復方天麻蜜環(huán)糖肽片對原發(fā)高血壓大鼠T 淋巴細胞亞群、早期腎損傷及AT1R/Smad3 蛋白作用機制研究

馮 靜張賢春

(?？谑腥嗣襻t(yī)院,?？?570208)

原發(fā)性高血壓(spontaneous hypertension,EH)具有高致殘率、高死亡率,嚴重者會導致心血管疾病的發(fā)生[1]。 原發(fā)性高血壓在臨床上主要表現為體循環(huán)動脈壓的增高,同時伴有器官功能或器質性損害,嚴重的高血壓患者導致腦卒中等疾病的發(fā)生[2]。 目前,高血壓患者隨著社會生活節(jié)奏的加快而逐年增加,有數據統(tǒng)計發(fā)現,我國目前為止高血壓患者的患病率高達25%。 原發(fā)性高血壓的發(fā)病機制相對復雜,目前尚沒有文獻明確的報道。 近些年研究顯示,血管的炎性反應和內皮損傷介導著高血壓疾病的發(fā)生、發(fā)展[3]。 還有學者研究發(fā)現,在高血壓患者的血管壁內有大量的炎癥反應,并且在高血壓的發(fā)生中這種炎癥反應起主導作用[4]。 目前我國主要通過研究CD4+T 淋巴細胞亞群來反應原發(fā)性高血壓的炎癥免疫反應,雖有很多的文獻報道,但CD4+T 淋巴細胞亞群在高血壓疾病中的作用機制還不是十分清楚。 血管緊張素Ⅱ會和它的受體之一zAng Ⅱ1 型受體(angiotensin Ⅱ type 1 receptor,AT1R)相結合,進而讓血管發(fā)生收縮,釋放大量的醛固酮,增加細胞增生,這些不良效應主要由AT1R 所介導[5]。 有文獻報道顯示,在高血壓患者的血清中發(fā)現了AT1R 抗體,因此推測機體的免疫功能介導高血壓疾病的發(fā)生[6]。 Smad(small mother against decapentapiegic)蛋白是轉化生長因子(TGF)信號通路中重要的細胞內作用底物,其中Smad3 是其中的一種亞型[7]。 現有研究顯示,TGF/Smad 信號通路在心血管疾病中的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要的作用,Smad 蛋白從基因轉錄水平參與調控心血管疾病的發(fā)生發(fā)展過程[8],但AT1R、Smad3在高血壓中的表達還尚不清楚。 復方天麻蜜環(huán)糖肽片是一種生物重要復方制劑,主要提取于天麻蜜環(huán)菌、黃芪和當歸中,可以有效防止眩暈,且對舒筋活血有一定的效果,復方天麻蜜環(huán)糖肽片不僅服用方便,不良反應也相對較小[9-10]。 目前,還沒有復方天麻蜜環(huán)糖肽片對高血壓作用的相關報道,本文旨在探究復方天麻蜜環(huán)糖肽片對原發(fā)性高血壓大鼠T 淋巴細胞亞群、早期腎損傷及AT1R、Smad3 蛋白表達的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

大鼠購自浙江中醫(yī)藥大學動物實驗中心[SCXK(浙)2017-0015],所有大鼠飼養(yǎng)在海南醫(yī)學院[SYXK(瓊)2019-0008]。 40 只SHR 大鼠,20 只Wistar-Kyoto(WKY)大鼠,所有大鼠皆為SPF 級、雄性,8 周齡,體重180 ～200 g。 所有大鼠均飼養(yǎng)在統(tǒng)一的動物房內,保證環(huán)境清潔,且室內溫度保持在23℃～25℃,相對濕度保持在45%～50%,動物實驗過程經?？谑腥嗣襻t(yī)院動物實驗倫理委員會批準(20120LL077),本次實驗符合3R 原則。

1.2 主要試劑與儀器

山西康欣藥業(yè)有限公司生產的復方天麻蜜環(huán)糖肽片(批準文號: H14022944); 美國 Assay Biotechnology 公司生產的AT1R 抗體和Smad3 抗體;美國BD 公司生產的CD3+、CD4+、CD8+檢測試劑盒。 上海奧爾科技生物科技有限公司生產的大鼠無創(chuàng)血壓測量分析系統(tǒng);日本奧林巴斯株式會社生產的BH2 型光學顯微鏡。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組與造模

20 只WKY 大鼠作為正常組(NC 組)、40 只SHR 大鼠分為模型組(SHR 組)和藥物組(TMGT組),每組20 只。 將1 g 復方天麻蜜環(huán)糖肽片用生理鹽水稀釋成3 mL 復方天麻蜜環(huán)糖肽溶液,TMGT組大鼠給予1 g/kg 天麻蜜環(huán)糖肽溶液灌胃干預,每天3 次,連續(xù)干預8 周;NC 組大鼠和SHR 組大鼠均給予等量的生理鹽水灌胃干預,每天3 次,連續(xù)干預8 周。

1.3.2 動物血壓測量

在給藥干預后0、2、4 和8 周時,分別測量NC組、SHR 組和TMGT 組大鼠的尾動脈收縮壓。 在測量時先把無創(chuàng)血壓檢測儀進行預熱,在大鼠的根部套上血壓計的充氣尾,在大鼠處于安靜狀態(tài)時,對大鼠的血壓進行測量,每組大鼠分別測量3 次,取平均值。

1.3.3 流式細胞儀檢測外周血T 淋巴細胞亞群

分別麻醉NC 組、SHR 組和TMGT 組大鼠,采集大鼠腹主動脈血液3 mL,離心處理后,棄掉上清液,將PBS 溶液加入其中進行稀釋,充分混勻后,在淋巴細胞分離液上鋪滿液體,離心后把中間的白層膜部分取出,再次離心后,把上清液棄掉,重懸細胞制備成淋巴細胞懸液。 將懸液放置在測定管中,分別設為空白管和對照管,在管中加入CD3+、CD4+、CD8+熒光抗體,輕搖測定管混勻,在室溫環(huán)境中孵育,20 min 后再次用PBS 溶液重懸,最后對T 淋巴細胞亞群進行檢測。

1.3.4 ELISA 檢測血清中IL-6、TNF-α 的含量

分別取NC 組、SHR 組和TMGT 組大鼠的腹主動脈血,2000 r/min 的速度離心5 min,取出離心后的上清液,分別測量各組大鼠血清中IL-6、TNF-α 的含量。

1.3.5 腎組織病理學觀察

采用HE 染色和PAS 染色切片法,處死3 組大鼠后取出腎組織,將制備好的切片組織放置在圖像分析儀上,分別觀察NC 組、SHR 組和TMGT 組大鼠腎組織的病理變化。

1.3.6 Western blot 檢測腎組織中AT1R、Smad3 蛋白表達

分別取NC 組、SHR 組和TMGT 組大鼠50 mg腎組織,用Western blot 裂解液裂解后用玻璃均漿器在冰上對組織進行研磨,30 min 后以12000 r/min的速度離心5 min,取上清液,蛋白濃度用BCA 法進行檢測,在每孔中加入50 μg 蛋白樣品,根據蛋白濃度計算樣本體積。 把濃縮的SDS-PAGE 緩沖液加入到上清液中,加熱上清液,5 min 后在預制的膠孔中把蛋白樣本加入,在封閉的環(huán)境中孵育。 1 h 后加入一抗,TBST 溶液將蛋白樣品清洗3 次,凝膠成像系統(tǒng)曝光成像,進一步分析。

1.3.7 RT-PCR 檢測Smad3 和AT1R 蛋白表達

分別取NC 組、SHR 組和TMGT 組大鼠50 mg腎組織,用TRIzol 裂解液將組織裂解,而后提取組織中總的RNA。 分別檢測腎組織中AT1R、Smad3 mRNA 的表達。 引物序列:AT1R 上游引物:5’-GAGAGGATTCGTGGCTTGAG-3’, 下 游 引 物: 5’-TAAGTCAGCCAAGGCGAGAT-3’;Smad3 上游引物:5’-CCTGGCTACCTGAGTGAAGATG-3’,下游引物:5’-AGTAGGAGATGGAGCACCAAAAC-3’。 擴 增 條件:95℃預變性2 min;95℃預變性15 s;60℃退火1 min,共計40 個循環(huán)。 AT1R、Smad3 mRNA 相對表達量用2-△△Ct法進行計算。

1.4 統(tǒng)計學方法

應用SPSS 20.1 軟件對NC 組、PT 組和miR-223 組的數據進行分析。 用平均數±標準差( ˉx±s)的形式表示3 組間的數據,3 組間的數據比較用單因素方差法進行檢驗,兩組間比較采用LSD-t進行檢驗;以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠尾動脈收縮壓測量比較

和NC 組大鼠相比,SHR 組和TMGT 組大鼠給藥后0 周尾動脈收縮壓均明顯升高(P＜0.05),但給藥后0 周SHR 組和TMGT 組大鼠尾動脈收縮壓沒有明顯的變化(P＞0.05)。 和NC 組相比,SHR 組在給藥后2、4 和8 周時大鼠尾動脈收縮壓顯著升高(P＜0.05);和SHR 組給藥后2、4 和8 周時大鼠尾動脈收縮壓相比,TMGT 組大鼠均得到顯著抑制(P＜0.05),見表1。

表1 各組大鼠不同時間尾動脈收縮壓測量比較(ˉx±s,n=20)Table 1 Comparison of tail artery systolic blood pressure in different groups at different time

2.2 各組大鼠外周血CD4+和CD8+細胞表達頻率及CD4+/CD8+比值

NC 組大鼠外周血CD4+細胞表達頻率為(63.21±2.13),CD8+細胞表達頻率為(34.21±1.65);SHR 組大鼠外周血CD4+(81.15±2.62)細胞表達頻率較NC組顯著升高(P＜0.05),CD8+(25.33±1.96)細胞表達頻率較NC 組顯著降低(P＜0.05);干預后的TMGT 組大鼠外周血CD4+(66.73±1.57)細胞表達頻率較SHR組顯著降低,CD8+(32.76±2.35)細胞表達頻率較SHR 組顯著升高(P＜0.05)。 和NC 組大鼠CD4+/CD8+比值(1.62±0.15)相比較,SHR 組大鼠CD4+/CD8+比值(2.26±0.31)顯著升高(P＜0.05);干預后的TMGT 組大鼠的CD4+/CD8+比值(1.85±0.12)較SHR 組顯著降低(P＜0.05),見圖1 和圖2。

圖1 流式細胞儀檢測各組大鼠外周血CD4+和CD8+細胞表達頻率及CD4+/CD8+比值Figure 1 Expression frequency of CD4+and CD8+cells and the ratio of CD4+/CD8+in peripheral blood of rats in each group were detected by flow cytometry

注:與NC 組相比,*P＜0.05;與SHR 組相比,#P＜0.05。

2.3 血清中IL-6、TNF-α 含量比較

和NC 組大鼠血清中炎癥因子IL-6 和TNF-α含量相比較,SHR 組大鼠顯著升高(P＜0.05);和SHR 組相比,TMGT 組大鼠血清中IL-6 和TNF-α 含量顯著降低(P＜0.05),見表2 和圖3。

注:與NC 組相比,*P＜0.05;與SHR 組相比,#P＜0.05。

表2 各組大鼠血清中IL-6、TNF-α 含量比較(ˉx±s,n=20)Table 2 Comparison of IL-6 and TNF-α in serum of rats in each group

2. 4 三組大鼠腎組織病理學變化比較

和NC 組大鼠腎組織比,SHR 組大鼠腎小球明顯增大,基底膜增厚且腎小球出現大量的空炮,毛細血管明顯狹窄,且出現閉塞;和SHR 組大鼠腎組織比,TMGT 組腎組織得到了明顯的改善,見圖4。

注:A:大鼠腎組織HE 染色;B:大鼠腎組織PAS 染色。

2.5 各組大鼠腎組織中Smad3 和AT1R 蛋白表達比較

和NC 組大鼠腎組織中Smad3 和AT1R 蛋白表達相比較,SHR 組均顯著增加(P＜0.05);和SHR 組相比,TMGT 組大鼠腎組織中Smad3 和AT1R 蛋白表達均顯著降低(P＜0.05),見圖5。

注:A:3 組大鼠腎組織中Smad3 蛋白和AT1R 蛋白表達;B:3 組大鼠腎組織中Smad3 蛋白和AT1R 蛋白表達比較。 與NC 組相比,*P＜0.05;與SHR 組相比,#P＜0.05。

2.6 各組大鼠腎組織中Smad3 和AT1R mRNA表達比較

NC 組大鼠腎組織中Smad3 和AT1R mRNA 分別為(1.01±0.10)和(0.27±0.02);SHR 組大鼠腎組織中Smad3 mRNA(3.27±1.21)和AT1R mRNA(0.89±0.05)較NC 組均顯著增加(P＜0.05);和SHR 組相比,TMGT 組大鼠腎組織中Smad3 mRNA(1.58±0.23)和AT1R mRNA(0.34±0.03)顯著降低(P＜0.05),見圖6。

注:與NC 組相比,*P＜0.05;與SHR 組相比,#P＜0.05。

3 討論

高血壓是一種慢性的炎癥反應,其發(fā)病機制和很多因素都有密切關系,例如遺傳基因、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)的激活、胰島素抵抗及血管內皮功能受損等,以上因素均可導致機體的免疫功能發(fā)生紊亂[11]。 研究發(fā)現,免疫功能在高血壓疾病中起主導作用,高血壓發(fā)生時,在血管周圍常發(fā)現大量的炎癥反應,在機體中炎癥免疫發(fā)生作用,增加趨化因子的表達,升高黏附因子的含量,同時增加超氧化物的釋放,從而加強機體的氧化應激反應[12]。炎癥免疫系統(tǒng)會降低血管的舒張功能,召集大量的內皮細胞,包括T 淋巴細胞等,增加內皮細胞的數量且增強細胞的粘附性,進而升高血壓[13]。 文獻顯示,炎癥免疫失調介導著高血壓的發(fā)生發(fā)展,高血壓的患病率會隨著炎癥因子的增加而增加[14]。 可見,免疫炎癥反應參與者高血壓的發(fā)生、發(fā)展。 天麻為蘭科植物,其干燥塊莖為常用名貴中藥,其具有很高的藥用價值和經濟價值。 蜜環(huán)菌隸屬于擔子菌亞門傘菌目白磨科蜜環(huán)菌屬。 蜜環(huán)菌是天麻生長發(fā)育的基礎,為天麻的生長發(fā)育提供養(yǎng)分。 有研究發(fā)現,復方天麻蜜環(huán)糖肽片可提高外周動脈血管的順應性,讓大腦的血量得到增加,與此同時也加強了中央血管的順應性,進而達到降低血壓的效果[15]。 本實驗結果顯示,SHR 組大鼠尾靜脈收縮壓較NC 組顯著升高,在復方天麻蜜環(huán)糖肽片干預后大鼠的動脈收縮壓得到明顯抑制,提示復方天麻蜜環(huán)糖肽片可有效改善高血壓大鼠血管的舒縮功能,進而實現降壓的目的。

T 淋巴細胞參與著高血壓疾病的發(fā)生發(fā)展,在高血壓發(fā)生時,活化的T 淋巴細胞向腎及外周血管遷移,可見調節(jié)免疫系統(tǒng)和高血壓的發(fā)生密切相關。 本研究發(fā)現,SHR 組大鼠外周血CD4+/CD8+淋巴細胞的比值較NC 組明顯升高,說明機體內的T淋巴細胞數量發(fā)生異常變化,導致免疫系統(tǒng)失衡,讓機體處于免疫抑制狀態(tài)。 經過復方天麻蜜環(huán)糖肽片干預后大鼠的CD4+/CD8+淋巴細胞比值得到明顯抑制,可見復方天麻蜜環(huán)糖肽片對高血壓大鼠的T 淋巴細胞的數量進行調節(jié),改善機體的免疫系統(tǒng),進而調節(jié)機體的血壓處于正常狀態(tài)。 張小娟等[16]通過對高血壓患者臨床研究證實,給予復方天麻蜜環(huán)糖肽片的觀察組患者的治療效果明顯好于給予非洛地平緩釋片聯合纈沙坦的對照組患者,以復方天麻蜜環(huán)糖肽片對輔助治療高血壓的效果顯著。 近些年有學者研究發(fā)現和高血壓有關的炎癥標記物有IL-6、TNF-α 等,本研究結果發(fā)現,SHR 組大鼠血清中IL-6、TNF-α 含量顯著高于NC 組,復方天麻蜜環(huán)糖肽片干預后高血壓患者血清中炎癥因子IL-6、TNF-α 含量均得到明顯抑制,可見復方天麻蜜環(huán)糖肽片在高血壓發(fā)生中有效調控IL-6、TNF-α促炎因子,進而發(fā)揮良好的抗炎效果。 丁東新等[17]研究發(fā)現,老年原發(fā)性高血壓患者血清中有大量炎癥因子IL-6、TNF-α 標記物,且炎癥標記物和血壓的嚴重程度成正相關。

血管緊張素Ⅱ是RAS 最重要的血管活性物質,主要通過AT1R、AT2R 來實現多種生理調節(jié)作用。血管緊張素Ⅱ通過AT1R 在循環(huán)系統(tǒng)內發(fā)揮著收縮血管、調節(jié)血壓和水鈉平衡等作用,而通過AT2R 受體調節(jié)擴血管的同時抑制腎小球旁細胞腎素合成[18]。 Smad 可分為Smad1 ～Smad8,其中Smad3 對受體有一定的調節(jié)作用。 有研究發(fā)現,激活smad 蛋白可通過轉錄抑制PPAY-γ 的表達,降低PPAY-γ對血管的保護作用,進而加重肺動脈高壓的發(fā)生。本研究顯示,SHR 組大鼠組織中Smad3 和AT1R 蛋白及相對表達量均高于NC 組大鼠,Smad3 升高說明高血壓大鼠腎受損,給予復方天麻蜜環(huán)糖肽片干預后高血壓大鼠腎組織中Smad3 和AT1R 蛋白及相對表達量得到明顯抑制,提示復方天麻蜜環(huán)糖肽片可抑制Smad3 和AT1R 蛋白表達,進而延緩高血壓性腎病的進程。 伊林等[19]研究發(fā)現,當歸可能通過其有效成分藁苯內酯對血壓有干預作用,可能通過AT1R 靶點發(fā)揮作用。 李攆萍[20]研究發(fā)現,復方天麻蜜環(huán)糖肽片聯合硝苯地平對高血壓患者起有效的治療效果,并且無嚴重的不良反應發(fā)生,值得臨床使用。

綜上所述,復方天麻蜜環(huán)糖肽片可有效調節(jié)高血壓大鼠T 淋巴細胞亞群,改善機體的免疫功能,緩解高血壓導致的早期腎損傷,同時抑制腎組織中的Smad3 和AT1R 蛋白表達,進而對高血壓疾病進行治療。