稀酸水解綠潮藻及發(fā)酵制生物丁醇研究＊

衣 丹，高春蕾，王能飛，龐 敏，張學(xué)雷

（國家海洋局 第一海洋研究所，山東 青島266061）

近年能源危機(jī)引起了世界對未來供應(yīng)不足的普遍關(guān)注，促使人類尋求可再生能源。丁醇是重要化工原料，也是極具潛力的新型生物燃料［1］。聯(lián)合國國際能源署將生物丁醇列為第二代生物燃料［2-3］。但是傳統(tǒng)生產(chǎn)生物丁醇的原料淀粉、糖蜜成本高昂，約占丙酮丁醇發(fā)酵總成本的60%［4］，成為丙酮丁醇發(fā)酵工業(yè)缺乏競爭性的重要因素。同時，隨著地球上人口的急劇膨脹，食品用糧及工業(yè)用糧均感嚴(yán)重不足。而纖維資源是自然界有機(jī)物中分布最廣、生產(chǎn)量最大的可再生生物質(zhì)能源。我國對纖維生物質(zhì)能源的開發(fā)利用主要集中在秸稈、玉米芯、稻草、廢棄木材等，而對海藻生物質(zhì)能源的研究相對較少，我國綠潮藻滸苔資源十分豐富，僅福建沿海每年的產(chǎn)量就在10萬t以上，養(yǎng)殖海域中一年四季均可發(fā)生［5］。2008年以來，我國南黃海連續(xù)3年爆發(fā)綠潮藻，且規(guī)模和生物量一年比一年大，如何處置和利用如此巨大的海藻，已成為我國綠潮藻災(zāi)害防災(zāi)減災(zāi)重大項(xiàng)目研究內(nèi)容之一［6］。因此探索利用綠潮藻滸苔纖維生產(chǎn)燃料成為生物質(zhì)能源發(fā)展戰(zhàn)略的重要組成。

目前，能進(jìn)行丁醇發(fā)酵的微生物有Clostridium acetobutylicum，C.beijerinckii，C.saccharoperbutylacetonicum和C.saccharobutylicum四種［7］。由于溶劑產(chǎn)生菌不能直接有效利用纖維素，因此纖維原料必須先經(jīng)預(yù)處理（物理法、化學(xué)法或生物法）成為單糖再進(jìn)行發(fā)酵［8］。本研究通過稀酸法［9-10］從綠潮藻滸苔中提取還原糖，考察不同條件下滸苔渣的水解情況，并以滸苔渣水解液為底物以丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum）作為發(fā)酵菌，發(fā)酵生產(chǎn)丁醇，探討利用綠潮藻滸苔生產(chǎn)丁醇技術(shù)，實(shí)現(xiàn)海洋生物質(zhì)資源的高效利用。

1 材料與方法

1.1 滸苔藻種

2011-08采自青島海區(qū)漂浮的綠潮藻，主要種類為滸苔（Enteromorphaprolifera）。用干凈海水沖，除去雜物，曬干，放于干燥避光通風(fēng)處儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 菌 種

丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum）CICC8016，購自中國工業(yè)微生物菌種保藏中心。

1.3 儀器與試劑

p H計PHS-3C，生化培養(yǎng)箱GNP-9080BS-Ⅲ，分光光度計UV754N，自動壓力蒸汽滅菌鍋GI54DS，氣相色譜儀Agilent GC（6890N），實(shí)驗(yàn)中所用化學(xué)試劑為分析純。

1.4 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基的成分（g／L）：葡萄糖10；胰蛋白胨5；酵母粉5；大豆蛋白胨5；K2HPO40.5；MgSO4·7H2O 0.2；FeSO4·7 H2O 0.01；L-半胱氨酸0.5。將培養(yǎng)基在115℃下滅菌15 min，熱處理的孢子懸濁液在37℃條件下培養(yǎng)14～16 h后作為接種液。

發(fā)酵培養(yǎng)基：滸苔水解液經(jīng)過抽濾、中和、滅菌后作為碳源，添加其他營養(yǎng)成分作為發(fā)酵培養(yǎng)基。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 滸苔水解反應(yīng)條件

將曬干滸苔用粉碎機(jī)粉碎，過40目篩備用。在250 m L三角燒瓶中加入一定體積和質(zhì)量分?jǐn)?shù)的硫酸，加入一定量的滸苔渣并混勻，研究硫酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)、料水比、水解溫度和水解時間對滸苔渣水解效果的影響。設(shè)計反應(yīng)條件如下：1）硫酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%，1.5%，2%，2.5%，3%，4%，5%；2）料水比（g∶m L）為1∶5，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25；3）反應(yīng)溫度為90，100，110，120，130℃；4）水解時間為10，20，30，40，50，60，90，120 min。

1.5.2 滸苔水解液發(fā)酵

以10%接種量轉(zhuǎn)接種子液到發(fā)酵培養(yǎng)基（50 m L培養(yǎng)基于總?cè)莘e為150 m L的厭氧培養(yǎng)瓶）中，37℃靜置發(fā)酵72 h。發(fā)酵結(jié)束后，取2 m L樣品，8 000 r／min離心10 min后，取上清液，保存于-20℃冰箱，待測。

1.5.3 溶劑質(zhì)量濃度測定

用氣相色譜Agilent GC（6890N）測定溶劑各組分，F(xiàn)ID檢測器。色譜條件：色譜柱Thermo TGWAXMS（30.0 m×320μm×0.5μm），柱溫箱程序升溫：起始50℃，以5℃／min升到150℃，保持10 min，進(jìn)樣溫度160℃，F(xiàn)ID檢測器溫度250℃，H2流速30 mL／min，空氣流速300 mL／min，載氣N2流速4 m L／min，進(jìn)樣量0.2μL，分流比5∶1。

1.5.4 糖質(zhì)量濃度測定

總還原糖質(zhì)量濃度測定分別采用DNS法［11］。

1.5.5 計算方法

還原糖提取率／%=還原糖質(zhì)量濃度×水解液體積／滸苔渣干重×100%

丁醇得率／%=丁醇質(zhì)量濃度／發(fā)酵液還原糖質(zhì)量濃度×100%

溶劑轉(zhuǎn)化率／kg·kg-1=溶劑產(chǎn)量kg／滸苔渣干重kg

2 結(jié) 果

2.1 滸苔稀酸水解

2.1.1 硫酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)對還原糖質(zhì)量濃度和提取率的影響

在料水比為1∶15、溫度為120℃、水解時間為30 min的反應(yīng)條件下，考察不同的硫酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)對滸苔渣水解還原糖產(chǎn)率的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖1）顯示：隨著酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，還原糖質(zhì)量濃度不斷升高，對實(shí)驗(yàn)儀器的腐蝕越強(qiáng)，硫酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)過高又會破壞葡萄糖等單糖分解成羥甲基糠醛、類黑素等［12］影響發(fā)酵，且還原糖提取率在硫酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞3%后，上升幅度不大，因此確定稀酸水解適宜的硫酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%。

圖1 硫酸濃度對還原糖質(zhì)量濃度和提取率的影響Fig.1 The effect of sulfuric acid concentrations on concentration and extraction rate of reducing sugar

2.1.2 料水比對還原糖質(zhì)量濃度和提取率的影響

在溫度為120℃，硫酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%，水解時間為30 min的反應(yīng)條件下，考察不同料水比對滸苔渣水解還原糖產(chǎn)率的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖2）顯示：在料水比小于1∶15時，水解液中還原糖提取率隨著料水比的增大而升高顯著；料水比大于1∶15后，還原糖提取率的增加相對減小。這是因?yàn)榱纤容^小時，滸苔渣和硫酸混合不均勻，硫酸不能完全浸入，不利于水解，所以提取率不高。同時還原糖質(zhì)量濃度隨料水比的增加逐漸降低。當(dāng)料水比為1∶25時，還原糖提取率雖然最高，但還原糖質(zhì)量濃度只有19.12 g／L對后續(xù)的單糖利用不利。綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果料水比采用1∶15最合適。

圖2 料水比對還原糖質(zhì)量濃度和提取率的影響Fig.2 The effect of solid-liquid ratio on concentration and extraction rate of reducing sugar

2.1.3 反應(yīng)溫度對還原糖質(zhì)量濃度和提取率的影響

在料水比為1∶15，酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%，水解時間為30 min的反應(yīng)條件下，考察溫度變化對滸苔渣水解還原糖產(chǎn)率的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示：在90℃時反應(yīng)幾乎不進(jìn)行，100℃還原糖的質(zhì)量濃度和提取率很低，之后隨著溫度的升高，反應(yīng)速率加快，還原糖質(zhì)量濃度及提取率快速提高，但在高溫下生成的單糖會受熱降解，因此，實(shí)驗(yàn)選取最適宜溫度為120℃。

圖3 反應(yīng)溫度對還原糖質(zhì)量濃度和提取率的影響Fig.3 The effect of temperature on concentration and extraction rate of reducing sugar

2.1.4 反應(yīng)時間對還原糖質(zhì)量濃度和提取率的影響

在料水比為1∶15，酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%，水解溫度為120℃的反應(yīng)條件下，考察反應(yīng)時間對滸苔渣水解還原糖產(chǎn)率的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示：隨著反應(yīng)時間的延長，還原糖的質(zhì)量濃度和提取率不斷升高，在60 min后還原糖的質(zhì)量濃度和提取率隨時間的延長變化很小，綜合考慮在實(shí)驗(yàn)中選擇反應(yīng)60 min。

圖4 反應(yīng)時間對還原糖質(zhì)量濃度和提取率的影響Fig.4 The effect of treating time on concentration and extraction rate of reducing sugar

經(jīng)過以上稀酸水解條件的優(yōu)化，得到水解液的還原糖質(zhì)量濃度為32.78 mg／m L，還原糖提取率為49.17%。

2.2 滸苔稀酸水解液發(fā)酵制丁醇

2.2.1 氮源對丁醇發(fā)酵的影響

以中和處理后的滸苔渣水解為發(fā)酵培養(yǎng)基，在其中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%的不同氮源（硫酸銨、氯化銨、乙酸銨、檸檬酸銨、硝酸銨、尿素），并以不加任何氮源的原始發(fā)酵液為對照，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。從圖5分析可知，丙酮丁醇梭菌可利用多種無機(jī)氮源。硝酸銨為氮源時丁醇質(zhì)量濃度很低；以乙酸銨為無機(jī)氮源時，丙酮的質(zhì)量濃度明顯高于其它發(fā)酵，這是由于乙酸銨含有乙酸基，在丁醇發(fā)酵時乙酸基轉(zhuǎn)化為丙酮，從而增加了丙酮的質(zhì)量濃度；總體來說與不添加任何氮源的水解液進(jìn)行發(fā)酵對比，氮源的種類對發(fā)酵影響不大，其中以硫酸銨為氮源時發(fā)酵的丁醇質(zhì)量濃度效果最好。

圖5 氮源種類對丁醇發(fā)酵的影響Fig.5 The effect of nitrogen source on fermentation for butanol production

2.2.2 初始糖質(zhì)量濃度對丁醇發(fā)酵的影響

高質(zhì)量濃度的還原糖底物對丙酮丁醇梭菌有較強(qiáng)的抑制作用，為防止底物對生物體的毒害作用，需將底物濃度維持在一定范圍。

從圖6分析可知隨著還原糖質(zhì)量濃度的增加，丁醇產(chǎn)量也是隨之增加，還原糖質(zhì)量濃度超過30 g／L丁醇產(chǎn)量開始下降，分析原因可能是過高的還原糖質(zhì)量濃度對丙酮丁醇梭菌的生長具有一定的抑制作用，還原糖量過高產(chǎn)生過多的丁酸或乙酸也同時對它的代謝構(gòu)成一定的負(fù)面作用。質(zhì)量濃度在20～40 g／L之間時，還原糖達(dá)到較高的利用率，而且比較穩(wěn)定。當(dāng)還原糖質(zhì)量濃度為30 g／L時，產(chǎn)生的丁醇達(dá)到最大值，產(chǎn)量為3.39 g／L。

圖6 初始糖濃度對丁醇發(fā)酵的影響Fig.6 The effect of initial reducing sugar concentrations on fermentation for butanol production

2.2.3 稀酸水解液丁醇發(fā)酵結(jié)果

由表1可知，在中和后的發(fā)酵液中添加2%的硫酸銨，還原糖質(zhì)量濃度為30 g／L時，發(fā)酵72 h，丁醇質(zhì)量濃度達(dá)到3.39 g／L，總?cè)軇┵|(zhì)量濃度達(dá)4.29 g／L，丁醇得率為11.3%，總?cè)軇┺D(zhuǎn)化率為0.069 kg／kg。

表1 稀酸水解液丁醇發(fā)酵結(jié)果Table 1 The result of hydrolysate fermentation for utanol production

3 討 論

大型綠潮藻滸苔已經(jīng)連續(xù)多年在青島近岸聚集，影響人們正常生活和城市旅游業(yè)的發(fā)展，滸苔是具有開發(fā)潛力的大型海藻，目前我國對滸苔資源的利用還僅限于作為食品、飼料原料和某些生物活性物質(zhì)的提取。利用滸苔作為生物質(zhì)資源生產(chǎn)清潔燃料，是滸苔資源綜合利用的重要選擇，對解決我國生物質(zhì)能資源短缺具有重要意義。

秦松等［13］發(fā)明了滸苔經(jīng)過預(yù)處理、稀酸水解（不需經(jīng)過酶解），發(fā)酵液用氫氧化鈣中和至中性，直接用于制備生物乙醇技術(shù)。張維特等［6］采用酸水解法利用滸苔生產(chǎn)乙醇，用5%硫酸在90℃下處理70 min，經(jīng)釀酒酵母S2發(fā)酵后乙醇質(zhì)量濃度為2.1 g／L，乙醇得率為26%，但是所用硫酸濃度較高，對儀器設(shè)備有一定損害。本研究利用稀酸預(yù)處理可以使?jié)G苔渣中纖維素降解，通過單因素試驗(yàn)確定稀酸預(yù)處理的條件為：硫酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%、料水比1∶15、溫度120℃下處理60 min，可得還原糖濃質(zhì)量濃度為32.78 g／L，還原糖提取率為49.17%。所得還原糖質(zhì)量濃度與張維特［6］用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%硫酸預(yù)處理所得還原濃度39.73 g／L的結(jié)果比稍低，但是硫酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)要小對儀器設(shè)備損害小，對還原糖破壞性低。根據(jù)初始糖質(zhì)量濃度對丁醇發(fā)酵的影響實(shí)驗(yàn)，32.78 g／L的還原糖質(zhì)量濃度更接近理想的發(fā)酵底物濃度，不用稀釋，可以直接用于接下來的丙酮丁醇梭菌發(fā)酵。

綠潮藻滸苔中的纖維素和半纖維素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為33.7%，是良好的纖維素生物質(zhì)來源［14］，目前以滸苔為原料生產(chǎn)丁醇還未見報道。國內(nèi)厭氧發(fā)酵生產(chǎn)生物丁醇的主要原料為玉米、谷物、薯干等淀粉質(zhì)糧食資源。如何利用廉價非糧食原料生產(chǎn)丁醇來降低其生產(chǎn)成本，成為該產(chǎn)業(yè)所必須直面的問題。相關(guān)研究人員正在嘗試用纖維資源替代糧食作物，用于作為丁醇發(fā)酵的原料有玉米、水稻、小麥的秸稈，甜菜蜜糖、稻草等。

本研究以滸苔渣稀酸水解液中和后作為發(fā)酵液，被丙酮丁醇梭菌8016有效利用，在添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的硫酸銨，還原糖質(zhì)量濃度為30 g／L時，厭氧發(fā)酵后可產(chǎn)丁醇3.39 g／L。滸苔經(jīng)稀酸處理和溶劑發(fā)酵，1 kg干滸苔渣可產(chǎn)0.069 kg溶劑，而理論上1 kg玉米可生產(chǎn)0.265 kg溶劑，1 kg糖蜜（含蔗糖50%）可生產(chǎn)0.15 kg溶劑，1 kg干稻草可生產(chǎn)0.103 kg溶劑［4］，因此1 kg干滸苔渣可相當(dāng)0.26 kg玉米、0.46 kg糖蜜或0.67 kg干稻草。可見，綠潮藻滸苔水解液的丙酮丁醇發(fā)酵有著巨大的潛在應(yīng)用價值。隨著預(yù)處理方法的改進(jìn)，水解液脫毒處理，相信可以進(jìn)一步提高丁醇產(chǎn)量，也是今后的研究方向。

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［1］ HUANG X，CAI Y H.Research status and progress of biological butanol［J］.Sci-tech Information Development And Economy，2010，20（35）：148-150.黃瀟，蔡穎慧.生物丁醇研究現(xiàn)狀及進(jìn)展［J］.科技情報開發(fā)與經(jīng)濟(jì)，2010，20（35）：148-150.

［2］ LEE S Y，PARK J H，JANG S H，et al.Fermentative butanol production by clostridia［J］.Biotechnology and Bioengineering，2008，101（2）：209-228.

［3］ LIU Y，LIU H J，ZHANG J A，et al.Research progress in new biofuel butanol［J］.Modern Chemical Industry，2008，28（6）：28-33.劉婭，劉宏娟，張建安，等.新型生物燃料-丁醇的研究進(jìn)展［J］.現(xiàn)代化工，2008，28（6）：28-33.

［4］ CHEN S W，MA X，WANG L S，et al.Acetone-butanol fermentation of rice straw enzymatic hydrolysate［J］.Industrial Microbiology，1998，28（4）：30-34.陳守文，馬昕，汪履綏，等.稻草酶法水解液的丙酮丁醇發(fā)酵［J］.工業(yè)微生物，1998，28（4）：30-34.

［5］ ZHANG Y，LIU P X，CHENG X S.The use and research progress of Enteromorphaprolifera［J］.Ocean Development and Manage-ment，2009，26（8）：97-100.張勇，劉鵬霞，程祥圣.滸苔的利用和研究進(jìn)展［J］.海洋開發(fā)與管理，2009，26（8）：97-100.

［6］ ZHANG W T，SHI X，OU J，et al.Effect of preparing alcohol with green tide algae biomass by acid hydrolysis［J］.Journal of Shanghai Ocean University，2011，20（1）：131-136.張維特，時旭，歐杰，等.酸法水解綠潮藻生物質(zhì)及發(fā)酵制乙醇的效果［J］.上海海洋大學(xué)學(xué)報，2011，20（1）：131-136.

［7］ KEIS S，SHAHEEN R，JONES D T.Emended descriptions of Clostridium acetobutylicum and Clostridium beijerinckii，and descriptions of Clostridium saccharoperbutylacetonicum sp.nov.and Clostridium saccharobutylicum sp.nov［J］.international Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2001，51（6）：2095-2103.

［8］ EZEJI T，QURESHI N，BLASCHEK H P.Butanol production from agricultural residues：Impact of degradation products on Clostridium beijerinckii growth and butanol fermentation［J］.Biotechnology and Bioengineering，2007，97（6）：1460-1469.

［9］ CHANG C，MA X J，LI H L，et al.Kinetic studu on sawdust decomposition under high temperatureand dilute acid conditions［J］.Actaenergiaesolaris sinica，2009，30（8）：1714-1716.常春，馬曉建，李洪亮，等.高溫稀酸條件下木屑降解動力研究［J］.太陽能學(xué)報，2009，30（8）：1714-1716.

［10］ YAO X Q，WANG N N.Resrerch of ethanol production from Jerusalem artichoke by dilute acid hydrolyzation［J］.Applied Chemiacal Industry，2011，40（3）：502-506.姚秀清，王娜娜.稀酸水解菊芋制乙醇技術(shù)研究［J］.化工應(yīng)用，2011，40（3）：502-506.

［11］ GUO W，ZHANG Z，WANG P.An investigation into sugar extracting from cassava stalk with acid pretreatment and enzyme hydrolyzsis［J］.Paper Science And Technology，2009，28（3）：24-27.郭薇，張曾，王萍.酸預(yù)處理—酶水解法從木薯稈中提取糖的研究［J］.造紙科學(xué)與技術(shù)，2009，28（3）：24-27.

［12］ LAI C H.The study on single cell protein feed from cassava starch residua［D］.Guangxi：Guangxi University，2006.賴翠華.木薯淀粉渣制取單細(xì)胞蛋白飼料的實(shí)驗(yàn)研究［D］.廣西：廣西大學(xué)，2006.

［13］ QIN S，F(xiàn)ENG D W，LIU H Y，et al.A kind of method Enteromorphaprolifera as raw material to prepare ethanol：China，200810157676［P］.2009-04-29.秦松，馮大偉，劉海燕，等.一種以滸苔為原料制取生物乙醇的方法：中國，200810157676［P］.2009-04-29.

［14］ LIU Z K.The research on transformed craft of biological ethanol of low value seaweed Enteromorphaprolifera［D］.Qingdao：Ocean University of China，2011.劉政坤.低值海藻滸苔生物 （Enteromorphraprolifera）乙醇轉(zhuǎn)化工藝的研究［D］.青島：中國海洋大學(xué)，2011.