低溫水提松茸免疫活性因子的試驗研究

杜漢廷，葛 麒，林松毅，陳 冬

（大連工業(yè)大學食品學院，國家海洋食品工程技術研究中心，大連 116034）

0 引 言

松茸（Singer），學名松口蘑，屬擔子菌門擔子菌綱傘菌目口蘑科口蘑屬，主要分布于亞歐和北美地區(qū)，在中國的吉林省、云南省以及川藏地區(qū)等都有分布。松茸是一種珍貴的野生藥食用菌，因其味道鮮美、基礎營養(yǎng)成分全面且其子實體中含有松茸雙鏈多糖、松茸醇及松茸多肽等珍貴生物活性成分而備受推崇。松茸子實體中蛋白質含量近20%，這些蛋白質為人體提供營養(yǎng)物質的同時，也具備抗炎、抗癌、抗氧化、增強免疫調節(jié)等多種生物活性。近些年，松茸已成為全球化的天然滋補類真菌之一，其所含的蛋白質資源作為一種功能性食品組分值得進一步研究。

免疫調節(jié)是機體免疫系統(tǒng)應對內外部有害因素所進行的一個復雜的生物過程，在各種人類疾病中發(fā)揮重要作用。巨噬細胞是構成機體免疫系統(tǒng)中免疫細胞的重要成員之一，其被激活后通過分泌NO、HO、TNF-、IL-6等免疫活性分子直接殺傷病原微生物，進行免疫調節(jié)。目前，關于食用菌免疫活性因子已開展了一些研究。有研究表明，云芝中的糖肽具有顯著的免疫調節(jié)活性，能夠促進大鼠IFN-、IL-1、IL-2的產生，增強免疫調節(jié)能力；Ditamo等研究發(fā)現(xiàn)雙孢菇中凝集素具有減少先天性和適應性反應的體內免疫調節(jié)作用。此外，Yu等研究發(fā)現(xiàn)靈芝多糖顯著刺激小鼠腹腔巨噬細胞吞噬活性，提高NO、TNF-和IL-1的產生，激活MAPKs、PI3K/Akt和NF-κB信號通路，恢復Cy誘導小鼠的免疫抑制。Zhao等研究表明金針菇粗多糖可調節(jié)ICR小鼠腸道微生物群，提高血清免疫球蛋白和細胞因子的水平，具有潛在的抑制肥胖和免疫調節(jié)能力。Wu等通過體內免疫調節(jié)試驗表明，猴頭菇多糖能夠顯著提高免疫器官指數(shù)、脾細胞增殖能力、NK細胞活性和巨噬細胞吞噬作用，對環(huán)磷酰胺誘導的小鼠免疫抑制具有保護作用。然而，關于松茸源免疫活性因子的研究鮮有報道，尤其是蛋白免疫活性因子研究相對缺乏。

水浸提法是一種傳統(tǒng)的提取方法，在食用菌活性物質提取中應用廣泛，此法相較于醇提法、微波或超聲輔助提取等提取方法，具有適用范圍廣，安全系數(shù)高，操作簡便等優(yōu)點，更加適用于工業(yè)化生產需求。一方面，低溫提取更有利于完整保持提取物中的活性成分；另一方面，國內外學者研究多集中于中高溫（>40 ℃）水浸提得到的松茸提取物。因此，關于松茸低溫水浸提物及其免疫活性的研究值得進一步的探究。

本研究采用響應面法（Response Surface Methodology，RSM），分別以松茸蛋白得率和小鼠巨噬細胞NO釋放量為考察對象，優(yōu)化低溫（≤30 ℃）水平下松茸水提免疫活性因子（Tricholoma Matsutake Water Extract Immunoactive Factor，TMWEIF）的提取工藝。通過氨基酸分析和光譜學分析，初步解析TMWEIF的結構及物質組成，探討TMWEIF的結構與功能活性的潛在聯(lián)系。本研究旨在優(yōu)化出綜合性能較好的松茸低溫水提工藝參數(shù)，并對提取物進行結構組成的初步解析，為松茸源免疫活性因子的分離純化、免疫調節(jié)的潛在機制提供研究基礎，為松茸的蛋白質資源開發(fā)利用及其保健食品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

長白山野生松茸凍干片，吉林省延吉市順鑫松茸貿易有限公司；小鼠巨噬細胞系RAW 264.7細胞，中科院生物化學與細胞生物學研究所。

牛血清白蛋白標準品（Bovine Serum Albumin，BSA）、噻唑藍（Methyl Thiazolyl Tetrazolium，MTT），北京索萊寶科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基，美國Hyclone公司；脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS），美國Sigma公司；NO檢測試劑盒，上海碧云天生物技術有限公司；所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

Infinite M 200多功能酶標儀，瑞士Tecan公司；L-8800型氨基酸分析儀，日本日立有限公司；IR Prestige-21傅里葉變換紅外光譜儀，日本島津公司；J-1500圓二色光譜儀，日本Jasco公司。

1.3 方法

取適量凍干松茸片，用高速粉碎機打碎成粉，過孔徑0.25 mm篩網(wǎng)，密封置于干燥處備用。

準確稱量10 g松茸干粉，按設定提取條件開展試驗。提取結束后，將混合物在4 ℃、6 760×的條件下離心，上清液凍干保存至-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

采用雙縮脲法測定樣品中蛋白含量，并做適當改進。以BSA（10 mg/mL）為標準品，按照1∶4比例添加雙縮脲試劑，混勻反應15 min后，于540 nm處測定吸光度，以BSA質量濃度為橫坐標（mg/L），吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。TMWEIF蛋白含量測定標準曲線回歸方程：=0.044 8-0.003 8，=0.999 4。蛋白得率的計算公式

式中為由BSA標準曲線求得的蛋白濃度，mg/mL；為水提液總體積，mL；為松茸干粉質量，g。

選定液料比（10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1 mL/g）、提取時間（30、60、90、120、150 min）、提取溫度（10、15、20、25和30 ℃）3個因素進行單因素試驗，考察各單因素水平對松茸水提液中蛋白得率的影響，以確定相關工藝條件。

結合單因素試驗結果，分別以TMWEIF蛋白得率（）和巨噬細胞NO釋放量（）為響應值設計響應面試驗，響應面試驗各因素的水平見表1。

表1 響應面試驗因素與水平 Table 1 Factors and levels of response surface analysis

選取正常傳代的RAW 264.7細胞，調整細胞密度為2×10，接種到96孔板內，37 ℃、5% CO細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后棄掉培養(yǎng)液。每孔加入200L不同濃度的（0.015、0.030、0.060、0.125、0.250、0.500、1.000和2.000 mg/mL）TMWEIF溶液，同時設空白對照組（細胞培養(yǎng)液）和模型對照組（10g/mL的LPS溶液）。孵育24 h后，每孔加入20L 1 mg/mL MTT溶液，4 h后棄上清，每孔加入150L 二甲基亞砜，振蕩15 min，測定570 nm處吸光度值（OD）。每組設定6個重復。

RAW 264.7細胞的處理方法及分組同1.3.6節(jié)，各試驗組樣品處理24 h，收集各孔上清液按照NO檢測試劑盒要求測定NO含量。

參照王麗波等的方法，采用KBr壓片法進行FT-IR光譜分析，波數(shù)掃描范圍4 000～400 cm，分辨率4 cm。

取0.025 mg/mL待測樣品水溶液，置于石英比色皿中，以去離子水為參比進行紫外全光譜掃描（200～700 nm）。

采用雙縮脲法測定樣品中蛋白含量，苯酚-硫酸法測定樣品中多糖含量，TMWEIF蛋白含量測定標準曲線回歸方程：=0.775 9+0.017 8，=0.997 2，TMWEIF多糖含量測定標準曲線回歸方程：=5.619 5+0.065 2，=0.992 2。計算公式如下

式中為由BSA（葡萄糖）標準曲線求得的蛋白（多糖）濃度，mg/mL；為TMWEIF水溶液總體積，mL；為TMWEIF質量，g。

參照陳振家等的方法，將1 mg/mL待測樣品水溶液于190～240 nm范圍進行圓二色光譜掃描，以去離子水為參比。

參照GB 5009.124—2016《食品中氨基酸的測定》。取適量樣品與6 mol/L HCl置于安瓿瓶中，酒精噴燈灼燒封口，于110 ℃烘箱中水解22 h，取出冷卻至室溫，旋蒸，0.02 mol/L HCl定容至25 mL，0.22m濾膜過濾，移至進樣瓶中待測，重復3次。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計方法

試驗數(shù)據(jù)采用 Origin 2019b、SPSS 25.0和Design-Expert 8.0.6 軟件進行處理和分析，結果用均值±標準差表示，顯著性水平為<0.05。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果分析

由圖1 a可知，當液料比由10∶1增至40∶1 mL/g時，TMWEIF中蛋白得率升高，得率在液料比40∶1 mL/g時較高，為7.62%。這是因為較小的液料比使溶液體系較黏稠，無法析出更多的有效成分，但隨著液料比的增加，松茸粉充分溶解，使蛋白得率逐步上升。當液料比過大時，蛋白質分子與水之間的擴散作用會影響TMWEIF中蛋白的溶出，導致得率有所下降，因而液料比由40∶1增至50∶1 mL/g時，TMWEIF中蛋白得率降低。

如圖1 b所示，TMWEIF中蛋白得率隨提取時間的延長呈上升趨勢，當提取150 min時，蛋白得率達到最大（<0.05）。這是因為隨著提取時間的延長，松茸顆粒膜逐漸破裂，增加有效成分溶出，蛋白得率上升。

圖1 c所示，在10～30 ℃提取溫度之間，蛋白得率緩慢上升，30 ℃時，蛋白得率升至最高。這可能是因為在較低的溫度下，溶液黏度較高，擴散系數(shù)較低，溫度升高加速分子運動，蛋白析出加快。

圖1 液料比、提取時間和提取溫度對蛋白得率的影響 Fig.1 Effects of liquid-solid ratio, extraction time and extraction temperature on yield of protein

2.2 響應面優(yōu)化TMWEIF蛋白的提取工藝試驗結果

在單因素試驗的基礎上，分別以松茸蛋白得率（）和巨噬細胞NO釋放量（）為響應值，進行三因素三水平的響應面優(yōu)化試驗，對15個試驗點的響應值進行回歸性分析。試驗設計及結果見表2。

表2 響應面試驗設計與結果 Table 2 Experimental design and results of response surface analysis

運用Design-Expert 8.0.6軟件進行多元回歸擬合，得到的回歸方程如下

式中、和分別為液料比、提取時間和提取溫度的編碼值。

響應面優(yōu)化試驗結果的方差分析顯示，兩個響應值的模型決定系數(shù)分別為0.884 8、0.799 3，校正后分別為0.731 1、0.598 5，表明模型的相關性良好。和的回歸模型均是顯著的（<0.05）；失擬項均不顯著（>0.05），表明模型方程和試驗擬合度良好，能較好解釋響應中的變異。此外，兩個模型的變異系數(shù)均小于5%，說明模型對響應值的置信度良好，該模型可以很好地反映試驗的真實性。綜上所述，此回歸模型對兩個響應值的擬合程度較好，試驗誤差較小。

利用響應面模型可擬合出2個響應值對試驗因素交互作用的三維空間曲面圖，以直觀表示響應值的變化趨勢及各個因素對于響應指標的影響變化，二維等高線圖則進一步展現(xiàn)每個因素間的交互作用并確定最優(yōu)點。

圖2是三因素交互作用對的影響的三維圖形。如圖2所示，圖a、b等高線偏向于圓形，曲面平緩，液料比與提取時間和提取溫度的交互作用均不顯著（>0.05）；圖c等高線近似橢圓，曲面圖c陡峭，提取時間和溫度的交互作用顯著（<0.05）。根據(jù)值的大小，判定3個因素對的影響力是：>>。

圖2 各因素交互作用對蛋白得率（Y′）影響的響應面圖 Fig.2 Response surface map of the interaction of various factors on yield of protein (Y′)

圖3是3個試驗因素交互作用對RAW 264.7細胞NO釋放量（）影響的三維圖形。如圖3所示，等高線圖形均趨向于圓形且曲面坡度較平，兩兩因素間交互作用均不顯著（>0.05）。根據(jù)值的大小，判定3個因素對的影響力是：>>。

圖3 各因素交互作用對巨噬細胞NO釋放量（Y"）影響的響應面圖 Fig.3 Response surface map of the interaction of various factors on NO release amount from macrophage (Y")

響應面優(yōu)化試驗預測結果顯示，優(yōu)化工藝參數(shù)為液料比45.11∶1 mL/g、提取時間142.07 min、提取溫度20 ℃；優(yōu)化工藝參數(shù)為液料比30∶1 mL/g、提取時間126.57 min、提取溫度20 ℃。結合實際操作可行性，對和的優(yōu)化工藝參數(shù)予以改良并進行3次重復驗證試驗。優(yōu)化參數(shù)為液料比45∶1 mL/g、提取時間140 min、提取溫度20 ℃，所得提取物記為TMWEIF-1；優(yōu)化參數(shù)為液料比30∶1 mL/g、提取時間120 min、提取溫度20 ℃，所得提取物記為TMWEIF-2。結果顯示，、蛋白得率分別是8.07%±0.11%、7.06%±0.09%；提取的活性因子TMWEIF-1、TMWEIF-2的NO釋放量分別是（3.68±0.03）g/mL、（4.11±0.17）g/mL，二者具有顯著性差異（<0.05）。所得實際值與預測值接近，表明各工藝參數(shù)準確可靠。

2.3 傅里葉紅外光譜分析

TMWEIF的FT-IR譜圖如圖4 a所示，對于TMWEIF-1，其在3 398 cm處存在-O-H伸縮振動吸收峰，來源于TMWEIF中的蛋白質；2 933 cm處的吸收峰屬于酯類的亞甲基-C-H的反對稱伸縮振動吸收峰，這來源于其中的糖鏈或蛋白質。同時，對于TMWEIF-2，其分別在3 402 cm和2 929 cm處存在-O-H和酯類的亞甲基-C-H的吸收峰，與TMWEIF-1相近，表明它們組分相似。

TMWEIF-1和TMWEIF-2在1 628 cm和1 591 cm處的吸收峰是蛋白質的酰胺Ⅰ帶的特征吸收峰，來源于C=O的伸縮振動。酰胺Ⅰ帶的特征吸收峰的存在說明了TMWEIF中含有一定量的蛋白質。

TMWEIF在1 200～700 cm范圍內主要出現(xiàn)1 080 cm、1 037 cm、1 029 cm、932 cm和888 cm5個吸收峰，推測是多糖類物質吸收峰。TMWEIF-1在1 080 cm(-C-O-)和1 029 cm(-C-C-)處的特征吸收峰表明了葡聚糖的存在，932 cm和888 cm附近的吸收峰表明其中既含有-型糖苷鍵，也含有-型糖苷鍵；而TMWEIF-2中1 080 cm、1 037cm和888cm的吸收峰表明其中存在葡聚糖且主要是-型糖苷鍵。

綜上所述，F(xiàn)T-IR光譜吸收峰特征顯示，TMWEIF-1和TMWEIF-2中蛋白質和多糖物質的吸收峰較強，表明TMWEIF-1和TMWEIF-2中主要含有的成分是蛋白質和多糖類物質。這與TMWEIF基本組成含量測定結果相一致。

2.4 紫外光譜分析

如圖4 c所示，TMWEIF-1和TMWEIF-2在200 nm附近有一強吸收峰，260~280 nm之間有一個弱的吸收峰，表明TMWEIF中含有一定量的多糖和蛋白類物質，這與FI-IR光譜分析結果一致。此外TMWEIF-1的紫外光譜掃描曲線位于TMWEIF-2的曲線之上，表明以蛋白得率為響應值優(yōu)化的提取工藝所得TMWEIF-1的蛋白和多糖含量高。這與TMWEIF基本組成含量測定結果相一致。

2.5 TMWEIF基本組成分析

TMWEIF中的多糖含量和蛋白含量測定結果顯示，TMWEIF-1、TMWEIF-2的多糖含量分別為（306.95±1.16）mg/g、（304.98±1.35）mg/g，二者之間無顯著性差異（>0.05）；蛋白含量分別為（132.14±4.43）mg/g、（107.78±4.45）mg/g，二者之間具有顯著性差異（<0.05）。

2.6 圓二色譜分析

利用圓二色譜可以解析蛋白質的二級結構組成，如圖 4 d所示，TMWEIF-1和TMWEIF-2在190 nm 處呈現(xiàn)負吸收峰，在205 nm附近存在正吸收峰，表明TMWEIF中的蛋白含有大量的-轉角結構；TMWEIF-2較TMWEIF-1相比，TMWEIF-2中-轉角結構含量更高（72.00%±2.92%，<0.05）。此外，TMWEIF-1和TMWEIF-2均在210 nm附近有一負峰，表明TMWEIF含有-螺旋結構，且TMWEIF-1含有更高比例的-螺旋（39.88%± 3.56%，<0.05）。而研究表明，-螺旋和-折疊代表蛋白質分子的有序性，-轉角和無規(guī)則卷曲結構均反映蛋白質分子松散程度。這說明了TMWEIF-1中的蛋白質有序性更好，TMWEIF-2中蛋白相對較松散。而TMWEIF-2誘導巨噬細胞釋放NO的能力更高，可能與其相對松散的結構從而能暴露出更多的作用位點有關。

圖4 TMWEIF的傅里葉紅外光譜、氨基酸組成、紫外光譜和圓二色譜分析 Fig.4 Fourier transform infrared spectroscopy, amino acid composition, ultraviolet spectrum and circular dichroism analysis of TMWEIF

2.7 氨基酸組成分析

兩組TMWEIF的氨基酸含量如表3所示，TMWEIF-1和TMWEIF-2的氨基酸均為17種，氨基酸含量無顯著性差異。從總氨基酸含量（TAA）來看，氨基酸組分總含量平均值為9.7%，兩種TMWEIF中必需氨基酸（EAA）含量較豐富（>0.05），EAA平均含量占TAA的27%，EAA/NAA分別為38.43%、37.77%，說明TMWEIF具備良好的營養(yǎng)價值。兩組TMWEIF中氨基酸含量高低排序一致，含量較高的依次是谷氨酸和天冬氨酸，分別占氨基酸總量的34.65%、35.65%，2種氨基酸屬于鮮味氨基酸，符合松茸鮮味濃郁的特征。另有研究表明，谷氨酸在生長的關鍵時期包括快速生長的新生兒時期扮演著重要角色，可增強機體免疫細胞的免疫功能。本研究對NO的測定結果表明TMWEIF能夠促進巨噬細胞釋放NO，發(fā)揮免疫調節(jié)的作用，而TMWEIF中豐富的谷氨酸則可能是其具備良好免疫活性重要原因之一。此外，谷氨酸還具有對大多數(shù)區(qū)域的神經(jīng)元興奮作用，參與海馬區(qū)的學習記憶過程，所以TMWEIF具有開發(fā)提高免疫力和記憶力食品的應用潛力。

表3 TMWEIF的氨基酸含量分析 Table 3 Analysis of amino acids contents of TMWEIF mg·g-1

如圖4 b所示，TMWEIF-1和TMWEIF-2的必需氨基酸、疏水氨基酸、堿性氨基酸、酸性氨基酸的百分含量相近。曾有研究發(fā)現(xiàn)，食源性蛋白的免疫效果與其氨基酸組成及含量有關，特別是疏水氨基酸和堿性氨基酸。TMWEIF中疏水氨基酸和堿性氨基酸平均占氨基酸總量的48%。因此，TMWEIF可能具備良好的免疫效果，這與RAW264.7細胞NO釋放量測定結果相符。

綜上所述，TMWEIF中所含氨基酸種類齊全，必需氨基酸含量較豐富，但TMWEIF-2中與免疫效果密切相關的谷氨酸、疏水氨基酸和堿性氨基酸相對含量占比略高，基于營養(yǎng)價值和潛在生物活性兩方面考慮，TMWEIF提取工藝2更具有免疫活性因子制備的應用價值。

3 結 論

1）基于響應面法，以蛋白得率為指標確定了松茸水提免疫活性因子1（Tricholoma Matsutake Water Extract Immunoactive Factor-1，TMWEIF-1）優(yōu)化的工藝參數(shù)：液料比45∶1 mL/g、提取時間140 min、提取溫度20 ℃；以巨噬細胞NO釋放量為指標確定了松茸水提免疫活性因子2（Tricholoma Matsutake Water Extract Immunoactive Factor-1，TMWEIF-2）的優(yōu)化的工藝參數(shù)：液料比30∶1 mL/g、提取時間120 min、提取溫度20 ℃。

2）TMWEIF-1和TMWEIF-2主要成分均為蛋白質和多糖，所含蛋白質二級結構為-螺旋和-轉角，所含多糖以-型糖苷鍵的葡聚糖為主；TMWEIF-2中蛋白質-轉角比例顯著高于TMWEIF-1（<0.05），蛋白相對較松散。TMWEIF-2中與免疫活性高度相關的谷氨酸、疏水氨基酸和堿性氨基酸的總量高于TMWEIF-1，NO釋放量顯著高于TMWEIF-1。并且，TMWEIF-2制備工藝的液料比小，提取時間短。因此，TMWEIF-2的制備工藝參數(shù)更具應用前景。

本研究為松茸源免疫活性因子開發(fā)利用提供了理論依據(jù)。今后將對松茸多肽和松茸多糖進行進一步的免疫活性研究。