下調(diào)lncRNA-H19表達(dá)促進(jìn)人瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞凋亡和自噬

黃 云，許喜生，陳 凱，何 秀

(1.郴州市第一人民醫(yī)院 燒傷整形外科，湖南 郴州 423000； 2.郴州市第一人民醫(yī)院兒童醫(yī)院 兒童呼吸內(nèi)科，湖南 郴州 423000)

瘢痕疙瘩(keloid)俗稱疤痕疙瘩，屬于皮膚良性腫瘤的一種，也是困擾皮膚及傷口正常愈合的主要問(wèn)題之一[1]。Keloid發(fā)病機(jī)制復(fù)雜且不明確，目前研究發(fā)現(xiàn)，成纖維細(xì)胞異常增殖及胞外基質(zhì)異常沉積是keloid形成的主要病理表現(xiàn)[2]，抑制成纖維細(xì)胞過(guò)度增殖并促進(jìn)其凋亡，對(duì)緩解keloid形成發(fā)展有一定的臨床意義[3]。自噬在細(xì)胞凋亡、存活過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[4]，其過(guò)度自噬及自噬不足，均可影響細(xì)胞的功能穩(wěn)態(tài)而參與細(xì)胞凋亡及存活過(guò)程[5]。但自噬在keloid成纖維細(xì)胞(keloid fibroblasts，KFs)異常增殖中扮演怎樣的角色，也一直存在爭(zhēng)議[6]。長(zhǎng)度大于200的非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)可廣泛參與細(xì)胞增殖、分化、衰老、凋亡、周期調(diào)控及X染色體印跡等多種生物學(xué)過(guò)程[7]，而受到臨床研究的重視。已有研究發(fā)現(xiàn)lncRNA-H19在keloid組織表達(dá)中異常增高，且下調(diào)lncRNA-H19能抑制KFs增殖[8]，但lncRNA-H19下調(diào)是否能通過(guò)調(diào)控自噬，促進(jìn)KFs凋亡，來(lái)緩解keloid病理進(jìn)程，還不甚清楚。本研究體外培養(yǎng)KFs細(xì)胞，對(duì)此進(jìn)行探討，以期闡明lncRNA-H19在KFs自噬、凋亡中的靶向調(diào)控機(jī)制，為keloid的治療提供實(shí)驗(yàn)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

細(xì)胞及主要試劑：人類瘢痕成纖維細(xì)胞系(KFs)(上海細(xì)胞研究所)；健康人皮膚成纖維細(xì)胞系(human dermal fibroblasts,HDFs)(上海朗生科技有限公司)；DMEM培養(yǎng)基[舜冉(上海)生物科技有限公司]；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(上海研卉生物科技有限公司)；Ad-mTOR和ad-eGFP(規(guī)格200μL，腺病毒滴度為2×109PFU/mL,感染效率大于85%)(南京善本生物科技有限公司)；lncRNA-H19F低表達(dá)腺病毒(si-lncRNA-H19)及不含si-lncRNA-H19的空病毒載體(si-eGFP)[漢恒生物科技(上海)有限公司]；Caspase3及PARP、自噬標(biāo)記蛋白-LC3Ⅱ、Atg7、mTOR及磷酸化mTOR(p-mTOR)和ULKl抗體(均Abcam公司)；吖啶橙(Ao)熒光染色試劑盒(北京伊塔生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組處理：取KFs及HDFs細(xì)胞系常規(guī)復(fù)蘇后，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)貼壁傳代培養(yǎng)。

取對(duì)數(shù)期KFs及HDFs細(xì)胞，按6×104個(gè)/孔接種于6孔板內(nèi)，并設(shè)置為HDFs組、KFs組、si-lncRNA-H19+KFs組、si-eGFP+KFs組，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。HDFs組及KFs組不做任何處理正常培養(yǎng)，si-lncRNA-H19+KFs組及si-eGFP+KFs組待KFs細(xì)胞匯合度達(dá)50%～60%時(shí)，采用腺病毒向KFs細(xì)胞感染lncRNA-H19低表達(dá)序列及空載體，記為si-lncRNA-H19+KFs組及si-eGFP+KFs組。各感染組于感染后24 h，取細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，用qRT-PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞感染效果。

取KFs細(xì)胞，按1×105個(gè)/孔接種于96 孔板內(nèi)，并設(shè)置為：KFs組(未感染組)、si-lncRNA-H19+Ad-mTOR組、si-eGFP+Ad-mTOR組、si-lncRNA-H19+Ad-eGFP組、si-eGFP+Ad-eGFP組，si-lncRNA-H19+Ad-mTOR組感染lncRNA-H19低表達(dá)腺病毒(si-lncRNA-H19)及mTOR過(guò)表達(dá)腺病毒(Ad-mTOR)；si-eGFP+Ad-mTOR組感染lncRNA-H19空載體腺病毒(si-eGFP)及Ad-mTOR，si-lncRNA-H19+Ad-eGFP組感染si-lncRNA-H19及mTOR空載體(Ad-eGFP)；si-eGFP+Ad-eGFP組感染si-eGFP及Ad-eGFP，各組均于感染后24 h，取細(xì)胞按1.2.6方法檢測(cè)細(xì)胞凋亡與自噬相關(guān)蛋白表達(dá)。

1.2.2 qRT-PCR檢測(cè)不同細(xì)胞系中l(wèi)ncRNA-H19相對(duì)表達(dá)水平：取對(duì)數(shù)期KFs及HDFs細(xì)胞，用RNA試劑盒提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以cDNA為模板，按照qRT-PCR試劑盒進(jìn)行PCR反應(yīng)(反應(yīng)體系：上下游引物各0.5 μL，H2O 8 μL，2×SYBR mix 10 μL，10×cDNA模板1 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性20 s，60 ℃退火55 s，50個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸15 min)。lncRNA-H19(上游引物：5′-TCCTTCATTCCACCGGAGTCTG-3′，下游引物：5′-CGGAAGTAAGGTGGCTAGACC-3′)以GAPDH為內(nèi)參，用2-ΔΔCt算法，計(jì)算lncRNA-H19表達(dá)水平。

1.2.3 流式細(xì)胞測(cè)量術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率：細(xì)胞用胰蛋白酶消化6 min，1 000 r/min離心5 min，1 mL磷酸緩沖溶液重懸后合并沉淀物制成單細(xì)胞懸液，按annexinV-EGFP/PI雙染試劑盒說(shuō)明書(shū)方法進(jìn)行，染色孵育后，在流式儀上進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)。

1.2.4 透射電鏡及吖啶橙(Ao)熒光染色觀察細(xì)胞自噬：取細(xì)胞，沿培養(yǎng)皿壁加入戊二醛固定、包埋并制成切片后，置于透射電鏡下觀察細(xì)胞自噬小體及自噬溶酶體形成情況。

取細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，用4%多聚甲醛固定10 min后，加入終濃度為5 μg/mL的Ao試劑，避光孵育10 min后，置于熒光顯微鏡下觀察自噬泡形成情況。

1.2.5 免疫組化法檢測(cè)細(xì)胞mTOR陽(yáng)性表達(dá)：取細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，用4%多聚甲醛固定10 min后，加入一抗抗體(mTOR，1∶500)4 ℃孵育6 h，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗(1∶1 000)室溫孵育30 min后，用DAB顯色，蘇木精復(fù)染后，置于顯微鏡下觀察拍照。

1.2.6 Western blot檢測(cè)細(xì)胞蛋白表達(dá)：取細(xì)胞，用蛋白提取試劑盒提取蛋白，BCA法測(cè)定細(xì)胞蛋白濃度后，取50 μg蛋白樣品行上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜反應(yīng)，加入一抗caspase3、PARP、mTOR、p-mTOR、ULKl抗體(1∶1 500)，內(nèi)參抗體GAPDH(1∶2 000)，4 ℃孵育過(guò)夜，加入辣根過(guò)氧化物酶二抗(1∶3 000)，室溫下孵育4 h。顯影曝光后，用化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)拍照并分析灰度值。每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 不同細(xì)胞系中l(wèi)ncRNA-H19表達(dá)變化

瘢痕成纖維細(xì)胞系(KFs)中l(wèi)ncRNA-H19表達(dá)為(2.06±0.13)，顯著高于正常皮膚成纖維細(xì)胞系(HDFs)的(1.09±0.08)(P<0.05)。

2.2 下調(diào)lncRNA-H19表達(dá)后對(duì)KFs細(xì)胞lncRNA-H19表達(dá)的影響

與HDFs組比較，KFs組細(xì)胞lncRNA-H19表達(dá)升高(P<0.05)；與KFs組相比，si-lncRNA-H19+KFs組細(xì)胞lncRNA-H19表達(dá)降低(P<0.05)(表1)。

表1 細(xì)胞lncRNA-H19表達(dá)比較

2.3 下調(diào)lncRNA-H19表達(dá)后對(duì)KFs細(xì)胞凋亡的影響

與KFs組細(xì)胞相比，si-lncRNA-H19+KFs組細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05)(圖1，表2)。

圖1 各組細(xì)胞流式凋亡圖Fig 1 Flow cytometric diagram of cell apoptosis in each group

表2 各組細(xì)胞凋亡率比較

2.4 下調(diào)lncRNA-H19表達(dá)后對(duì)細(xì)胞自噬的影響

HDFs組細(xì)胞粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及高爾基體豐富、線粒體結(jié)構(gòu)正常，偶見(jiàn)個(gè)別線粒體腫脹及自噬小體和自噬溶酶體出現(xiàn)；KFs組及si-eGFP+KFs組可見(jiàn)多個(gè)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹、擴(kuò)張，內(nèi)含大量膠原蛋白，線粒體大量腫脹，胞質(zhì)內(nèi)有大量細(xì)胞器殘?bào)w；si-lncRNA-H19+KFs組可見(jiàn)大量雙層膜囊泡樣結(jié)構(gòu)的自噬小體包繞胞質(zhì)或細(xì)胞器，大量單層膜結(jié)構(gòu)的自噬溶酶體內(nèi)含部分尚未分解的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體等細(xì)胞器殘?bào)w(圖2)。

→indicate autophagosome and auto lysosome圖2 細(xì)胞電鏡觀察圖Fig 2 Electron microscope observation of cells (×80 00)

2.5 下調(diào)lncRNA-H19表達(dá)后對(duì)細(xì)胞自噬泡形成數(shù)目的影響

與HDFs組比較，KFs組細(xì)胞自噬泡形成數(shù)目降低(P<0.05)，mTOR陽(yáng)性表達(dá)升高(P<0.05)；與KFs組細(xì)胞相比，si-lncRNA-H19+KFs組細(xì)胞自噬泡形成數(shù)目升高(P<0.05)，mTOR陽(yáng)性表達(dá)降低(P<0.05)(圖3，表3)。

2.6 下調(diào)lncRNA-H19表達(dá)后對(duì)細(xì)胞凋亡及自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與HDFs組比較，KFs組細(xì)胞caspase3、PARP、LC3Ⅱ、Atg7、ULKl蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，p-mTOR/mTOR蛋白表達(dá)升高(P<0.05)；與KFs組細(xì)胞相比，si-lncRNA-H19+KFs組細(xì)胞caspase3、PARP、LC3Ⅱ、Atg7、ULKl蛋白表達(dá)升高(P<0.05)，p-mTOR/mTOR蛋白表達(dá)降低(P<0.05)(圖4，5)。

→indicate autophastc vesicles圖3 各組細(xì)胞Ao染色圖Fig 3 Ao staining image of cells in each group (×400)

表3 各組細(xì)胞自噬泡形成數(shù)目比較

2.7 si-lncRNA與Ad-mTOR共感染后對(duì)細(xì)胞凋亡及自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與KFs組比較，si-eGFP+Ad-mTOR組細(xì)胞caspase3、LC3Ⅱ、ULKl蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，p-mTOR/mTOR蛋白表達(dá)升高(P<0.05)；si-lncRNA-H19+Ad-eGFP組細(xì)胞caspase3、LC3Ⅱ、ULKl蛋白表達(dá)升高(P<0.05)，p-mTOR/mTOR蛋白表達(dá)降低(P<0.05)。與si-lncRNA-H19+Ad-eGFP組相比，si-lncRNA-H19+Ad-mTOR組caspase3、LC3Ⅱ、ULKl蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，p-mTOR/mTOR蛋白表達(dá)升高(P<0.05)(圖6，7)。

A.HDFs；B.KFs；C.si-lncRNA-H19+KFs;D.si-eGFP+KFs圖4 各組細(xì)胞凋亡及自噬相關(guān)蛋白表達(dá)免疫印跡圖Fig 4 Immunoblotting diagram of apoptosis and autophagy-related protein expression in each group

*P<0.05 compared with HDFs group；#P<0.05 compared with KFs group圖5 各組細(xì)胞中凋亡及自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較Fig 5 Comparison of the expression levels of apoptosis and autophagy-related proteins in each group of cells

A.KFs；B.si-lncRNA-H19+Ad-eGFP；C.si-lncRNA-H19+Ad-mTOR；D.si-eGFP+Ad-mTOR；E.si-eGFP+Ad-eGFP圖6 各組細(xì)胞凋亡及自噬相關(guān)蛋白表達(dá)免疫印跡圖Fig 6 Immunoblotting diagram of apoptosis and autophagy-related protein expression in each group

3 討論

Keloid好發(fā)于10～30歲的健康人群，約有86%keloid患者產(chǎn)生難以控制的瘙癢癥狀，并在很大程度上給患者造成心理自卑及社交障礙[9]。Keloid發(fā)生機(jī)制不明，臨床上仍無(wú)特殊有效的方法延緩并根治keloid。KFs異常增生和胞外基質(zhì)過(guò)度沉積被認(rèn)為是keloid形成的主要病理表現(xiàn)，尋找抑制KFs增生、促進(jìn)KFs凋亡的有效方法，是臨床研究keloid的重點(diǎn)方向。lncRNA-H19能通過(guò)調(diào)控原癌基因表達(dá)、編碼生長(zhǎng)因子及相關(guān)受體表達(dá)， 來(lái)參與細(xì)胞增殖及分化過(guò)程[10]。lncRNA-H19在keloid組織中表達(dá)異常升高，敲低lncRNA-H19后，可降低lncRNA-H19對(duì)相關(guān)RNA調(diào)控作用，達(dá)到抑制KFs增殖、促進(jìn)KFs凋亡的目的，并認(rèn)為lncRNA-H19可能是keloid治療的潛在靶點(diǎn)[11]。本研究發(fā)現(xiàn)敲低lncRNA-H19后，KFs凋亡異常升高，證實(shí)下調(diào)lncRNA-H19表達(dá)可促進(jìn)KFs凋亡，影響KFs存活。

自噬與腫瘤細(xì)胞凋亡關(guān)系密切。腫瘤早期，自噬激活可通過(guò)自噬性死亡的方式發(fā)揮抑制腫瘤增殖作用，而在后期，自噬激活卻能通過(guò)分解、吸收、回收利用代謝物質(zhì)的方式，滿足腫瘤對(duì)能量和營(yíng)養(yǎng)的需求，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞存活[12]。但自噬在keloid過(guò)程中扮演怎樣的角色，也一直存在爭(zhēng)議。在自噬調(diào)控過(guò)程中，Atg7可與LC3結(jié)合形成泛素鏈參與自噬泡的形成，且LC3Ⅱ或LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的變化可判斷自噬處于自噬激活還是抑制狀態(tài)[13]。另外，mTOR通路也是自噬調(diào)控的核心通路之一，大量研究發(fā)現(xiàn)，mTOR中的mTORC1磷酸化激活后，可影響自噬基因ULKl復(fù)合體形成，抑制自噬泡的生成，且mTOR通路活化與keloid形成機(jī)制有關(guān)[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，KFs細(xì)胞中mTOR活性升高的同時(shí)，KFs細(xì)胞自噬處于抑制狀態(tài)，提示mTOR通路活化介導(dǎo)的自噬抑制，可能與KFs凋亡降低關(guān)系密切。lncRNA-H19可激活mTOR途徑，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬激活[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，敲低lncRNA-H19后，KFs細(xì)胞mTOR活性降低，細(xì)胞自噬及凋亡活性顯著升高。但敲低lncRNA-H19的同時(shí)， 促進(jìn)mTOR活性， lncRNA-H19低表達(dá)發(fā)揮的抑制mTOR活化、促進(jìn)KFs細(xì)胞自噬及凋亡作用被明顯減弱。

*P<0.05 campared with KFs； #P<0.05 campared with si-lncRNA-H19+Ad-eGFP圖7 各組細(xì)胞中凋亡及自噬相關(guān)蛋白表達(dá)比較Fig 7 Comparison of apoptosis and autophagy-related protein expression in cells of each group

綜上所述，下調(diào)lncRNA-H19表達(dá)，可抑制mTOR途徑活化，促進(jìn)KFs細(xì)胞自噬及凋亡。這為闡明keloid病理發(fā)生發(fā)展機(jī)制提供一定理論依據(jù)，但細(xì)胞凋亡與自噬關(guān)系復(fù)雜，涉及多個(gè)RNA及靶蛋白的調(diào)控，lncRNA-H19與mTOR及自噬等的靶向調(diào)控作用，還有待進(jìn)一步探究。