芍藥組培叢生芽增殖及生根技術(shù)的優(yōu)化

孫曉梅，張曉菊，裴新輝，霍麗茹，劉雪婷，宋曜紅

（1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院/遼寧省林木遺傳育種與培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽 110161；2.遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所，沈陽 110161）

芍藥（

Paeonia lactiflora

）為芍藥科芍藥屬多年生宿根草本植物，是我國傳統(tǒng)名花之一，距今已有4000年的栽培歷史，對我國賞花文化的形成起著重要推動(dòng)作用。芍藥也具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，種子可榨油，根部（白芍）可入藥，有收斂止血、緩中止痛等功效。長期以來，芍藥的繁殖主要采用分株繁殖和種子繁殖兩種方式。芍藥分株易受季節(jié)限制、繁殖系數(shù)低，而芍藥種子具有上下胚軸雙重休眠的特性，自然條件下，需2年的時(shí)間萌發(fā)，此后還需2~3年生長才能開花，繁殖周期過長，影響栽培育種工作。目前，分株繁殖和種子繁殖方式不能滿足芍藥商品苗規(guī)范化、規(guī)?；a(chǎn)的需求，阻礙芍藥的商業(yè)化發(fā)展。

植物組織培養(yǎng)技術(shù)具有繁殖速度快、增殖系數(shù)高、遺傳穩(wěn)定性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，利用組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行種苗生產(chǎn)是觀賞植物產(chǎn)業(yè)發(fā)展的必然趨勢。雖然前人對芍藥組織培養(yǎng)在外植體的選擇、外植體的消毒、叢生芽途徑、愈傷組織途徑、體細(xì)胞胚途徑等方面進(jìn)行了大量的研究，但芍藥再生體系的建立長期未取得突破性進(jìn)展，組織培養(yǎng)過程中存在種胚萌發(fā)整齊度差、組培苗增殖率低、生根質(zhì)量差、褐化等問題。本研究以芍藥種子為研究對象，通過篩選培養(yǎng)基、接種方式、植物激素配比、培養(yǎng)環(huán)境等手段，進(jìn)行種胚萌發(fā)、叢生芽誘導(dǎo)、腋芽增殖、組培苗生根的研究，以期提高種胚繁殖效率，并解決培養(yǎng)過程中的褐化難題，建立高效的芍藥種胚再生體系，加快芍藥組織培養(yǎng)的商業(yè)化進(jìn)程。

1 材料與方法

1.1 材料與培養(yǎng)條件

本試驗(yàn)采用的‘粉玉奴’ב粉玉樓’雜交種子，來自沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)芍藥種質(zhì)資源圃，于2019年采集種子，陰干后于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

本試驗(yàn)采用培養(yǎng)基種類有1/2MS、MS、WPM，蔗糖濃度為30g·L，瓊脂粉濃度為6.5g·L，培養(yǎng)基pH值為5.8；組織培養(yǎng)室光照時(shí)間為16h·d，光照強(qiáng)度2000~3000lx，溫度為24~26℃。

1.2 方法

1.2.1 切割方式影響種胚萌發(fā)試驗(yàn) 將芍藥種子置于無菌水中浸泡48h，剝?nèi)ネ鈱臃N皮，放入超凈工作臺(tái)上用75%酒精消毒30s后，倒入0.1%HgCl進(jìn)行消毒，消毒時(shí)間為5min，再用無菌水沖洗3~5次。使用3種切割方式（傳統(tǒng)切割、只留胚切割、半保留胚乳切割）進(jìn)行切割（表1），將不同處理后的種胚接種至培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基選用MS+0.5mg·LGA+1.0mg·L6-BA。30d后統(tǒng)計(jì)不同切割方式下種胚的萌發(fā)率、污染率、死亡率。

表1 芍藥種胚培養(yǎng)的不同切割方式
Table 1 Different cutting methonds for embryo culture

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1.2.2 叢生芽誘導(dǎo)基本培養(yǎng)基篩選試驗(yàn) 選取已萌發(fā)20~30d的胚苗，將胚苗接種至1/2MS、MS、WPM 3種基本培養(yǎng)基，GA濃度為1.0mg·L、6-BA濃度為1.0mg·L，每個(gè)處理10瓶，每瓶接5個(gè)外植體，重復(fù)3次，30d后觀察芽苗生長狀態(tài)，篩選出叢生芽誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基。

1.2.3 切除子葉誘導(dǎo)叢生芽試驗(yàn) 選取萌發(fā)20~30d胚苗切割子葉，轉(zhuǎn)接到WPM+0.5mg·L6-BA培養(yǎng)基誘導(dǎo)叢生芽，設(shè)置不切割子葉的胚苗做對照組，30d后觀察叢生苗的褐化、叢生芽誘導(dǎo)情況。

1.2.4 預(yù)處理對腋芽褐化現(xiàn)象減輕試驗(yàn) 將腋芽從誘導(dǎo)出的叢生苗上取下，進(jìn)行預(yù)處理（光照處理16h·d、暗培養(yǎng)24h·d），每種處理設(shè)置兩種培養(yǎng)基（1/2MS和1/2MS+3.0g·LAC）。預(yù)處理5d后將腋芽轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基（WPM+0.5mg·LGA+1.0mg·L6-BA）中誘導(dǎo)腋芽增殖，并設(shè)置不經(jīng)過預(yù)處理的腋芽（CK）做對照組，20d后統(tǒng)計(jì)腋芽褐化率。

1.2.5 6-BA、TDZ、GA誘導(dǎo)腋芽增殖試驗(yàn) 將經(jīng)過預(yù)處理的腋芽（暗處理5d、培養(yǎng)基：1/2MS+3.0g·LAC），轉(zhuǎn)接到WPM培養(yǎng)基中，并分別添加不同濃度的6-BA（0.3，0.6，1.0mg·L）、TDZ（0.3，0.6，1.0mg·L）、GA（0.3，0.6，1.0mg·L），先進(jìn)行5d暗處理，然后轉(zhuǎn)移到正常光照條件下培養(yǎng)。每個(gè)處理7瓶，每瓶接種4個(gè)外植體，重復(fù)3次，30d后觀察腋芽的生長、增殖狀態(tài)及褐化情況。

1.2.6 叢生苗生根最佳AC濃度的篩選 選用增殖60d的叢生苗，分別轉(zhuǎn)接到添加AC（0，1.0，2.0，3.0，4.0g·L）的培養(yǎng)基中，45d后觀察叢生苗的根部生長狀態(tài)。

1.2.7 誘導(dǎo)叢生苗生根最佳激素篩選 選用增殖60d的叢生苗，轉(zhuǎn)接到添加不同濃度IAA（0，0.5，1.0mg·L）、IBA（0，0.5，1.0mg·L）的1/2MS+3.0g·LAC培養(yǎng)基上，45d后觀察生根情況。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS20.0軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行One-Way ANOVA分析，并利用LSD法檢驗(yàn)差異顯著性（

p

≤0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 芍藥種胚的啟動(dòng)培養(yǎng)

由表2可知，啟動(dòng)培養(yǎng)30d后，萌發(fā)率最高的接種方式是半保留胚乳接種，萌發(fā)率達(dá)93.41%，顯著高于傳統(tǒng)接種（74.42%）和胚接種（77.21%）；在污染率方面，傳統(tǒng)接種污染率最高，為10.79%，只留種胚的接種方式污染率為3.31%；在成苗率方面，半保留胚乳接種成苗率為85.45%，顯著高于其他兩種接種方式；只留胚的接種方式萌發(fā)速度最快，平均5~7d可以看到胚苗生長明顯，但這種方式成苗率（71.17%）和萌發(fā)率（77.21%）低，因?yàn)樵谌》N胚的過程中傷害到胚，致使胚畸形生長，不能發(fā)育成苗。綜上，半保留胚乳接種方式優(yōu)于傳統(tǒng)接種和只留胚接種。

表2 切割方式對芍藥種胚萌發(fā)的影響
Table 2 Effects of cutting mode on seed embryo germination

注：同一列數(shù)字后的不同小寫字母表示0.05水平差異顯著，數(shù)據(jù)=平均值+標(biāo)準(zhǔn)偏差。下同。
Note:Differentuppercaselettersafter thesamecolumnnumber indicatesignificantdifferenceat0.05level.Data=mean+standard deviation.Thesamebelow.

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2.2 芍藥叢生芽增殖培養(yǎng)

2.2.1 不同基本培養(yǎng)基對叢生芽誘導(dǎo)的影響 由圖1和表3可知，叢生芽誘導(dǎo)30d后，WPM培養(yǎng)基叢生芽誘導(dǎo)率最高為92.67%，其次是MS培養(yǎng)基，叢生芽誘導(dǎo)率為86.67%，1/2MS培養(yǎng)基叢生芽誘導(dǎo)率最低，為73.33%；從抽芽率情況來看，WPM培養(yǎng)基誘導(dǎo)叢生芽的芽叢數(shù)最多，為2~5叢，MS培養(yǎng)基誘導(dǎo)叢生芽的芽叢數(shù)最少，為1~2叢；從芽苗生長狀態(tài)來看，1/2MS和MS培養(yǎng)基誘導(dǎo)的叢生芽整體淡黃綠色，抽芽不均或抽芽少，WPM培養(yǎng)基誘導(dǎo)的叢生芽整體濃綠，株型緊湊，抽芽多。綜上表明，基本培養(yǎng)基種類對芍藥叢生芽誘導(dǎo)率有顯著影響，對叢生苗生長狀態(tài)也有一定的影響，最適合叢生芽誘導(dǎo)的培養(yǎng)基為WPM培養(yǎng)基。

圖1 1/2MS、MS、WPM培養(yǎng)基誘導(dǎo)芍藥叢生苗對比Figure 1 1/2MS，MS and WPM medium-induced Paeonia lactiflora clumped seedlings comparison

表3 不同培養(yǎng)基種類對芍藥叢生芽誘導(dǎo)的影響
Table 3 Effects of different medium species on the induction of buds

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2.2.2 切除子葉對叢生芽誘導(dǎo)及褐化的影響 由表4可知，切除子葉時(shí)叢生芽誘導(dǎo)率和褐化率均高于未切除子葉，二者誘導(dǎo)率分別為99.33%和67.33%。在切除子葉后3~5d，可明顯觀察到子葉間萌發(fā)出芽點(diǎn)，未切除子葉的組培苗則需要10d觀察到芽點(diǎn)。且切除子葉時(shí)組培苗誘導(dǎo)叢生芽數(shù)量同樣多于未切除子葉（圖2）。綜上，切除子葉更有利于叢生芽的誘導(dǎo)。

表4 切除子葉對芍藥叢生芽誘導(dǎo)率及褐化率的影響
Table 4 Effects of cotyledon excision on induction rate of cluster buds

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圖2 切除子葉芍藥叢生芽誘導(dǎo)對比Figure 2 Comparison of bud induction of excised cotyledon Paeonia lactiflora cluster

2.2.3 預(yù)處理對腋芽褐化的影響 由表5可知，在相同光照條件下，A2處理的褐化率顯著低于A1處理，A4處理的褐化率顯著低于A3處理，說明在預(yù)處理培養(yǎng)基中加入3.0g·LAC有降低腋芽褐化率的作用。相同活性炭濃度預(yù)處理，A4處理腋芽褐化率顯著低于A2處理，暗培養(yǎng)可減輕腋芽的褐化。A1處理的褐化率顯著低于對照組，說明轉(zhuǎn)接可以有效地降低褐化率。綜上，腋芽增殖培養(yǎng)前在含有3.0g·LAC培養(yǎng)基上進(jìn)行5d的暗培養(yǎng)預(yù)處理，能夠有效降低轉(zhuǎn)接后的褐化率，且轉(zhuǎn)接能夠有效改善褐化。

表5 預(yù)處理對芍藥腋芽褐化的影響
Table 5 Effects of pretreatment on browning of axillary bud

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2.2.4 外源生長調(diào)節(jié)物質(zhì)對腋芽增殖的影響

2.2.4.1 6-BA對腋芽增殖的影響 由表6和圖3可知，在濃度為0.6mg·L6-BA的培養(yǎng)基中，腋芽生長狀態(tài)最好，基部分化出新的叢生芽生長點(diǎn)，每叢真葉數(shù)4~6片，此時(shí)褐化率為51.19%；在后續(xù)繼代培養(yǎng)中，添加1.0mg·L6-BA的培養(yǎng)基內(nèi)腋芽基部形成愈傷組織，腋芽停止分化，葉片生長不良。

圖3 3種6-BA濃度下芍藥腋芽生長狀態(tài)Figure 3 Growth status of Paeonia lactiflora axillary buds under three 6-BA concentrations

表6 6-BA濃度對誘導(dǎo)芍藥腋芽增殖的影響
Table 6 Effects of 6-BA concentration on induction of axillary proliferation

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2.2.4.2 TDZ 對腋芽增殖的影響 由表7和圖4可知，添加TDZ的培養(yǎng)基中，腋芽整體基部膨大，真葉葉柄短粗或少有葉片，葉片高度在1~3.5cm。TDZ濃度越高，葉片生長情況越差，TDZ濃度達(dá)到1.0時(shí)，葉片扭曲變形，無法正常生長。

表7 TDZ濃度對誘導(dǎo)芍藥腋芽增殖的影響
Table 7 Effects of TDZ concentration on induction of axillary proliferation

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圖4 3種TDZ濃度下芍藥腋芽生長狀態(tài)Figure 4 Growth status of Paeonia lactiflora axillary buds under three TDZ concentrations

2.2.4.3 GA對腋芽增殖的影響 由圖5和表8可知，隨著GA濃度的增長，誘導(dǎo)出的叢生芽叢數(shù)增加，但同時(shí)導(dǎo)致葉片變小畸形、葉柄黃化、玻璃化等現(xiàn)象。GA濃度為0.3mg·L時(shí)，真葉嫩綠色，健康生長，長7mm；當(dāng)GA濃度達(dá)到1.0mg·L時(shí)，葉柄細(xì)弱，呈嫩黃色透明狀，繼代培養(yǎng)后無法輸送營養(yǎng)物質(zhì)，最終萎蔫。

表8 GA 濃度對誘導(dǎo)芍藥腋芽增殖的影響
Table 8 Effects of GA concentration on induction of axillary proliferation

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圖5 3種GA 3濃度下腋芽生長狀態(tài)Figure 5 Growth status of Paeonia lactiflora axillary buds under three GA 3 concentrations

2.3 叢生苗生根

2.3.1 AC濃度對叢生苗生根的影響 由表9可知，培養(yǎng)基中添加AC的處理，其生根率顯著高于未添加AC的處理。AC的濃度為3.0g·L時(shí)，叢生苗的生根率最高，達(dá)到80.00%，且此時(shí)叢生苗生根狀態(tài)最好，根系覆蓋度廣。

表9 AC濃度對芍藥叢生苗生根的影響
Table 9 Effects of AC concentration on rooting of cluster seedlings

注：+表示生根量少；++表示2～3條側(cè)根，平均長度1.0～2.0cm；+++表示2～3條側(cè)根，平均長度1.5～3.5cm；++++表示4條及以上側(cè)根，平均長度
1.5～3.5cm。
Note:+means less rooting;++represents 2-3 lateral roots with an average length of 1.0-2.0 cm;+++represents 2-3 lateral roots with an averagelength of 1.5-3.5 cm;++++represents4 or morelateral roots with an averagelength of 1.5-3.5 cm.

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2.3.2 生長素濃度及種類對叢生苗生根的影響 由圖6和表10可知，C2處理生根率最高，達(dá)到69.38%，該培養(yǎng)基中的不定根狀態(tài)最好，根系數(shù)量多覆蓋面積大；C1處理的叢生苗側(cè)根短小，數(shù)量少；在相同生長素濃度下，IBA的生根誘導(dǎo)率高于IAA，但I(xiàn)AA的褐化率低于IBA；C3處理生根率最低，僅為38.29%，且只有主根伸長生長，未萌發(fā)出側(cè)根；同為IAA濃度1.0mg·L時(shí)，對比C5處理、C6處理的生根率、褐化率，發(fā)現(xiàn)IBA濃度越高生根率越高，褐化率也隨之增高。綜上，添加1.0mg·LIBA可以有效誘導(dǎo)出不定根，IAA的誘導(dǎo)生根效果不明顯。1/2MS+1.0mg·LIBA+3.0g·LAC是最適宜誘導(dǎo)叢生苗生根的培養(yǎng)基。

表10 生長素對芍藥叢生苗生根及褐化的影響
Table 10 Effects of auxin on rooting of clustered shoots and browning

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圖6 不同生長素芍藥叢生苗的生長狀態(tài)Figure 6 Growth status of Paeonia lactiflora clustered seedlings under different auxin treatments

3 討論與結(jié)論

胚乳組織導(dǎo)致休眠是許多雙子葉植物種子的主要休眠類型。芍藥種胚通常需要6-BA、GA等打破休眠。前人研究發(fā)現(xiàn)，芍藥種子外種皮和胚乳阻礙胚吸收培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分，影響了培養(yǎng)基中激素的作用，胚乳中也可能含有對種胚的生長起阻礙作用的某種抑制成分。本研究結(jié)論與前人大致相同，胚接種萌發(fā)快、污染率低，萌發(fā)成功的胚有部分畸形不能成苗；傳統(tǒng)接種萌發(fā)時(shí)間分散；去除種皮、保留小部分胚乳并露出部分的胚是最好的外植體處理方式，萌發(fā)集中，成苗率高。

增殖培養(yǎng)是為保證叢生苗隱芽、腋芽以及不定芽的分化和生長，將芍藥叢生苗上的腋芽分割，繼代培養(yǎng)可擴(kuò)大芍藥組培苗增殖系數(shù)。前人研究發(fā)現(xiàn)不同品種的牡丹適合不同的基本培養(yǎng)基。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，‘粉玉奴×粉玉樓’雜交組培苗在1/2MS、MS、WPM培養(yǎng)基上表現(xiàn)不同，WPM誘導(dǎo)的叢生苗子葉短小，叢生芽多，真葉短粗健康，最適合進(jìn)行叢生芽誘導(dǎo)。且子葉損傷的胚苗更易誘導(dǎo)出叢生芽。據(jù)觀察，腋芽增殖過程中，褐化反應(yīng)劇烈，未經(jīng)處理的腋芽有80%會(huì)在繼代的15d內(nèi)褐化并死亡。前人研究發(fā)現(xiàn)，活性炭對褐化有一定的控制作用，且外源生長調(diào)節(jié)物質(zhì)對腋芽的生長發(fā)育起決定性作用。本試驗(yàn)研究結(jié)論與前人相似，認(rèn)為AC、暗培養(yǎng)、轉(zhuǎn)接能夠有效地降低褐化率；6-BA對腋芽的生長有重要作用，可以使真葉健康生長，誘導(dǎo)出新的生長點(diǎn)；GA可促進(jìn)芽的誘導(dǎo)，低濃度的GA處理下真葉生長良好，高濃度的GA會(huì)引起腋芽的玻璃化，這與蔡葛平的結(jié)論相似。本研究發(fā)現(xiàn)，腋芽對激素濃度變化的比叢生苗更為敏感，需要繼續(xù)探討更低濃度的激素組合，尤其是TDZ和GA，也可通過提高培養(yǎng)基硬度、添加AC、改變光照環(huán)境等，減輕高濃度GA帶來的玻璃化問題。

生長素是誘導(dǎo)芍藥組培苗生根的重要因素，目前芍藥組培苗常使用的是IBA、NAA、IAA，但NAA誘導(dǎo)的根是愈傷分化而來，與苗連接不緊密，不適宜移栽。前人研究牡丹時(shí)發(fā)現(xiàn)，IBA和AC配合使用是牡丹組培苗最有效的生根方法。本研究發(fā)現(xiàn)，生長素與AC的配合使用，也是芍藥組培苗最有效的生根方法。添加AC的生根苗，根部為白色有韌性的須根，這可能是因?yàn)锳C為組培苗根部的生長，營造了與自然生長相似的黑暗環(huán)境，添加AC的生根苗更適合進(jìn)行下一步的壯苗移栽。在添加AC的培養(yǎng)基中，IAA或IBA的濃度低于1.0mg·L時(shí)，誘導(dǎo)生根效果都不佳；IBA誘導(dǎo)的根細(xì)長有側(cè)根，IAA誘導(dǎo)的主根細(xì)長，不易長側(cè)根。

芍藥組織培養(yǎng)技術(shù)經(jīng)過20多年的研究，在外植體的選擇與處理、叢生芽的誘導(dǎo)、愈傷組織的誘導(dǎo)等方面取得了諸多進(jìn)展，但目前的芍藥種胚再生技術(shù)沒有達(dá)到擴(kuò)大繁殖率和組培苗出瓶、移栽的程度，從而無法構(gòu)建完整的轉(zhuǎn)基因體系。本研究在完善了芍藥叢生芽誘導(dǎo)途徑步驟之外，同時(shí)研究了腋芽的增殖培養(yǎng)，下一步應(yīng)著重解決腋芽的生根問題，實(shí)現(xiàn)芍藥叢生芽再生。