苦蕎黃酮提取及分離純化工藝研究

徐 浪，梅 菊，王 玉，王 鵬，孫代華，石萬銀，劉源才，楊 強，童國強，陳志元

（1.勁牌持正堂藥業(yè)有限公司，湖北 黃石 435000；2.勁牌有限公司，湖北 黃石 435100）

苦蕎（Tartary buckwheat）學(xué)名韃靼蕎麥，別名萬年蕎、野蘭蕎、蕎葉七，隸屬于蓼科蕎麥屬（Fagopyrum tataricum Gaertn.），為一年生草本雙子葉植物，與“何首烏、大黃”等同屬蓼科，是我國藥食同源文化的典型體現(xiàn)，具有很高的食藥兩用價值[1]。蕎麥屬植物分為甜蕎和苦蕎2種，與普通蕎麥相比，苦蕎含有更多蘆丁、槲皮素、山奈酸、蕓香糖苷等黃酮類物質(zhì)[2-6]，這些具有生物活性成分的苦蕎黃酮對人體有抗氧化、清除氧自由基、降血糖、降血脂、改善認知功能、抗高血壓和抗動脈粥樣硬化等作用，被譽為“三降食品” （降血糖、降血脂和降血壓），還具有抑菌、抗病毒、防癌、預(yù)防多種慢性疾病等功效[7-13]，在食品加工中廣泛用于各種糕點、調(diào)味品、保健品等生產(chǎn)中，深受人們喜愛[14-16]。提取工藝主要有乙醇浸提法、水煎煮法、超臨界萃取、微波提取、酶法提取、超聲提取等，分離純化工藝主要有大孔樹脂吸附、堿提酸沉和甲醇重結(jié)晶的方法[17-21]。

天然產(chǎn)物的化學(xué)成分十分復(fù)雜，通常含有多糖、黃酮、生物堿等有效成分，而傳統(tǒng)天然產(chǎn)物提取分離方法存在工藝復(fù)雜、分離效率低等不足，應(yīng)用膜分離技術(shù)可去除中藥提取物中的雜質(zhì)，并富集有效部位或有效成分[22]。反溶劑重結(jié)晶是利用結(jié)晶物在主溶劑與反溶劑中的溶解度差異對物質(zhì)重結(jié)晶的過程。主溶劑和反溶劑的種類選取是此技術(shù)的關(guān)鍵[23]。

以苦蕎麥為原料，利用正交試驗考查苦蕎最佳提取工藝條件，并用孔徑為800 D和1 000 D的納濾膜對苦蕎提取液中的苦蕎黃酮進行分離，去除分子量較大的雜質(zhì)，然后采用反溶劑結(jié)晶方法對苦蕎黃酮進一步純化，得到純度較高的苦蕎黃酮提取物，試驗過程不使用酸堿和有毒有害的有機溶劑，綠色無污染，適于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)的推廣應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

苦蕎麥，購自四川省西昌市；對照品蘆?。℉PLC 91.7%，UV 92.4%，批號100080-201811），中檢所提供；氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁，均為分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司提供。

TU901型紫外-可見分光光度計，北京譜析通用儀器有限責(zé)任公司產(chǎn)品；AB135-S型分析天平，梅特勒-托利多公司產(chǎn)品產(chǎn)品；ELGA Option-Q型超純水系統(tǒng)；水浴鍋，上海申生科技有限公司產(chǎn)品產(chǎn)品；膜過濾設(shè)備，濟南博納生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海愛朗儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗方法

1.2.1 對照品溶液制備

取蘆丁對照品20 mg，精密稱量，置于50 mL容量瓶中，加甲醇適量，超聲處理使溶解，放冷，加甲醇至刻度，搖勻。精密量取25 mL，置50 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密量取對照品溶液1，2，3，4，5，6 mL，分別置于25 mL量瓶中，各加水至6.0 mL；加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，混勻，放置6 min；再加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置6 min；加4%氫氧化鈉試液10 mL，再加水至刻度，搖勻，放置15 min。以相應(yīng)試劑為空白，采用紫外-可見分光光度法，在波長500 nm處測定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 供試品溶液的制備

取本品25 mg，精密稱定，置于50 mL容量瓶中，加入60%乙醇適量，搖勻，超聲處理10 min，使其完全溶解，冷卻后定容，作為供試品溶液。

1.2.4 顯色測定

取供試品溶液，過濾，精密量取濾液2 mL，置于25 mL容量瓶中，依照標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備項下的方法，自“加水至6 mL”起，測定吸光度。

1.2.5 苦蕎黃酮檢測方法學(xué)研究

（1）線性范圍試驗。精密稱取蘆丁對照品27.63 mg，按1.2.1的方法對照品溶液進行制備，按1.2.2的方法進行標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Abs=0.012 24C-0.002 6，R2=0.999 9。

（2）精密度試驗。精密稱取苦蕎提取物樣品25.45 mg，按1.2.3的方法進行供試品溶液制備，按1.2.4的方法顯色，于波長500 nm處比色測定，連續(xù)測定6次吸光度，由吸光度計算得到精密度試驗的RSD值為0.070%。

（3）穩(wěn)定性試驗。選擇精密度試驗中樣品溶液，分別在0，5，10，15，20，25，30，60 min測定吸光度，由吸光度計算穩(wěn)定性試驗的RSD值為2.08%。

（4）重復(fù)性試驗。精密稱取苦蕎提取物樣品25 mg，采用體積分數(shù)60%乙醇為溶劑，按照1.2.3的方法各制備6份供試品溶液作為重復(fù)性試驗樣品，按1.2.4的方法顯色，于波長500 nm處比色測定，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得到苦蕎提取物中總黃酮（以蘆丁計）含量平均值為73.05%，重復(fù)性試驗的RSD值為0.80%。

（5）加標(biāo)回收試驗。精密稱定苦蕎提取物樣品9份，分別加入其所含總黃酮含量80%，100%，120%蘆丁對照品溶液（3 830.412 8 mg/L）各3份，搖勻，按1.2.3的方法制備供試品溶液，按1.2.4的方法進行顯色，于波長500 nm處比色測定，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計算含量和回收率。計算得到苦蕎提取物中蘆丁的平均回收率為102.02%，加標(biāo)回收試驗的RSD值為2.06%。

1.2.6 苦蕎黃酮提取工藝研究

（1）單因素提取試驗。①乙醇體積分數(shù)的考查，準(zhǔn)確稱取苦蕎麥100 g，采用單因素試驗，料液比選擇原料質(zhì)量的8倍體積，提取溫度選擇90℃，提取時間選擇2 h，提取次數(shù)2次，考查提取溶劑（30%乙醇，60%乙醇，80%乙醇，95%乙醇）對苦蕎黃酮提取率的影響。②提取溫度的考查，準(zhǔn)確稱取苦蕎麥100 g，采用單因素試驗，乙醇體積分數(shù)選擇80%乙醇，料液比選擇8倍，提取時間選擇2 h，提取次數(shù)2次，考查提取溫度（水浴鍋加熱溫度60，70，80，90℃）對苦蕎黃酮提取率的影響。③料液比的考查，準(zhǔn)確稱取苦蕎麥100 g，采用單因素試驗，乙醇體積分數(shù)80%，提取溫度90℃，提取時間2 h，提取次數(shù)2次，考查料液比（4，8，12，16倍）對苦蕎黃酮提取率的影響。

（2）正交提取試驗。準(zhǔn)確稱取苦蕎麥100 g，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，根據(jù)正交試驗方法，考查乙醇體積分數(shù)、提取溫度、料液比、提取時間4個因素對苦蕎黃酮提取率的影響，每個因素選取3個水平，做L9（34）正交試驗，提取次數(shù)為2次。

L9（34）正交試驗因素與水平設(shè)計見表1。

表1 L9（34）正交試驗因素與水平設(shè)計

（3）提取工藝驗證。準(zhǔn)確稱取苦蕎麥100 g，根據(jù)正交試驗結(jié)果，進行3組平行提取試驗，計算最佳提取工藝的苦蕎黃酮提取率，驗證最佳提取工藝的穩(wěn)定性和合理性。

1.2.7 苦蕎黃酮膜分離試驗

（1）提取液制備。稱取苦蕎麥1 000.0 g，根據(jù)最佳提取工藝進行提取，收集提取液，并用硅藻土過濾機進行粗濾。

（2）微濾。將上述粗濾后的苦蕎提取液用50 nm微濾膜進行循環(huán)微濾，操作參數(shù)：流量1～2 L/h，溫度控制在30～35℃，操作壓力控制在0.5～0.6 MPa。截留液加入60%Vol乙醇繼續(xù)進行微濾，直至透過液收集到過濾前等量體積為止。

（3）納濾。將上述微濾后的提取液，各取一半體積分別用孔徑為800 D和1 000 D的納濾膜進行循環(huán)納濾，操作參數(shù)：流量1～2L/h，溫度控制在30～35℃，操作壓力控制在0.2～0.3 MPa。截留液加入60%Vol乙醇繼續(xù)進行納濾，直至透過液收集到過濾前等量體積為止。

1.2.8 水沉純化苦蕎黃酮試驗

將苦蕎800 D和1 000 D納濾膜過濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮回收乙醇，并加水稀釋到5 000 mL進行水沉，在4℃冰箱中靜置8 h后抽濾，濾餅干燥并進行粉碎分別得到苦蕎黃酮粗提物。

1.2.9 反溶劑結(jié)晶純化苦蕎黃酮試驗

（1）主溶劑對比試驗。分別取2.0 g上述800 D納濾膜分離及水沉純化苦蕎黃酮提取物（苦蕎黃酮含量85.35%），分別加入體積分數(shù)95%乙醇50 mL和無水甲醇溶解，然后分別緩慢加入到425 mL和450 mL純凈水中（調(diào)節(jié)乙醇和甲醇體積分數(shù)到10%），邊加邊攪拌，然后于20℃下靜置結(jié)晶8 h，過濾，結(jié)晶沉淀干燥得苦蕎黃酮提取物。

（2）反溶劑重結(jié)晶乙醇體積分數(shù)對比試驗。分別取3份2.0 g上述800分子量納濾膜分離及水沉純化苦蕎黃酮提取物（苦蕎黃酮含量85.35%），加體積分數(shù)95%乙醇50 mL，然后分別緩慢加入到425.0，187.5，108.3 mL純凈水中（分別調(diào)節(jié)乙醇體積分數(shù)為10%，20%，30%），邊加邊攪拌，然后于20℃下靜置結(jié)晶8 h，過濾，結(jié)晶沉淀干燥得苦蕎黃酮提取物。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦蕎黃酮檢測方法學(xué)研究

2.1.1 線性范圍試驗

線性范圍試驗數(shù)據(jù)表明苦蕎中總黃酮的質(zhì)量濃度在0～49.231 2 m/L范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，且線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R=0.999 9。

2.1.2 精密度試驗

精密度試驗的RSD值為0.070%，表明檢測結(jié)果的隨機誤差較小。

2.1.3 穩(wěn)定性試驗

穩(wěn)定性試驗的RSD值為2.08%，表明供試品溶液在60 min內(nèi)穩(wěn)定性良好。但由于試驗過程中吸光度呈下降趨勢，所以建議供試品溶液顯色后應(yīng)在20 min內(nèi)測試完成。

2.1.4 重復(fù)性試驗

苦蕎提取物中總黃酮（以蘆丁計）含量為73.05%，重復(fù)性試驗的RSD值為0.80%，表明檢測結(jié)果重復(fù)性良好。

2.1.5 加標(biāo)回收試驗

苦蕎提取物中蘆丁對照品溶液的回收率在99.41%～105.90%，平均值為102.02%，RSD值為2.06%。表明該檢測方法檢測苦蕎提取物中總黃酮的含量準(zhǔn)確可靠。

2.2 提取工藝

2.2.1 單因素提取試驗

（1）乙醇體積分數(shù)的考查。不同乙醇體積分數(shù)對苦蕎黃酮提取率的影響，60%乙醇提取的苦蕎黃酮提取率最高。

不同乙醇體積分數(shù)的考查見表2。

表2 不同乙醇體積分數(shù)的考查

（2）提取溫度的考查。不同提取溫度對苦蕎黃酮提取率的影響，提取溫度越高，苦蕎黃酮提取率越高，但80℃與90℃相比提取率基本無差異。

不同提取溫度的考查見表3。

表3 不同提取溫度的考查

（3）料液比的考查。不同料液比對苦蕎黃酮提取率的影響，料液比對苦蕎黃酮提取率影響較小。

不同料液比的考查見表4。

表4 不同料液比的考查

2.2.2 正交提取試驗

正交試驗結(jié)果見表5。

表5 正交試驗結(jié)果

由表5可知，最佳的提取工藝條件為A2B3C2D2，由極差值可知各因素對苦蕎黃酮提取率的影響次序為乙醇體積分數(shù)（A）＞提取溫度（B）＞提取時間（D）＞料液比（C）。其中，料液比和提取時間影響很小，從成本和生產(chǎn)效率的角度考慮，選擇4倍量，因此確定苦蕎麥提取工藝為4倍量60%乙醇，80℃提取2h，提取2次。

2.2.3 提取工藝驗證試驗

最佳提取正交工藝驗證試驗見表6。

表6 最佳提取正交工藝驗證試驗

由表6可知，3組驗證試驗的苦蕎黃酮提取率RSD值為0.65%，說明該提取工藝條件穩(wěn)定可行。

表6 驗證結(jié)果

2.3 膜分離試驗

檢測各步驟苦蕎黃酮質(zhì)量濃度，并計算苦蕎黃酮在膜過濾過程中的轉(zhuǎn)移率。結(jié)果表明，苦蕎黃酮在微濾過程中損失較少，800D和1000D納濾過程黃酮轉(zhuǎn)移率分別為94.53%和94.64%，損失也比較少。

膜過濾試驗結(jié)果見表7。

表7 膜過濾試驗結(jié)果

2.4 水沉純化試驗

將800，1000D納濾膜過濾液回收乙醇并進行水沉分別得苦蕎黃酮粗提物11.77g和11.86g，測定提取物中苦蕎黃酮含量分別為85.35%和83.29%。

2.5 反溶劑結(jié)晶純化試驗

2.5.1 主溶劑對比試驗

主溶劑對比試驗見表8。

表8 主溶劑對比試驗

試驗結(jié)果表明，以乙醇和甲醇作為主溶劑進行反溶劑結(jié)晶的試驗結(jié)果基本無差異，但乙醇與甲醇相比，綠色無污染，且成本低，更適于大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用，因此選擇用乙醇作為主溶劑進行反溶劑結(jié)晶純化。

2.5.2 反溶劑重結(jié)晶乙醇體積分數(shù)對比試驗

對反溶劑重結(jié)晶的乙醇體積分數(shù)進行考查試驗。結(jié)果表明，不同體積分數(shù)的苦蕎黃酮質(zhì)量濃度和提取率差異不大，隨著乙醇體積分數(shù)的增加，苦蕎黃酮含量略有升高，而提取率有所下降。綜合考慮，20%乙醇體積分數(shù)最佳。

反溶劑重結(jié)晶乙醇體積分數(shù)對比試驗見表9。

表9 反溶劑重結(jié)晶乙醇體積分數(shù)對比試驗

3 結(jié)論

正交試驗結(jié)果確定了苦蕎最佳提取工藝為4倍量60%乙醇，80℃提取2h，提取2次。提取驗證試驗表明該工藝條件穩(wěn)定可行。

苦蕎黃酮主要為蘆丁、槲皮素、山奈酚等成分，分子量分別為610.51，302.00，286.23，其中蘆丁占比90%左右。因此，試驗選擇800D和1000D納濾膜進行苦蕎提取液的過濾分離，去除分子量較大的雜質(zhì)，起到純化苦蕎黃酮的目的。

蘆丁、槲皮素等黃酮類成分難溶于水，因此對經(jīng)過膜分離的苦蕎提取液進行濃縮回收乙醇后進行水沉析出苦蕎黃酮沉淀，通過過濾去除水溶性雜質(zhì)，從而對苦蕎黃酮進行純化。

利用苦蕎黃酮在甲醇、乙醇與水中的溶解度差異，進行反溶劑結(jié)晶，可進一步對苦蕎黃酮進行純化。試驗結(jié)果表明，以甲醇和乙醇作為主溶劑的試驗結(jié)果基本無差異，且乙醇綠色無污染、成本低，更適于大規(guī)模生產(chǎn)。同時，對比不同乙醇體積分數(shù)反溶劑結(jié)晶試驗結(jié)果，20%乙醇體積分數(shù)最佳。參考文獻：

[1]姜春麗，蘇新堯，許亞春，等.光照對藥食同源植物苦蕎麥種子中原花青素積累關(guān)鍵酶FtANR，F(xiàn)tLAR基因表達的影響[J].中國中藥雜志，2018，43（3）：469-477.

[2]任強．苦蕎麥化學(xué)成分藥理作用及體內(nèi)代謝研究進展[J].濟寧醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2017，40（4）：251-255.

[3]鄭峰，孫文文，張琦，等.苦蕎籽粒的化學(xué)成分研究[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2011，39（10）：199-203.

[4]季春燕.苦蕎的化學(xué)成分研究[D].楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2005.

[5]包塔娜，彭樹林，周正質(zhì)，等.苦蕎粉中的化學(xué)成分[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2003，15（1）：24-26.

[6]周冉冉，李可心，陳茂彬，等.苦蕎營養(yǎng)、功能和香氣成分的研究進展[J].中國釀造，2018，37（12）：12-15.

[7]Zhu Fan.Chemical composition and health effects of tartary buckwheat[J].Food Chemistry，2016（16）：231-245.

[8]姚佳，靳秔，賈健斌.苦蕎黃酮及其生理功能的研究進展[J].食品科技，2014，39（10）：194-197.

[9]劉剛，譚善財，胡細享，等.黑苦蕎莖葉提取物對高血糖小鼠降血糖功能的研究[J].西南師范大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2012，37（2）：109-113.

[10]張美莉，胡小松．蕎麥生物活性物質(zhì)及其功能研究進展[J].雜糧作物，2004，24（1）：26-29.

[11]Mokoda T，Sun B，Ishiguro A.Antioxidant activities of buckwheat hull extract toward various oxidative stress in vitro and in vivo[J].Biological&Pharmaceutical Bulletion，2001，24（3）：209-213.

[12]胡一冰，楊敬東，鄒亮，等．苦蕎麥藥理研究及臨床應(yīng)用概況[J].成都大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2006，25（4）：271-276.

[13]譚平艷，郭皖北.苦蕎黃酮的生理功能及其作用機制的研究進展[J].醫(yī)學(xué)綜述，2018，24（8）：1 627-1 632.

[14]王愛莉，宋煥祿，王麗麗，等．熏醅對山西苦蕎老陳醋香氣成分的影響[J].中國調(diào)味品，2011，36（10）：93-96.

[15]李謙，秦禮康，夏輔蔚，等．低鹽固態(tài)苦蕎醬油發(fā)酵工藝及理化品質(zhì)研究[J].中國調(diào)味品，2016，41（2）：6-12.

[16]張素云，李謙，秦禮康，等.苦蕎醋風(fēng)味的電子舌和SPME-GC-MS分析[J].中國調(diào)味品，2016，41（12）：104-109.

[17]鄒亮，趙鋼，周濃，等.苦蕎黃酮提取與分離技術(shù)的研究進展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（27）：13 235-13 237.

[18]米智，劉荔貞，武曉紅，等.正交試驗優(yōu)化苦蕎黃酮提取工藝[J].中國調(diào)味品，2019，44（11）：116-119.

[19]張杰，程偉，李娜，等.苦蕎營養(yǎng)成分及其黃酮類物質(zhì)提取工藝研究[J].釀酒，2019，46（5）：12-16.

[20]韓雪梅，許效群，王緣，等.苦蕎葉總黃酮提取純化工藝研究[J].山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2017，37（2）：134-140.

[21]李二冬，黃麗珍，李波，等.苦蕎黃酮的提取分離及生理活性研究進展[J].農(nóng)產(chǎn)品加工，2014（13）：61-64，67.

[22]韓偉，黃海飛，李夢園，等.組合膜技術(shù)在分離中藥有效成分中的應(yīng)用[J].機電信息，2014（35）：36-40.

[23]陳建樑，張林鋒，郭嘉.幾種結(jié)晶方法介紹及其應(yīng)用進展[J].廣州化工，2019，47（17）：49-51.