腺嘌呤誘導(dǎo)慢性腎病大鼠模型中HIF-1α、RhoA、SOX9 的表達(dá)及意義

毛海霞康 婷吳蔚樺朱婷婷張麗玲歐三桃*

(1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院腎病內(nèi)科,四川 瀘州 646000;2.四川省腎臟疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心,四川 瀘州 646000)

慢性腎病(chronic kidney disease,CKD)是一種以腎功能丟失逐漸加重為特征的進(jìn)展性疾病[1],已成為全球的重大公共健康問題,是導(dǎo)致世界人口死亡的主要疾病[2]。 CKD 發(fā)病機(jī)制復(fù)雜多樣,其中腎小管間質(zhì)纖維化(tubulointerstitial fibrosis,TIF)是其最常見的病理特征和CKD 進(jìn)展的共同途徑[3]。 影響腎間質(zhì)纖維化的因素眾多,涉及多種信號(hào)因子和信號(hào)通路調(diào)控系統(tǒng)。 上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelialmesenchymal transition,EMT)可通過改變分泌的細(xì)胞外基質(zhì)促進(jìn)TIF 的發(fā)展,其中,缺氧參與并促進(jìn)了該 過 程 的 發(fā) 生、 發(fā) 展[4-5]。 缺 氧 誘 導(dǎo) 因 子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)作為缺氧敏感的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,被證實(shí)與腎纖維化有關(guān)[6-7]。 近年來,RhoA/ROCK 信號(hào)通路被證實(shí)在促進(jìn)腎纖維化方面起到積極作用[8],而SOX9 作為下游因子發(fā)揮作用,HIF-1α 同時(shí)也是RhoA 轉(zhuǎn)錄的重要調(diào)節(jié)因子[9]。 缺氧可通過HIF-1α 激活RhoA/ROCK 信號(hào)通路來誘導(dǎo)細(xì)胞骨架損傷和重塑,KEGG 信號(hào)通路顯示SOX9 參與HIF-1α 信號(hào)通路[10],但HIF-1α 是否可通過RhoA、SOX9 發(fā)揮促進(jìn)腎間質(zhì)纖維化的作用,目前尚無相關(guān)報(bào)道。 因此,本研究主要觀察HIF-1α、RhoA 和SOX9 在腺嘌呤誘發(fā)大鼠CKD 模型中的表達(dá)以及與CKD 腎間質(zhì)纖維化的關(guān)系,以進(jìn)一步探討CKD 腎間質(zhì)纖維化的發(fā)病機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)5～6 周齡雄性SD 大鼠20 只,體重180～240 g,購自西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK(川)2018-0017]。 飼養(yǎng)于西南醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物研究中心[SYXK(川)2018-0065]。 該實(shí)驗(yàn)經(jīng)西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批( IACUCSWMU20210350),并遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的3R 原則。

1.2 主要試劑與儀器

腺嘌呤(V900471-100G,Sigma 公司,美國(guó));HIF-1α 抗 體、 SOX9 抗 體( ab8366, ab185230,Abcam,英國(guó));RhoA 抗體(10749-1-AP,武漢三鷹公司);Col-I 抗體(BS1530,bioworld 公司,美國(guó));α-SMA 抗體(19245S,CST 公司,美國(guó));SABC 試劑盒(bioworld 公司,美國(guó));RNA 提取試劑盒、RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR 試劑盒(R701、R323-01、Q711-02/03,南京維諾贊公司);HIF-1α、RhoA、SOX9、Col-I、α-SMA 和GAPDH 上下游引物(上海生工生物工程有限公司); SOX9 ELISA 試劑盒(30899,泉州睿信生物科技有限公司)。 全自動(dòng)生化分析儀(西門子,德國(guó));光學(xué)顯微鏡(Nikon 公司,日本);RNA 逆轉(zhuǎn)錄儀(Eppendorf 公司,德國(guó));RTPCR 儀(Eppendorf 公 司, 德 國(guó)); 自 動(dòng) 酶 標(biāo) 儀(BioTek 公司,美國(guó))。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

將20 只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(n=10)和CKD組(n=10)。 所有大鼠自由進(jìn)食普通飼料、飲水,晝夜節(jié)律光照,室溫喂養(yǎng),適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后,開始實(shí)驗(yàn)。 CKD 組給予250 mg/(kg·d)的2.5%腺嘌呤混懸液每天灌胃,1～3 周每天灌胃1 次,4～6 周每天減半灌胃1 次;對(duì)照組給予等量生理鹽水灌胃。

1.3.2 留取血、尿、腎組織標(biāo)本

造模后第3、6 周時(shí),分別處死兩組大鼠各5 只;處死前24 h 將大鼠置于清潔的代謝籠中,收集24 h尿液測(cè)定24 h 尿蛋白,行10%戊巴比妥麻醉后經(jīng)腹主動(dòng)脈采血,離心后取血清分裝并保存于-80℃冰箱待用,部分血清用于行腎功能檢測(cè),部分用于ELISA 檢測(cè);處死后取右腎稱重及行剖面觀察,左腎部分腎組織于10%中性福爾馬林中浸泡固定,制作石蠟切片(4 μm),用作形態(tài)學(xué)觀察,部分腎組織凍存于-80℃冰箱中備用。

1.3.3 腎組織形態(tài)學(xué)觀察

HE 染色:取大鼠腎組織石蠟切片,二甲苯脫蠟至水后行蘇木素液、伊紅復(fù)染,透明,中性樹膠封片。 于光鏡下觀察腎組織病理改變。

天狼星紅染色:切片脫蠟至水,蘇木素液染3～5 min,水洗后天狼星紅染液染15 ～30 min,無水乙醇直接分色與脫水,二甲苯透明,風(fēng)干后中性樹膠封片,鏡檢。

1.3.4 免疫組化染色檢測(cè)腎組織中HIF-1α、RhoA、SOX9、Col-I 和α-SMA 蛋白的表達(dá)

腎組織切片60℃脫蠟水化,熱抗原修復(fù),免疫組化筆畫圈圍住組織,滅活內(nèi)源酶活性,封閉非特性位點(diǎn),依次添加一抗、二抗、ABC 復(fù)合物、DAB 顯色液,蘇木素復(fù)染,脫水晾干后中性樹膠封片,顯微鏡下觀察。

③實(shí)現(xiàn)智慧交通系統(tǒng)公共數(shù)據(jù)的共享服務(wù)，為政務(wù)內(nèi)網(wǎng)、政務(wù)外網(wǎng)以及互聯(lián)網(wǎng)上的各類交通類相關(guān)的智慧應(yīng)用提供基于城市智慧交通公共數(shù)據(jù)庫的交通數(shù)據(jù)服務(wù)、時(shí)空信息承載服務(wù)、基于數(shù)據(jù)挖掘的決策知識(shí)服務(wù)等。

1.3.5 RT-PCR 檢測(cè)大鼠腎HIF-1α、RhoA 和SOX9和Col-I、α-SMA mRNA

取凍存腎組織,按說明書提取總RNA,再將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。 設(shè)計(jì)HIF-1α、RhoA、SOX9、Col-I 和α-SMA 引物序列,見表1 參照試劑盒行體外PCR 擴(kuò)增,記錄PCR 反應(yīng)的循環(huán)閾值(CT 值),以2-△△CT表示目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 熒光定量PCR 引物序列表Table 1 Sequence table of primers for RT-PCR

1.3.6 ELISA 檢測(cè)血清SOX9 水平

取大鼠血清,按照ELISA 試劑盒操作步驟,并用酶標(biāo)儀在450 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(OD 值),通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中SOX9 含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,計(jì)量資料采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)表示,兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析,兩變量間的相關(guān)性分析用Pearson檢驗(yàn),以P＜0.05為有差異,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腎整體和切面大體病理改變及腎重、腎重/體重比較

對(duì)照組大鼠腎大小形態(tài)正常,呈暗紅色,觸之有彈性,切面皮髓質(zhì)界限分明;CKD 組大鼠腎呈“大白腎”,體積變大,色灰白,質(zhì)韌,觸之有顆粒感,且切面皮髓質(zhì)稍模糊。 CKD 組腎重、腎重/體重均比對(duì)照組增加,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。 見表2、圖1。

圖1 兩組大鼠腎大體病理改變Figure 1 Pathologic change between two groups of rats

表2 兩組大鼠腎重、腎重/體重比較(n=5)Table 2 Comparison of kidney weight and kidney weight/body weight between two groups of rats

2.2 兩組大鼠腎功能及24 h 尿蛋白定量比較

CKD 組大鼠腎功能指標(biāo)(BUN、Scr)和24 h 尿蛋白定量在3、6 周較對(duì)照組均明顯升高,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。 見表3。

表3 兩組大鼠腎功及24 h 尿蛋白定量比較(n=5)Table 3 Comparison of renal function and 24 h urinary protein quantity between two groups of rats

2.3 腎組織病理改變

HE 染色可見對(duì)照組第3、6 周大鼠腎組織結(jié)構(gòu)清晰,無明顯異常。 CKD 組大鼠腎組織隨時(shí)間進(jìn)展結(jié)構(gòu)變得紊亂,腎小球數(shù)量逐漸減少,囊腔擴(kuò)張明顯,腎小管擴(kuò)張伴棕黃色顆粒沉積。 天狼星紅染色見對(duì)照組大鼠腎間質(zhì)無明顯膠原沉積,而CKD 組大鼠腎間質(zhì)明顯紅染,膠原纖維較為豐富,且隨時(shí)間進(jìn)展其程度加重。 見圖2。

注:A:HE 染色結(jié)果,B:天狼星紅染色結(jié)果。

2.4 腎組織HIF-1α、RhoA、SOX9、Col-I 和α-SMA 免疫組化

免疫組化結(jié)合Image Pro Plus 分析結(jié)果顯示,對(duì)照組大鼠可見腎小管HIF-1α、RhoA、SOX9 表達(dá)較少,且主要集中在靠近腎小球的周圍。 CKD 組大鼠腎小管及間質(zhì)可見較多棕黃色顆粒沉積,提示HIF-1α、RhoA、SOX9 的表達(dá)較多,且隨時(shí)間進(jìn)展其表達(dá)逐漸增強(qiáng),腎小球上也有不均勻表達(dá)。 Col-I 和α-SMA 蛋白在對(duì)照組腎間質(zhì)表達(dá)較少,而在CKD組腎間質(zhì)顯著表達(dá),且隨時(shí)間進(jìn)展其表達(dá)程度加重。 見圖3。

注:與同期對(duì)照組相比,*P＜0.05,**P＜0.01;與前一時(shí)間CKD 組相比,##P＜0.01。

2.5 腎組織HIF-1α、RhoA 和SOX9 和Col-I、α-SMA mRNA 表達(dá)情況

與對(duì)照組相比,CKD 組大鼠腎HIF-1α、和SOX9 mRNA 水平隨時(shí)間進(jìn)展均明顯增加,且HIF-1α 和SOX9 mRNA 在各時(shí)間點(diǎn)的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,RhoA 在第6 周時(shí)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;CKD 組大鼠各時(shí)間點(diǎn)腎Col-I、α-SMA mRNA 均較對(duì)照組升高,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 見圖4。

注:與同期對(duì)照組相比,*P＜0.05,**P＜0.01;與前一時(shí)間CKD 組相比,##P＜0.01。

2.6 相關(guān)性分析

采用Pearson對(duì)各指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析,結(jié)果提示HIF-1α、RhoA 和SOX9 mRNA 表達(dá)與Col-I mRNA表達(dá)呈顯著正相關(guān)(r=0.993,P＜0.000;r=0.864,P＜0.000;r=0.957,P＜0.000);HIF-1α、RhoA 和SOX9 mRNA 表達(dá)與α-SMA mRNA 也呈明顯正相關(guān)(r=0.820,P=0.001;r=0.758,P=0.004;r=0.779,P=0.003)。 隨后,進(jìn)一步分析HIF-1α、RhoA 和SOX9 之間的相關(guān)性,發(fā)現(xiàn)其兩兩間均存在顯著正相關(guān)(HIF-1α 與RhoA mRNAr= 0.871,P＜0.000;HIF-1α 與SOX9 mRNAr= 0.944,P＜0.000;RhoA 和SOX9 mRNAr=0.715,P=0.009)。 見圖5。

圖5 mRNA 相關(guān)性分析Figure 5 Correlation analysis of the mRNA

2.7 大鼠血清SOX9 的水平

3 周大鼠對(duì)照組血清中SOX9 水平為(13.63±1.595) ng/mL,CKD 組為(16.16±1.390) ng/mL;6 周大鼠對(duì)照組血清中SOX9 水平為(12.63±1.540) ng/mL,CKD 組為(18.27±1.334) ng/mL。 CKD 組大鼠血清中SOX9 水平較同期對(duì)照組均升高,且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);血清SOX9 水平隨造模時(shí)間延長(zhǎng)而增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.8 血清SOX9 水平與腎功能、24 h 尿蛋白的相關(guān)性分析

用Pearson檢驗(yàn)得出:血清中SOX9 水平與尿素氮、肌酐、24 h 尿蛋白定量均存在正相關(guān)關(guān)系(r1=0.759,P=0.000;r2=0.757,P=0.000;r3=0.822,P=0.000)。 見圖6。

圖6 血清SOX9 水平與腎功、24 h 尿蛋白定量的相關(guān)性分析Figure 6 Correlation analysis of SOX9 with renal function and 24 h urinary protein quantity

3 討論

CKD 最常見的病理表現(xiàn)是腎纖維化,主要包括腎小球硬化、腎小管萎縮和腎間質(zhì)纖維化。 而腎間質(zhì)纖維化作為發(fā)展為終末期腎病的主要病變之一,涉及信號(hào)通路繁多,目前研究較多的有TGF-β/Smad3、JAK/STAT 和PI-3K 通路等[11],但并不能完全解釋其進(jìn)展過程。 近年來研究發(fā)現(xiàn),在慢性腎病組織中普遍存在缺氧狀態(tài),而缺氧主要可通過缺氧誘導(dǎo)因子(HIF-1)途徑來促進(jìn)腎間質(zhì)纖維化從而參與慢性腎病的進(jìn)展。 既往研究表明RhoA 和SOX9均與HIF-1 相關(guān),且都不同程度參與腎間質(zhì)纖維化過程,因此本研究通過檢測(cè)HIF-1、RhoA 和SOX9 表達(dá)及相關(guān)腎纖維化指標(biāo),探討HIF-1、RhoA 和SOX9是否參與了CKD 的腎間質(zhì)纖維化過程。

腺嘌呤灌胃誘導(dǎo)CKD 主要是通過促進(jìn)腎小管間質(zhì)纖維化、腎小管萎縮和晶體形成,能較好的模擬人類的正常CKD 的發(fā)展,故成為廣泛采用的誘導(dǎo)CKD 的造模方式[12-13]。 本實(shí)驗(yàn)采用腺嘌呤灌胃,可見模型組大鼠腎呈“大白腎”改變,腎功能下降且24 h 尿蛋白定量升高,且HE 染色發(fā)現(xiàn)腎結(jié)構(gòu)紊亂伴腎小管明顯擴(kuò)張,天狼星紅染色發(fā)現(xiàn)CKD 組膠原纖維沉積且其纖維化程度隨時(shí)間進(jìn)展加重,證實(shí)腺嘌呤誘導(dǎo)CKD 大鼠模型成功。

HIF-1α 是缺氧誘導(dǎo)因子家族中的一員,普遍存在于人和哺乳動(dòng)物的細(xì)胞內(nèi),可以激活下游100 多種與缺氧相關(guān)的因子轉(zhuǎn)錄表達(dá),主要通過調(diào)控細(xì)胞增殖、自噬,炎癥,氧化應(yīng)激等介導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生缺氧應(yīng)答,近年來發(fā)現(xiàn)其與慢性病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[14]。 CKD 時(shí),HIF-1α 可通過激活NF-β、EPO、GLUT-1、IGF-1 和INOS 發(fā)生等促進(jìn)腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化,進(jìn)而促進(jìn)腎間質(zhì)纖維化,同時(shí)還可促進(jìn)血管生成[15]。 本研究發(fā)現(xiàn)在腺嘌呤誘發(fā)的CKD 大鼠腎小管上皮細(xì)胞胞核中存在HIF-1α 的高表達(dá),其mRNA 水平同等高表達(dá),且其表達(dá)與腎纖維化因子Col-I、α-SMA mRNA 呈顯著正相關(guān),提示HIF-1α 可能參與并促進(jìn)了CKD 的腎間質(zhì)纖維化過程,與既往類似研究結(jié)果一致。 其次,HIF-1α 與RhoA 和SOX9 mRNA 的表達(dá)也高度相關(guān),且RhoA 和SOX9 在腎小管上皮細(xì)胞核中均明顯高表達(dá)。 既往研究發(fā)現(xiàn)在乳腺癌中HIF-1α 可激活RhoA/RhoA 軸,導(dǎo)致細(xì)胞和基質(zhì)收縮[16]。 在腫瘤、肺動(dòng)脈高壓等多種疾病中都證實(shí)了HIF-1α/RhoA軸的存在,但與CKD 的相關(guān)研究較少,本研究發(fā)現(xiàn)在CKD 間質(zhì)纖維化中,HIF-1α 與RhoA 存在相關(guān)關(guān)系,但還需進(jìn)一步研究證實(shí)。

RhoA 作為研究最透徹的RhoA-GTP 酶的家族成員,在調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架蛋白,細(xì)胞形態(tài)和遷移、調(diào)控細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)錄等方面發(fā)揮了巨大的作用,因此,是目前研究的熱點(diǎn)之一。 晚近發(fā)現(xiàn)其轉(zhuǎn)錄主要受c-Myc、HIF-1α/2α、Stat 6 和NF-κB 等調(diào)控,下游可激活MAL、AP-1、NF-κB、YAP/TAZ、β-catenin 和SOX9 等發(fā)揮生物活性作用[9]。 多項(xiàng)研究也表明,RhoA 通過不同通路參與并促進(jìn)了腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)程[8,17-18]。 本研究也發(fā)現(xiàn)RhoA 在CKD 組大鼠腎小管上皮細(xì)胞核中高表達(dá),且其mRNA 水平與Col-I和α-SMA mRNA 表達(dá)呈正相關(guān),進(jìn)一步證明了RhoA 可能促進(jìn)腎間質(zhì)纖維化從而參與CKD 的進(jìn)展。 RhoA 與SOX9 mRNA 表達(dá)呈明顯正相關(guān)關(guān)系,表明RhoA 可能通過激活SOX9 在腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)程中發(fā)揮作用。

SOX9(sex-determining region Y box9)參與早期胚胎的多種器官的發(fā)育成熟,也與腫瘤的發(fā)生有關(guān)。 近年來發(fā)現(xiàn)其可介導(dǎo)上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)分化和通過促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生參與器官纖維化。 然而,SOX9 在腎間質(zhì)纖維化中的研究相對(duì)較少,目前有研究表明SOX9 可通過PI3K-AKT 途徑促進(jìn)腎小管間質(zhì)轉(zhuǎn)分化和細(xì)胞外基質(zhì)沉積[19]。 同時(shí),大量研究表明在急性腎損傷后SOX9 表達(dá)增強(qiáng),可促進(jìn)腎內(nèi)源性的修復(fù),從而延緩腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生[20-21]。 因此SOX9 可能在早期腎損傷中起保護(hù)作用,在晚期腎損傷中起促進(jìn)作用,但在腎間質(zhì)纖維化中的具體作用還需要更深入的研究來證明。本研究發(fā)現(xiàn)隨CKD 進(jìn)展,SOX9 在腎小管上皮細(xì)胞中高表達(dá),在6 周達(dá)高峰,且其mRNA 水平與Col-I、α-SMA mRNA 呈顯著正相關(guān),表明在CKD 模型中存在SOX9 的表達(dá)增強(qiáng),且其表達(dá)可能參與并促進(jìn)了腎間質(zhì)纖維化過程,進(jìn)一步證實(shí)了關(guān)于SOX9 在腎間質(zhì)纖維化的作用[22]。 此外,本研究同時(shí)還發(fā)現(xiàn)血清SOX9 水平在CKD 大鼠中明顯升高,與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,且CKD 組6 周較3 周表達(dá)進(jìn)一步升高,表明其血清水平隨CKD 進(jìn)展而上升。Nakagawa 等[23]提出SOX9 可作為提示腎小管損傷和間質(zhì)纖維化的新型標(biāo)志物,但目前尚無在血清學(xué)方面的報(bào)道,而本研究結(jié)果提示血清SOX9 水平可能在一定程度上診斷CKD 以及提示CKD 病程的進(jìn)展。

綜上,本研究發(fā)現(xiàn)在腺嘌呤誘導(dǎo)的CKD 大鼠模型中,存在HIF-1α、RhoA 和SOX9 的激活,且其表達(dá)增加可能與腎間質(zhì)纖維化有關(guān),今后還應(yīng)進(jìn)一步研究驗(yàn)證該通路并證明抑制其激活有助于抑制腎間質(zhì)纖維化的發(fā)展,進(jìn)而減緩CKD 進(jìn)程。 此外血清SOX9 水平有望成為早期診斷CKD 以及提示其病情進(jìn)展的新型標(biāo)志物。