基于分子模擬技術(shù)的核因子κB蛋白解離阻滯化合物篩選

梁佳龍，劉飛遠(yuǎn)，孫智勇，劉建青

0 引 言

高原地區(qū)強(qiáng)紫外線輻射導(dǎo)致各類皮膚問(wèn)題嚴(yán)重影響、困擾駐地群眾、官兵的身心健康和工作、生活質(zhì)量。有研究報(bào)道，喀喇昆侖高原進(jìn)駐官兵皮膚患病率高于平原地區(qū)進(jìn)駐者，達(dá)到54.29%[1]。誘發(fā)紫外線損傷的因素眾多，其中核因子κB蛋白(NF-κB)是其中之一。NF-κB蛋白作為細(xì)胞中的核轉(zhuǎn)錄因子[2-3]，通常在細(xì)胞質(zhì)中，以二聚體的形式存在[4]，處于非活化態(tài)。機(jī)體在受到細(xì)菌、病毒感染[5]，紫外線照射[6-7]，發(fā)生免疫、炎癥和應(yīng)激反應(yīng)時(shí)[8]，抑制物I-κB可被激活并被泛素依賴性蛋白酶所降解[9-10]，從而釋放出NF-κB，其進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)可以激活靶基因的轉(zhuǎn)錄[11]，影響細(xì)胞的分化和發(fā)育[12]，誘發(fā)細(xì)胞的無(wú)限增殖從而導(dǎo)致癌癥。本研究旨在應(yīng)用分子模擬技術(shù)尋找一種可以切斷NF-κB解離功能的先導(dǎo)化合物，為研發(fā)抗紫外線損傷藥物奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源Studer等[13]課題組的研究發(fā)現(xiàn)一種內(nèi)源性化合物具有NF-κB解離阻滯功能，其在蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)資料數(shù)據(jù)庫(kù)(Research Collaboration for Structural Bioinformatics，Protein Data Bank，簡(jiǎn)稱RCSB PDB)中編碼是6SH6。

1.2 實(shí)驗(yàn)軟件使用Discovery Studio 3.5(DS3.5)軟件進(jìn)行全部分子模擬計(jì)算。

1.3 藥效團(tuán)模型的構(gòu)建為提高藥效團(tuán)模型對(duì)化合物數(shù)據(jù)庫(kù)篩選的精度和成藥性[14]，本研究藥效團(tuán)模型以基于配體-受體相互作用模式進(jìn)行構(gòu)建。在DS3.5軟件中，π-π堆積的判斷條件為兩組結(jié)構(gòu)幾何中心相互之間的距離在5.5?之內(nèi)，且兩組芳香環(huán)幾何平面之間幾何中垂線夾角在50°以內(nèi)，氫鍵的判斷條件為兩組結(jié)構(gòu)幾何中心之間的距離在3.8?之內(nèi)。

1.4 虛擬篩選使用加州大學(xué)舊金山分校(UCSF)的ZINC15數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建，依據(jù)成藥五規(guī)則精簡(jiǎn)化合物，應(yīng)用DS3.5軟件中的build 3D 數(shù)據(jù)庫(kù)工具構(gòu)建化合物數(shù)據(jù)庫(kù)，共得到10342180個(gè)符合成藥5規(guī)則的化合物的數(shù)據(jù)庫(kù)，從中再用藥效團(tuán)模型進(jìn)行虛擬篩選。

1.5 分子對(duì)接為確定分子對(duì)接的算法優(yōu)劣[15-16]，使用DS3.5軟件中的Ligandfit、CDOCKER、Libdock三種對(duì)接方法分別將6SH6晶體復(fù)合物結(jié)構(gòu)中內(nèi)源性小分子與受體蛋白質(zhì)進(jìn)行對(duì)接，驗(yàn)證對(duì)接是否能重現(xiàn)6SH6中的結(jié)合作用模式，選用復(fù)現(xiàn)結(jié)合作用模式最佳的對(duì)接方法[17-18]，進(jìn)行精密的分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)，以便將對(duì)接結(jié)果最好的化合物篩選出來(lái)。

1.6 分子動(dòng)力學(xué)模擬將分子動(dòng)力學(xué)模擬的起始狀態(tài)設(shè)定為1.5分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)中獲得的最優(yōu)結(jié)構(gòu)，使用DS3.5軟件中的solvation算法模塊，模擬細(xì)胞質(zhì)溶液中的狀態(tài)。使用標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)力學(xué)級(jí)聯(lián)(standard dynamics cascade，SDC)算法進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬，設(shè)定溶液基準(zhǔn)溫度為300K，動(dòng)態(tài)過(guò)程選用升溫-平衡-降溫程序，平衡過(guò)程選用恒溫恒壓參數(shù)進(jìn)行，采樣間隔2fs，動(dòng)態(tài)模擬500ns中結(jié)合作用模式的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程。計(jì)算受體蛋白的各氨基酸的均方根漲落(root mean square fluctuation，RMSF)值。RMSF值表示在分子動(dòng)力學(xué)模擬的過(guò)程之中氨基酸運(yùn)動(dòng)的自由程度。在DS3.5軟件之中，RMSF的計(jì)算原理是將氨基酸中的各原子作為一個(gè)整體，計(jì)算其在分子動(dòng)力學(xué)模擬的整體時(shí)間之中偏移距離平方之和隨時(shí)間平均的平方根。

2 結(jié) 果

2.1 內(nèi)源性NF-κB解離阻滯化合物結(jié)合作用模式和藥效團(tuán)模型為尋找具有潛在阻斷NF-κB解離過(guò)程的藥物分子，本研究通過(guò)對(duì)6SH6晶體結(jié)構(gòu)解析可知，其與受體蛋白之間可以形成多組相互之間作用，其三維結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。其與I-κB蛋白之間相互作用，具體表現(xiàn)為：化合物的嘧啶并咪唑雜環(huán)于204Arg、401Phe共形成2組π-π堆積，距離分別為4.08 ?、4.48?，呋喃環(huán)上的羥基與431Asp形成1組氫鍵，距離為2.31 ?，兩個(gè)磷酸殘基則分別于163Gly、164Ser、165Gly、166Lys、167Thr、168Thr形成氫鍵相互作用，距離分別是2.67 ?、3.10 ?、3.10 ?、2.67 ?、2.97 ?、2.93 ?。據(jù)此相互作用關(guān)系，課題組共構(gòu)建了6個(gè)藥效團(tuán)的模型，分別包含了3組氫鍵受體、2組氫鍵供體和1組π-π堆積效應(yīng)。

圖1 內(nèi)源性NF-κB解離阻滯化合物與受體蛋白結(jié)合三維結(jié)構(gòu)圖

2.2 粗篩結(jié)果使用ZINC15化合物數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)上述構(gòu)建的藥效團(tuán)模型進(jìn)行篩選，共篩選出347個(gè)與藥效團(tuán)模型相符合的化合物。

2.3 對(duì)接方法選定與對(duì)接結(jié)果對(duì)Discovery Studio3.5軟件中提供的3種不同分子對(duì)接方法(Ligandfit、CDOCKER、Libdock)進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，基于能量最低的CDOCKER方法在重復(fù)復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)相互之間作用模式過(guò)程中表現(xiàn)最佳。因此上述通過(guò)藥效團(tuán)模型篩選得到的347個(gè)化合物與6SH6蛋白受體進(jìn)行的分子對(duì)接，決定選用CDOCKER的算法進(jìn)行。除去所有原本存在于6SH6復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)中的配體分子，將蛋白質(zhì)中的氨基酸殘基全部補(bǔ)齊，并將其中的水分子去除，選用CHARMm力場(chǎng)作為分子對(duì)接的力場(chǎng)，對(duì)接區(qū)域范圍設(shè)定為原化合物中心區(qū)域半徑10?范圍，每個(gè)化合物對(duì)接結(jié)果均保留得分最高的10個(gè)構(gòu)象。結(jié)果顯示：276號(hào)化合物在前10個(gè)打分最高的構(gòu)象中占了60%，其中排名第一的化合物結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖2。

圖2 276號(hào)化合物與與受體蛋白結(jié)合三維結(jié)構(gòu)圖

將內(nèi)源性化合物與蛋白結(jié)合作用結(jié)構(gòu)圖與本研究篩選得到的276號(hào)化合物與蛋白結(jié)合作用結(jié)構(gòu)圖進(jìn)行疊加，從中可見(jiàn)兩者處于同一蛋白活性口袋中，具有高度相似的結(jié)合作用模式，證實(shí)篩選結(jié)果有效。見(jiàn)圖3。

圖3 276號(hào)化合物(灰紅)、內(nèi)源性化合物(綠色)與受體結(jié)合三維結(jié)構(gòu)圖

276號(hào)化合物結(jié)構(gòu)中的8個(gè)磺酸基團(tuán)分別于Lys133, Arg 134，Gly 165，Thr 167，Thr 168，Arg 204，Thr 426, Ser 427，Thr 429，Asp 431，Arg475，分別形成了11組氫鍵，距離分別為2.85?、2.58?、2.39?、2.73?、2.48?、2.02?、2.53?、1.94?、2.90?、2.06?、2.08?。

2.4 分子動(dòng)力學(xué)模擬結(jié)果276號(hào)化合物與6SH6的分子動(dòng)力學(xué)模擬實(shí)驗(yàn)持續(xù)約16 h，體系溫度維持在296.51～302.61 K之間。受體蛋白的各氨基酸的RMSF值見(jiàn)圖4。 276號(hào)化合物與受體蛋白結(jié)合部位的氨基酸RMSF值較小，關(guān)鍵作用部位的結(jié)合作用穩(wěn)定。

圖4 受體蛋白各氨基酸均方根漲落(RMSF)圖

3 討 論

NF-κB可被細(xì)胞活素、氧自由基、吸入性顆粒、促有絲分裂劑、有毒金屬、紫外線照射等激活，在皮膚癌的發(fā)生、發(fā)展和惡化之中起到了關(guān)鍵的作用。紫外線中的UVB照射皮膚后可促使皮膚內(nèi)氧自由基形成，激活NF-κB，引起皮膚加速老化，皮膚腫瘤形成和免疫抑制反應(yīng)導(dǎo)致急性皮膚曬傷。抑制NF-κB的活性，是化學(xué)藥物預(yù)防皮膚癌和抗紫外線損傷發(fā)展的關(guān)鍵。目前一些NF-κB抑制劑已經(jīng)被運(yùn)用于皮膚癌治療過(guò)程中，并取得了一定的效果。如何篩選出特異性強(qiáng)、不良反應(yīng)小的NF-κB抑制劑是目前研究的關(guān)鍵。

盡管本研究得到的276號(hào)化合物在對(duì)接結(jié)果、動(dòng)力學(xué)模擬等方面都展現(xiàn)出了其在抑制NF-κB解離方面可能具有一定的效果，但這種結(jié)果只是基于計(jì)算機(jī)模擬的結(jié)果，其真正是否具有藥理活性，還需要?jiǎng)游飳?shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)行驗(yàn)證，但新藥研發(fā)是一個(gè)長(zhǎng)期且投入巨大的工作過(guò)程，而利用計(jì)算機(jī)的輔助篩選技術(shù)可以大大降低研究的時(shí)間和成本，提高新藥發(fā)現(xiàn)的概率，而且隨著學(xué)術(shù)界對(duì)NF-κB的蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)的深入廣泛研究，在一定程度上為我們發(fā)現(xiàn)NF-κB解離阻滯化合物方面，在篩選的準(zhǔn)確性方面，提供了有力的保障。

與Studer等[13]課題組發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性解離阻滯化合物相比，本研究中篩選得到的可能具有解離阻滯作用的276號(hào)化合物，兩者與蛋白的相互作用都是靜電相互作用，且都是電中性。雖然靜電相互作用是這類分子與蛋白相互作用的關(guān)鍵，但從本研究篩選結(jié)果以及Studer等[13]課題組的研究結(jié)果看，化合物極性可能不是這類藥物篩選的關(guān)鍵，但為了確保篩選結(jié)果的準(zhǔn)確，后期本研究將對(duì)化合物不同極性的結(jié)合作用效果進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證，以期得到更好的先導(dǎo)化合物。

本研究得到的276號(hào)化合物是基于分子模擬技術(shù)的藥物理性設(shè)計(jì)結(jié)果，其是否具有NF-κB解離阻滯效果還需要進(jìn)一步的活性試驗(yàn)。后續(xù)可對(duì)6SH6蛋白進(jìn)行定點(diǎn)突變，對(duì)Lys133, Arg 134，Gly 165，Thr 167，Thr 168，Arg 204，Thr 426, Ser 427，Thr 429，Asp 431，Arg475等氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變，觀察其余受體蛋白結(jié)合的程度從而初步判斷276號(hào)化合物的生物活性。

通?？诜幬锓肿拥南鄬?duì)分子質(zhì)量不超過(guò)500，而276號(hào)化合物約為965.87，且其結(jié)構(gòu)之中包含多個(gè)磺酸基的結(jié)構(gòu)，在化合物成藥性上存在一定的不足。之所以在打分系統(tǒng)中沒(méi)有將相對(duì)分子質(zhì)量低于500納入打分系統(tǒng)，主要考慮在虛擬篩選過(guò)程中，化合物之間相互作用的穩(wěn)定性更顯得尤為重要。雖然化合物相互作用穩(wěn)定性強(qiáng)且相對(duì)分子質(zhì)量低于500的化合物是最理想的篩選結(jié)果，但從本研究中篩選得到的347個(gè)先導(dǎo)化合物中，相對(duì)分子質(zhì)量低于500的先導(dǎo)化合物與受體蛋白之間的結(jié)合作用模式均弱于Studer MK課題組中的內(nèi)源性化合物，因此本研究中保留了部分相對(duì)分子質(zhì)量大于500的化合物結(jié)構(gòu)。后期，在確保結(jié)合作用模式不減弱的情況下，課題組將重點(diǎn)考慮對(duì)276號(hào)化合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，如考慮削減磺酸基基團(tuán)，運(yùn)用質(zhì)量較輕且結(jié)構(gòu)類似的基團(tuán)進(jìn)行替代，以改善其在體內(nèi)的ADMET(Absorption吸收、Distribution分布、Metabolism代謝、Excretion排泄、Toxcity毒性)性質(zhì)。

對(duì)于NF-κB解離阻滯化合物的研究，本課題組在現(xiàn)有研究基礎(chǔ)上，下一步將對(duì)得到的276號(hào)化合物開(kāi)展更為深入的理論研究，如：分子軌道能量、關(guān)鍵氨基酸殘基的能量差異以及作用力特征等信息，從而對(duì)新藥研發(fā)提供更多的理論支撐，此外建立紫外線損傷大鼠動(dòng)物模型，盡早開(kāi)展動(dòng)物活性實(shí)驗(yàn)也是必不可少的工作。

本研究通過(guò)構(gòu)建NF-κB的抑制蛋白I-κB與內(nèi)源性配體之間的藥效團(tuán)模型，使用分子對(duì)接、動(dòng)力學(xué)模擬技術(shù)，找到具有可能具有抑制NF-κB解離作用、可用于抗紫外線損傷的先導(dǎo)藥物。通過(guò)對(duì)該先導(dǎo)化合物的結(jié)合作用模式進(jìn)行分析、分子動(dòng)力學(xué)模擬實(shí)驗(yàn)，顯示276號(hào)化合物與I-κB蛋白可以形成穩(wěn)定的作用模式，從而阻斷NF-κB的解離。因此，276號(hào)化合物可能是潛在的NF-κB解離阻滯化合物，可能具有抑制外界刺激下細(xì)胞的無(wú)限增殖等癌變過(guò)程的效果。