系為30μL：cDNA 1μL；DEPC 3.6μL；上游引物0.2μL；下游引物0.2μL；熒光染料（2×SYBR GreenⅠMaster）5μL，無菌水（H2O）補(bǔ)足至30μL。熔解曲線程序?yàn)?0℃緩慢升溫至97℃，每次采集5次熒光信號(hào)，程序結(jié)束后對(duì)比熔解曲線確定各對(duì)引物的特異性，分析確定基因之間的相對(duì)表達(dá)量，熒光定量PCR引物見表1。

表1 熒光定量引物Tab.1 Primers for fluorescence quantification

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2013進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和圖表繪制；使用SPSS 21統(tǒng)計(jì)軟件，采用新復(fù)極差法進(jìn)行數(shù)據(jù)間差異的顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 NtCycB2基因敲除和分子鑒定

對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化的煙草8306-1株系葉片進(jìn)行分子鑒定。在潮霉素（8 mg/L）篩選培養(yǎng)基上獲得13株潮霉素陽性植株，對(duì)T0代陽性植株進(jìn)行目的基因和抗性基因的PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物測序，結(jié)果見圖1。圖1表明，8306-1株系中存在兩個(gè)NtCycB2基因拷貝，對(duì)其進(jìn)行單克隆測序，在所檢測的1株編號(hào)C6單克隆中檢測到兩種類型的突變，分別插入單堿基G和插入單堿基A，并未檢測到野生型序列，說明C6中NtCycB2基因的兩個(gè)拷貝已經(jīng)發(fā)生純合突變，翻譯出來的氨基酸鏈縮短，導(dǎo)致翻譯出來的蛋白喪失原有功能。使用潮霉素抗性基因?qū)1代幼苗進(jìn)行篩選，得到純合無標(biāo)記基因的株系，自交繁種并命名為8306-2。

CK.8306 1.8306-1 2.8306-2；1和2黃色標(biāo)注部分為突變堿基，紅色標(biāo)注部分為氨基酸序列差異圖1 煙草8306-1株系中NtCycB2基因敲除鑒定及氨基酸序列變化Fig.1 Identification of NtCycB2 gene knockout and amino acid sequence changes of tobacco 8306-1 line

2.2 NtCycB2基因敲除對(duì)煙草農(nóng)藝性狀的影響

NtCycB2基因敲除株系的田間觀察和農(nóng)藝性狀調(diào)查結(jié)果見圖2。圖2顯示，8306品系、8306-1與8306-2株系的生長發(fā)育狀況基本一致。由表2調(diào)查結(jié)果可知，8306品系和兩個(gè)株系在農(nóng)藝性狀指標(biāo)如株高、葉數(shù)和節(jié)距等均無顯著差異。

表2 不同株系的農(nóng)藝性狀比較①Tab.2 Agronomic traits of different lines

圖2 不同株系田間植株的形態(tài)比較Fig.2 Morphological comparison of tobacco plants in fields among different lines

2.3 NtCycB2基因敲除對(duì)煙草腺毛形態(tài)和腺毛密度的影響

使用超景深顯微鏡觀察8306品系和創(chuàng)制的兩個(gè)株系葉片的腺毛形態(tài)，結(jié)果見圖3。葉面腺毛均以長柄分泌型為主，同時(shí)存在短柄分泌型和非分泌型腺毛，8306-2株系存在較多分枝型和長柄分泌型腺毛。對(duì)腺毛密度分析發(fā)現(xiàn)，8306品系和8306-1株系腺毛總數(shù)和不同腺毛類型數(shù)量均無顯著差異，而8306-2株系的腺毛總數(shù)、長柄分泌型腺毛和短柄分泌型腺毛數(shù)量與8306品系和8306-1株系相比均存在顯著差異。與8306-1株系相比，8306-2株系腺毛總數(shù)提高25.3%，長柄分泌型腺毛密度提高30.7%，短柄分泌型腺毛密度提高26.1%。可見，NtCycB2基因敲除植株的腺毛密度顯著提高，且存在較多的分枝型腺毛。

圖3 不同株系葉片腺毛觀察和腺毛密度比較Fig.3 Appearance and density of glandular trichomes on leaves of different lines

2.4 NtCycB2基因敲除對(duì)葉面化學(xué)成分的影響

GC/MS分析結(jié)果見圖4。從圖4中可以看出，在化學(xué)成分種類上，8306品系和兩個(gè)株系中均含有西柏烷類二萜和蔗糖酯類物質(zhì)，但8306-1和8306-2兩個(gè)株系中不含有賴百當(dāng)二醇。在葉面化合物含量上，8306-2株系顯著高于8306品系和8306-1株系，且西柏烷類成分含量提高95.7%和93.4%，蔗糖酯類成分含量提高60.8%和62.5%。說明敲除NtCycB2基因可以顯著提高葉面化合物含量。

圖4 不同株系的葉面化合物含量比較Fig.4 Contents of leaf surface chemical compounds of different lines

2.5 NtCycB2基因突變對(duì)煙草二萜代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響

對(duì)移栽后60 d中部煙葉進(jìn)行qRT-PCR檢測，結(jié)果見圖5。與8306品系和8306-1株系相比，8306-2株系二萜合成途徑關(guān)鍵基因NtABS、NtCPS2、NtCBT和NtCYP71D16的相對(duì)表達(dá)量明顯上調(diào)，其上游基因NtGPPS和NtGGPPS的相對(duì)表達(dá)量無顯著變化，說明敲除NtCPS2對(duì)二萜代謝通路相關(guān)合成基因表達(dá)量無影響，而敲除NtCycB2基因在增加腺毛密度的同時(shí)二萜相關(guān)合成基因NtABS、NtCPS2、NtCBT和NtCYP71D16的相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)，但對(duì)其上游基因NtGPPS和NtGGPPS的相對(duì)表達(dá)量無顯著影響。

圖5 不同株系二萜代謝相關(guān)基因的表達(dá)量比較Fig.5 Expression quantities of genes associated with diterpene metabolism in different lines

3 結(jié)論

通過基因編輯技術(shù)獲得了NtCycB2基因敲除的純合突變株系8306-2。該株系的長柄分泌型腺毛密度顯著提高，使葉面腺毛分泌物總量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于8306品系和8306-1株系；而其腺毛分泌物組成成分則與8306-1株系相同，且均缺少8306品系中的賴百當(dāng)二萜類化合物。腺毛分泌物合成關(guān)鍵基因NtCBT、NtCYP71D16、NtCPS2和NtABS的表達(dá)水平在NtCycB2和NtCPS2基因共敲除的8306-2株系中明顯上調(diào)，而在NtCPS2基因突變的8306-1株系中并未發(fā)生顯著變化。二萜生物合成的上游基因NtGPPS和NtGGPPS的表達(dá)并不受NtCycB2和NtCPS2基因敲除的影響，說明二者功能缺失對(duì)煙草整個(gè)萜類代謝并無明顯影響。8306-2和8306-1株系田間生長發(fā)育正常、農(nóng)藝性狀與8306品系無明顯差異。可見，8306-2株系中NtCycB2和NtCPS2基因的共敲除，顯著提高了腺毛密度，并改變了分泌物的代謝流向，具有葉面腺毛分泌物含量高和不含賴百當(dāng)類物質(zhì)的特點(diǎn)。

責(zé)任編輯? 董志堅(jiān)