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    BRCA1在同源重組修復(fù)中的作用

    2022-04-19 09:07:10趙音珺楊小杭
    生物學(xué)雜志 2022年2期
    關(guān)鍵詞:外顯子基因突變結(jié)構(gòu)域

    趙音珺, 楊小杭

    (浙江大學(xué) 醫(yī)學(xué)院, 杭州310000)

    乳腺癌是目前全球發(fā)病率最高的癌癥之一,且發(fā)病率逐年增高。眾多研究指出BRCA1基因的突變與卵巢癌和乳腺癌的發(fā)生密切相關(guān)。1990年Hall等學(xué)者通過對大量具有早發(fā)性乳腺癌病例的家庭進(jìn)行連鎖分析,首次定位了第一個候選的乳腺癌相關(guān)基因,并將其命名為乳腺癌相關(guān)基因1(Breast cancer 1, early onset)[1,3]。1994年BRCA1基因首次被克隆,與此同時BRCA1編碼序列的突變在患有多例乳腺癌的家庭中被鑒定出來[2-3]。

    乳腺癌和卵巢癌易感性基因檢測已經(jīng)整合到臨床腫瘤治療中,用于檢測BRCA1突變的技術(shù)有蛋白質(zhì)截斷檢測、DNA芯片技術(shù)、直接測序技術(shù)和MLPA等[4]。而BRCA1蛋白功能的研究主要在小鼠模型中進(jìn)行,眾多研究表明,BRCA1參與多項細(xì)胞活動。其中Brca1突變小鼠胚胎發(fā)育的研究揭示了BRCA1在HR修復(fù)途徑中的主要功能。通過總結(jié)相關(guān)小鼠胚胎發(fā)育的研究成果介紹HR修復(fù)途徑中的重要蛋白BRCA1的研究進(jìn)展。在未來的研究中,BRCA1相關(guān)的乳腺癌和卵巢癌的特定分子遺傳學(xué)分析及對BRCA1的相關(guān)功能了解可能會促進(jìn)新的靶向療法的發(fā)展。

    1 BRCA1基因

    1.1 人源BRCA1基因

    人源BRCA1基因是一個腫瘤抑制基因,BRCA1基因位于17號染色體長臂端12-21區(qū)域(17q12-21),約81 kb[3]。BRCA1編碼的mRNA長約7.8 kb,共有24個外顯子,其中共有22個外顯子能夠編碼氨基酸序列。第11號外顯子最長,約3.4 kb,編碼BRCA1中超過60%的氨基酸序列。而第1號和第4號外顯子不具備功能性[5]。多年來對BRCA1基因的研究增強了人類對相關(guān)遺傳性和散發(fā)性癌癥的認(rèn)識,也使得對應(yīng)的治療方案及預(yù)防措施有重大突破。

    1.2 BRCA1蛋白的結(jié)構(gòu)與功能

    以人源BRCA1蛋白為例,BRCA1在包括乳腺和卵巢在內(nèi)的許多組織中高度表達(dá),由1 863個氨基酸殘基組成,約220 ku。BRCA1蛋白的主要結(jié)構(gòu)[2]:(1)RING結(jié)構(gòu)域。其N端有一環(huán)狀鋅指結(jié)構(gòu)域,具有Cys3-His-Cys4結(jié)構(gòu),能與BARD1(BRCA1-associated RING domain)蛋白相互作用,形成異源二聚體,該異源二聚體具有E3泛素連接酶的功能[6]。(2)NLS核定位信號。BRCA1蛋白分別在氨基酸503KRKRRP508和606PKKNRLRRK615處包含兩個核定位信號,兩者皆由11號外顯子編碼,且都可以引導(dǎo)BRCA1進(jìn)入細(xì)胞核[7]。(3)CC結(jié)構(gòu)域。螺旋結(jié)構(gòu)域(coiled-coil domain)由1 364~1 437位氨基酸殘基組成。BRCA1的CC結(jié)構(gòu)域能識別PALB2的螺旋結(jié)構(gòu)域,與PALB2蛋白結(jié)合,進(jìn)一步形成BRCA1-PALB2-BRCA2復(fù)合體,這一復(fù)合體能夠促進(jìn)重組酶RAD51募集到單鏈DNA處[8-9]。(4)BRCT結(jié)構(gòu)域。BRCA1蛋白羧基端(BRCA1 C-terminal)區(qū)域有兩個相鄰的BRCT結(jié)構(gòu)域,單個BRCT結(jié)構(gòu)域含有約110個氨基酸殘基。BRCT結(jié)構(gòu)域具有轉(zhuǎn)錄激活的功能,該結(jié)構(gòu)域也能與許多蛋白質(zhì)結(jié)合,包括Abraxas、BRIP1(也稱為FANCJ)和CtIP等,這些蛋白與BRCA1相互作用共同參與DNA損傷修復(fù)[10]。

    圖1 BRCA1蛋白結(jié)構(gòu)示意圖(改自文獻(xiàn)[11])Figure 1 Schematic diagram of BRCA1 protein structure(adapted from reference[11])

    1.3 BRCA1同源蛋白

    多種哺乳動物中存在BRCA1同源蛋白,且蛋白序列高度保守。不同物種的BRCA1同源蛋白長度相近,都含有主要結(jié)構(gòu)域:RING結(jié)構(gòu)域、BRCT結(jié)構(gòu)域、與PALB相互作用的區(qū)域等。BRCA1同源蛋白參與多項細(xì)胞活動,本文主要論述其在HR途徑中的作用。BRCA1能夠募集至DSB位點,參與調(diào)控HR損傷修復(fù)。其RING結(jié)構(gòu)域與BARD1形成的異源二聚體能夠在HR修復(fù)DSB的過程中促進(jìn)DNA末端切割;BRCA1同源蛋白還能與PALB相互作用促進(jìn)重組酶RAD51的募集[12-13]。表1列舉了幾種具有代表性的哺乳動物的BRCA1同源蛋白,并進(jìn)行比較(數(shù)據(jù)來源:https://www.uniprot.org)。

    2 BRCA1蛋白在HR修復(fù)中的作用

    2.1 DSB損傷修復(fù)

    BRCA1蛋白參與DNA損傷修復(fù),在HR中發(fā)揮重要作用[14]。生物體內(nèi)多種因子會對DNA造成損傷,其中DNA雙鏈斷裂(double-strand breaks, DSB)是對細(xì)胞而言危害性最大的DNA損傷形式。隨著時間的推移,未修復(fù)的DSB在生物體內(nèi)發(fā)生累積,將會導(dǎo)致細(xì)胞衰老或細(xì)胞凋亡的發(fā)生,而DSB的錯誤加工則會損壞基因組的穩(wěn)定性并誘導(dǎo)癌癥的發(fā)生[15]。DSB形成原因眾多,外源性因素包括電離輻射、紫外線、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑和化學(xué)物質(zhì)等,內(nèi)源性因素包括復(fù)制壓力、V(D)J重排和程序性因素等[16-17]。DSB主要通過非同源末端連接(nonhomologous end-joining,NHEJ)和HR兩種途徑來修復(fù)[18-20]。NHEJ是一種不需要同源模板,直接將DNA末端連接在一起的快速修復(fù)方式,NHEJ途徑錯配率較高,易造成DNA損傷位點堿基序列的改變,從而導(dǎo)致遺傳信息的丟失。而HR途徑則需要同源序列作為修復(fù)模板,使得DNA斷裂處丟失的遺傳信息得以恢復(fù),是一種較為慢速但非常精確的DSB修復(fù)方式[21-22]。

    圖2 DSB損傷修復(fù)途徑的選擇Figure 2 The choice of DSB damage repair pathway

    2.2 HR修復(fù)途徑

    HR是一種在機(jī)制上非常保守且高保真的修復(fù)途徑,因此可以維持基因組完整性。在HR修復(fù)途徑中,BRCA1蛋白在多個步驟中發(fā)揮作用[23]。細(xì)胞中的DSB位點首先被MRN(MRE11-RAD50-NBS1)復(fù)合物識別,MRN復(fù)合物被募集到DNA末端,進(jìn)一步激活A(yù)TM(ataxia-telangiectasia mutated)蛋白激酶,ATM激酶通過與NBS1的C末端結(jié)合而被募集到DSB位點?;罨腁TM激酶能使DNA損傷修復(fù)所涉及的多種蛋白質(zhì)發(fā)生磷酸化,隨之放大損傷信號[24-25]。ATM可以在多個位點磷酸化BRCA1,被激活的BRCA1被募集至DSB位點,形成的BRCA1-BARD1復(fù)合物與53BP1發(fā)生拮抗,使DSB通過HR方式得以修復(fù)[26]。HR修復(fù)起始于DNA末端切除——5′DNA鏈從斷裂位點沿5′到3′方向發(fā)生降解,產(chǎn)生3′ssDNA單鏈[27]。DNA末端切除包含2個步驟:(1)由細(xì)胞中的MRN(MRE11-RAD50-NBS1)復(fù)合物和磷酸化的CtIP共同作用在5′端完成短程DNA末端切割,產(chǎn)生較短的3′ssDNA,BRCA1能夠有效促進(jìn)該步驟的進(jìn)行[28]。遠(yuǎn)程切除因子包括兩種核酸酶:dsDNA特異性核酸外切酶EXO1和ssDNA特異性的5′→3′核酸酶DNA2,EXO1可特異性降解dsDNA中5′末端的DNA鏈,與核酸酶DNA2共同作用,最終產(chǎn)生長度可達(dá)幾千個堿基的3′ssDNA突出端[27]。DNA末端切除產(chǎn)生的長距離ssDNA,迅速被復(fù)制蛋白A(replication protein A,RPA)包被,RPA是一種ssDNA結(jié)合蛋白,可以抑制3′ssDNA末端被降解,并且防止ssDNA自身退火形成二級結(jié)構(gòu)[29]。(2)3′ssDNA上的RPA會被重組酶RAD51取代,相較于RPA重組酶RAD51與DNA鏈的親和力更低,BRCA1會在重組酶RAD51取代RPA的過程中發(fā)揮作用。BRCA1可以與PALB2和BRCA2結(jié)合,從而介導(dǎo)與BRCA2結(jié)合的重組酶RAD51裝配至ssDNA,隨后重組酶RAD51將會取代ssDNA上的RPA產(chǎn)生RAD51-ssDNA結(jié)構(gòu)[30]。重組酶RAD51能夠促進(jìn)ssDNA向同源雙鏈DNA模板入侵,形成D-loop結(jié)構(gòu),重組酶RAD51在RAD54的幫助下發(fā)生解離[31-32]。

    HR有兩種主要亞通路,一是雙鏈斷裂修復(fù)(double strand breaks repair,DSBR):D-loop形成后,入侵鏈根據(jù)模板鏈完成復(fù)制后又會進(jìn)行第二次末端的捕獲,產(chǎn)生dHJ(double holiday junction)結(jié)構(gòu)。dHJ結(jié)構(gòu)在特異性核酸內(nèi)切酶作用下會產(chǎn)生交叉產(chǎn)物(crossover,CO)或非交叉產(chǎn)物(noncrossover,NCO)。此外dHJ結(jié)構(gòu)也可以在特異性解旋酶BLM和拓?fù)洚悩?gòu)酶TopoIIIα介導(dǎo)下發(fā)生溶解(dissolution),最終解旋產(chǎn)生非交叉產(chǎn)物[34]。在另外一種亞通路SDSA中,D-loop結(jié)構(gòu)中的入侵鏈完成修復(fù)后,在解旋酶RTEL1的作用下發(fā)生解離。隨后,該鏈重新退火至原始親本鏈DSB另一側(cè)的末端,從而形成互補鏈介導(dǎo)DSB修復(fù)。該途徑會發(fā)生基因轉(zhuǎn)換,最終產(chǎn)生非交叉產(chǎn)物[34]。

    2.3 BRCA1蛋白在HR修復(fù)中的功能

    DSB產(chǎn)生后BRCA1可以通過C端的BRCT結(jié)構(gòu)域與DNA鏈相互作用募集至DSB位點。在DSB位點處,BRCA1可以與MRN復(fù)合體及效應(yīng)蛋白CtIP相互作用,促進(jìn)CtIP的活性,促進(jìn)由MRN復(fù)合體/CtIP負(fù)責(zé)的DNA末端切除過程[35]。與此同時,BRCA1還可以與在DSB末端處的53BP1發(fā)生拮抗,將DNA保護(hù)蛋白移除,從而介導(dǎo)DSB損傷修復(fù)向HR方向進(jìn)行。研究表明在BRCA1缺失的情況下,53BP1可以在DSB損傷末端大量募集,從而阻止DNA末端被切除[36-37]。

    DNA末端被切除產(chǎn)生單鏈DNA后,BRCA1能直接與PALB2相互作用產(chǎn)生BRCA1-PALB2-BRCA2復(fù)合體,該復(fù)合體可以介導(dǎo)重組酶RAD51募集至DSB位點,促進(jìn)重組酶RAD51替換RPA,形成RAD51-ssDNA結(jié)構(gòu),有利于下一步DNA單鏈入侵。研究指出BRCA1和BARD1都能募集至DNA鏈并且與RAD51相互作用。BARD1與BRCA1相互作用形成的異源二聚體能夠有效促進(jìn)重組酶RAD51的募集,并介導(dǎo)RAD51-DNA鏈進(jìn)行同源DNA配對,并且還能增強RAD51的重組酶活性[38-39]。

    3 Brca1 基因突變小鼠

    3.1 Brca1基因突變小鼠的胚胎發(fā)育缺陷

    為進(jìn)一步了解BRCA1的功能,研究者通過基因敲入和敲除技術(shù)構(gòu)建許多Brca1突變基因小鼠模型。這些Brca1基因突變小鼠的生理特征研究能夠幫助理解BRCA1在HR修復(fù)途徑中的作用。到目前為止,已經(jīng)通過使用不同的基因操作技術(shù)在小鼠體內(nèi)構(gòu)建了超過20種Brca1突變基因(包括無效突變、條件突變和點突變等)[40]。眾多Brca1基因突變小鼠在胚胎期死亡,這表明BRCA1對胚胎發(fā)育而言具有重要意義。Brca1基因突變位點不同,則小鼠胚胎死亡時間不同。這表明Brca1不同基因位點對BRCA1蛋白功能具有不同的影響,由于突變基因表達(dá)的BRCA1蛋白大小各異,存在的功能域不同且其轉(zhuǎn)錄后修飾和翻譯后修飾也不同,因此這些Brca1突變基因表達(dá)的蛋白存在許多不同情況。在有些突變體中Brca1基因完全失效,無法表達(dá)BRCA1蛋白;而有些突變體中的BRCA1蛋白仍存在部分結(jié)構(gòu)域。這些研究提示BRCA1在HR修復(fù)途徑中還具有其他功能。

    3.2 Brca1基因突變胚胎致死的小鼠

    研究指出HR途徑相關(guān)蛋白缺失的小鼠會出現(xiàn)胚胎致死的情況,由此可知HR修復(fù)途徑在小鼠早期胚胎發(fā)育和細(xì)胞增殖過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[41]。Brca1Δ5-6是一種Brca1的無效等位基因。在這種等位基因中,Brca1第5和第6外顯子的序列被替換,突變使得編碼RING結(jié)構(gòu)域的序列被破壞,并產(chǎn)生了終止密碼子,因此該種Brca1突變基因無法表達(dá)BRCA1蛋白。Brca1Δ5-6/Δ5-6小鼠胚胎細(xì)胞中也被證實不存在BRCA1蛋白。Brca1Δ5-6/Δ5-6小鼠在胚胎發(fā)育至7.5 dpc之前死亡,突變小鼠的胚胎發(fā)育不良,其中胚層沒有形成的跡象[42]。Brca1Δ5-13是另一種Brca1的無效等位基因。將Brca1flox5-13/flox5-13小鼠與帶Cre酶小鼠交配可以獲得Brca1Δ5-13/Δ5-13突變小鼠。在這種Brca1突變基因中,第5至13外顯子的序列被刪除,所有BRCA1的功能域都遭到破壞,Brca1Δ5-13/Δ5-13小鼠也在胚胎期死亡[10,43]。Brca1ex2基因中原有的第2號外顯子被替換。第2號外顯子編碼N端RING結(jié)構(gòu)域,也包含啟動子,因此該片段突變將會導(dǎo)致Brca1失效。Brca1ex2/ex2小鼠死于胚胎期6.5~9.5 dpc,遲于Brca1Δ5-6/Δ5-6小鼠胚胎死亡日期。然而Brca1還存在另外一個啟動子,當(dāng)其被激活后能夠表達(dá)出不包含RING結(jié)構(gòu)的BRCA1蛋白,因此該基因型小鼠胚胎死亡的日期略有推遲[44]。Brca11700T基因通過將neogene插入第20號外顯子獲得,在Brca11700T/1700T小鼠細(xì)胞中,所表達(dá)的BRCA1蛋白不存在C端BRCT結(jié)構(gòu)域。BRCT結(jié)構(gòu)域具有使BRCA1與DSB末端結(jié)合的功能,由于影響了HR途徑,Brca11700T/1700T小鼠胚胎死于9.5~10.5 dpc[45]。

    3.3 Brca1基因突變小鼠胚胎致死的挽救

    眾多Brca1基因突變小鼠的研究結(jié)果表明,在早期胚胎發(fā)育過程中BRCA1有非常重要的作用。在后續(xù)的研究中發(fā)現(xiàn)p53信號失活,或者53bp 1的缺失可以在不同程度上挽救Brca1基因突變小鼠胚胎致死的情況。這些結(jié)果為BRCA1在胚胎早期發(fā)育中的機(jī)制研究提供了證據(jù)。

    3.3.1 p53信號失活的拯救

    為研究Brca1Δ5-6/Δ5-6基因型小鼠胚胎致死是否由p53的信號激活導(dǎo)致,研究者構(gòu)建了Brca1Δ5-6/Δ5-6;p53-/-小鼠模型。研究結(jié)果顯示,由于部分挽救了發(fā)育延遲和細(xì)胞增殖的缺陷,Brca1-p53DKO小鼠胚胎的壽命較Brca1Δ5-6/Δ5-6基因型小鼠可以延長1~2 d[46]。此外p53基因缺失、Chk2基因缺失、Atm基因缺失都可以挽救Brca1Δ11/Δ11早期胚胎致死的情況[47-48]。DSB在細(xì)胞內(nèi)大量產(chǎn)生后,p53被ATM激酶磷酸化激活,CHK2也會被ATM激酶激活,在ATM-CHK2通路的介導(dǎo)下,細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞檢查點,細(xì)胞活動阻滯在特定時期。細(xì)胞內(nèi)積聚大量未修復(fù)的DSB,細(xì)胞會啟動凋亡程序,最終導(dǎo)致早期胚胎死亡[49]。如果在Brca1基因缺陷的小鼠中引入p53的缺失,ATM-Chk2-p53信號就無法被激活,因此胚胎發(fā)育阻滯可以在不同程度上有所挽救。由此可知,相關(guān)Brca1基因缺陷的小鼠胚胎致死是由p53信號激活導(dǎo)致的。

    3.3.2 53BP1缺失的拯救

    p53結(jié)合蛋白1(p53 binding protein 1,53BP1)是p53基因的轉(zhuǎn)錄激活物,53bp1缺失也可以挽救Brca1Δ11/Δ11小鼠早期胚胎死亡的情況[50]。然而與p53基因缺失模型不同的是,在Brca1Δ11/Δ11、Trp53bp1-/-小鼠的細(xì)胞中,ATM-Chk2-p53信號是完整的。實驗證明53BP1缺失通過恢復(fù)HR修復(fù)途徑來挽救Brca1Δ11/Δ11小鼠早期胚胎死亡的情況。53BP1 KO也是通過恢復(fù)HR修復(fù)途徑來挽救Brca1ex2/ex2小鼠早期胚胎死亡的情況[50]。這些實驗證明BRCA1能夠調(diào)控DSB修復(fù)途徑的選擇,使DSB選擇通過HR修復(fù)途徑進(jìn)行修復(fù)[51]。BRCA1還可以與在DSB末端處的53BP1發(fā)生拮抗,將DNA保護(hù)蛋白移除,介導(dǎo)DSB通過HR途徑進(jìn)行修復(fù)。在Brca1基因突變小鼠中,53BP1固定在DSB末端,DNA末端切除無法進(jìn)行[52]。如果引入53BP1 KO,突變體細(xì)胞內(nèi)DNA末端切除便能發(fā)生,HR修復(fù)途徑在沒有完整BRCA1蛋白的情況下被恢復(fù),相關(guān)Brca1基因突變小鼠因此被拯救。53BP1的缺失還可以挽救Brca1ΔC/ΔC、Brca1Δ5-13/Δ5-13早期胚胎致死的情況,但與上述挽救方式有所不同。在Brca1ΔC/ΔC基因突變小鼠細(xì)胞中,由于HR修復(fù)途徑中的重要蛋白如RAD51、PALB2等無法募集到DNA切除末端,因此53BP1缺失無法修復(fù)由BRCA1介導(dǎo)的HR修復(fù)途徑。與此同時,研究表明53BP1缺失也不是通過恢復(fù)HR修復(fù)途徑來挽救Brca1Δ5-13/Δ5-13小鼠。但是在Brca1ΔC/ΔC、Trp53bp1-/-和Brca1Δ5-13/Δ5-13、Trp53bp1-/-基因型小鼠中,還存在小部分非BRCA1介導(dǎo)的HR修復(fù)途徑[53-54]。其中在Brca1Δ5-13/Δ5-13、Trp53bp1-/-小鼠的細(xì)胞中,53BP1缺失還使得DSB通過NHEJ的方式得以修復(fù),從而挽救該種Brca1基因缺陷小鼠胚胎致死的情況[53]。

    4 總結(jié)

    BRCA1蛋白參與DNA損傷修復(fù),在HR修復(fù)途徑中發(fā)揮重要作用。在HR修復(fù)途徑中BRCA1具有兩個主要功能:一是促進(jìn)DNA末端切除,二是介導(dǎo)重組酶RAD51在DSB位點處的裝載。為了進(jìn)一步研究BRCA1的功能,研究者構(gòu)建了諸多Brca1基因突變小鼠模型。在Brca1基因突變小鼠模型中,通常存在早期胚胎致死的現(xiàn)象。相關(guān)研究可以驗證BRCA1在HR修復(fù)途徑中有重要意義的結(jié)論。此外一些相關(guān)基因的敲除可以在不同程度上挽救Brca1基因突變小鼠胚胎致死的情況。這表明BRCA1還具有另外一項功能:與53BP1發(fā)生拮抗,調(diào)控DSB修復(fù)途徑的選擇。這些成果提示在以后的研究中,可以通過構(gòu)建不同的Brca1基因突變小鼠模型,探索BRCA1在HR修復(fù)途徑中還未解決的問題。

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