貴州煙區(qū)靶斑病病原菌的融合群研究與戊唑醇室內(nèi)毒力測(cè)定

聶忠揚(yáng) 林松 祖慶學(xué) 饒陳 張翼飛 康耀文

摘要 為了準(zhǔn)確鑒定貴州煙區(qū)靶斑病的病原，明確其融合群劃分，初步測(cè)定低毒殺菌劑戊唑醇的室內(nèi)毒力;從貴州開陽暴發(fā)靶斑病嚴(yán)重的煙田分離純化病原菌菌株，開展顯微鏡形態(tài)觀察和ITS分子標(biāo)記測(cè)序，進(jìn)行回接致病力分析，然后根據(jù)貴州菌株與參考立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）菌株ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育分析，確定融合群劃分，最后開展7個(gè)濃度的戊唑醇培養(yǎng)基抑制菌絲生長(zhǎng)的試驗(yàn)，并根據(jù)抑制率計(jì)算半致死率（EC 50）;共在貴州開陽煙區(qū)獲得靶斑病病原菌純培養(yǎng)菌株15株，在顯微鏡下可以清楚看到菌絲的“T”型分枝結(jié)構(gòu)，菌株長(zhǎng)度約700 bp的ITS基因片段與GenBank數(shù)據(jù)庫上的立枯絲核菌參考序列存在高相似性，回接健康煙苗也可以產(chǎn)生癥狀相似的壞死病斑，貴州菌株全部與融合群AG-3的參考序列聚集在一起，戊唑醇對(duì)15株立枯絲核菌菌株的EC 50均小于0.003 mg/mL。由此可知，開陽等貴州煙區(qū)近年暴發(fā)的葉斑類病害確定為靶斑病，病原菌為立枯絲核菌，屬于國(guó)內(nèi)大多數(shù)煙區(qū)報(bào)道的融合群AG-3，戊唑醇對(duì)其具有良好的防效，可以開展后續(xù)大田試驗(yàn)。

關(guān)鍵詞 煙草;靶斑病;立枯絲核菌;融合群;戊唑醇

中圖分類號(hào) S435.72? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2022）07-0137-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.07.033

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Study on Anatamosis Group and Tebuconazole Effect of Target Spot on Tobacco in Guizhou

NIE Zhong-yang，LIN Song，ZU Qing-xue et al

（Kaiyang Branch Company，Guiyang Tobacco Company，Guiyang，Guizhou 550300）

Abstract In order to identify the pathogen of target spot on tobacco in Guizhou，classify the anastomosis group of Rhizoctonia solani，and detect the efficacy of tebuconazole on plate，isolates of target spot pathogen was purified from Kaiyang，Guizhou.The morphology was observed by microscope and ITS fragment was sequenced，and inoculation test was conducted.Phylogenetic study was done between ITS sequences of Guizhou isolates and references.Mycelia inhibition test was also accomplished on media with seven concentrations of tebuconazole.There were 15 isolates purified from Kaiyang，Guizhou，with T-shape hyphal branching and high similarity of ITS sequence compared to references of R.solani from GenBank.All Guizhou isolates were clustered with AG-3.The EC 50 of tebuconazole of all 15 isolates was less than 0.003 mg/mL.Leaf spot diseases occurred in Kaiyang and other regions in Guizhou were identified as target spot，with Rhizoctonia solani as pathogen.Guizhou isolates were in AG-3，the same as most provinces in China.Tebuconazole had high effect on target spot，which was useful for further field study.

Key words Tobacco;Target spot;Rhizoctonia solani;Anatomosis group;Tebuconazole

靶斑病是一種由真菌立枯絲核外形菌（Rhizoctonia solani）引起的烤煙葉部病害。病原菌在適宜的條件下侵染烤煙葉片，形成具有不規(guī)則的壞死病斑，病斑直徑約5 cm，深褐色，具有輪紋狀結(jié)構(gòu)，部分病斑中心部分還會(huì)穿孔、脫落，如同被射穿的箭靶，因此該病得名“靶斑病”[1-2]。靶斑病于20世紀(jì)初在美國(guó)煙區(qū)被報(bào)道后[3]，給許多國(guó)家的烤煙生產(chǎn)均造成經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。2005年，遼寧煙區(qū)首次報(bào)道了我國(guó)靶斑病的發(fā)生，并完成了病原菌的系統(tǒng)鑒定[4]。我國(guó)的吉林、黑龍江[5]、云南[6]、湖南[7]和廣西[8]等煙區(qū)也接連報(bào)道了該種病害的發(fā)生。

立枯絲核菌目前被歸屬到擔(dān)子菌門（Basidiomycota），雞油菌目（Cantharellales），角擔(dān)菌科（Ceratobasidiaceae），比較典型的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)包括菌絲含褐色素，具有“T“型分枝結(jié)構(gòu)，尖端含有多個(gè)細(xì)胞核以及桶孔隔膜等[3]。立枯絲核菌的寄主范圍十分廣泛，涵蓋了多種茄科植物在內(nèi)的多種農(nóng)作物和雜草[4，9]，在烤煙生長(zhǎng)的各個(gè)時(shí)期都能夠進(jìn)行侵染，還能在烤煙苗期引起立枯病[10]。在氣候環(huán)境合適時(shí)，該菌可以有性生殖產(chǎn)生擔(dān)子和擔(dān)孢子，進(jìn)行病害的初侵染[2]。立枯絲核菌菌絲融合群（anastomosis group，AG）的劃分是將標(biāo)準(zhǔn)菌株與待測(cè)菌株在載玻片上對(duì)峙培養(yǎng)，通過顯微鏡觀察細(xì)胞壁的溶解與細(xì)胞質(zhì)的融合。后來，廣泛用于真菌種類鑒定的ITS分子標(biāo)記也被應(yīng)用于立枯絲核菌融合群的鑒定中[11]，得到的結(jié)果能夠與傳統(tǒng)鑒定方法匹配[3]。在我國(guó)，東北地區(qū)的吉林和黑龍江煙區(qū)[5]與西南地區(qū)的云南煙區(qū)[6]分離得到的立枯絲核菌的菌株屬于融合群AG-3，與美國(guó)煙區(qū)的主流類型相同[12]。而華南地區(qū)的廣西煙區(qū)[13]，立枯絲核菌屬于融合群AG-2-2和AG-4，具有獨(dú)特性[14]。

由于煙草靶斑病的烤煙抗病品種有限[15]，在恰當(dāng)?shù)霓r(nóng)業(yè)防治措施的基礎(chǔ)上[15]，化學(xué)防治是最為有效的方式[3，16]，我國(guó)的東北煙區(qū)也在近期開展了一些藥效試驗(yàn)[17-19] 。戊唑醇作為一種抑制真菌細(xì)胞膜甾醇類物質(zhì)合成的三唑類殺菌劑，具有良好地防控真菌性病害的效果，相關(guān)試驗(yàn)也證明該殺菌劑對(duì)赤星病等烤煙葉斑類病害有良好的防治效果[20]。煙草靶斑病在貴州省煙區(qū)近年來開始出現(xiàn)，且在部分煙田大規(guī)模暴發(fā)，目前，貴州煙區(qū)靶斑病病原菌方面的工作開展還不夠深入，貴州煙區(qū)立枯絲核菌的融合群種類也尚不清楚。筆者針對(duì)貴州煙區(qū)的煙草靶斑病進(jìn)行研究，旨在系統(tǒng)性鑒定病原菌的種類，梳理立枯絲核菌的融合群類型;初步篩選針對(duì)該病害的低毒殺菌劑種類，從而為貴陽煙區(qū)靶斑病的防控奠定基礎(chǔ)，也可以為全面掌握貴州省靶斑病的傳播和流行規(guī)律提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株分離純化與致病力測(cè)定

2020年8月中旬貴州煙區(qū)烤煙旺盛生長(zhǎng)中后期，于貴陽市開陽縣楠木渡鎮(zhèn)紅星村一塊靶斑病嚴(yán)重發(fā)生煙田進(jìn)行感病煙葉的收集采樣工作，收集到具有典型病斑的煙葉約20片。

將病斑邊緣帶有健康組織的部位剪取3～5 mm的小片，在75%的乙醇溶液中浸泡30 s，完成表面消毒之后用無菌紗布擦干葉片組織，然后放置到含40 g/L馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA，上海博微生物科技有限公司）的培養(yǎng)皿表面。在25 ℃、光照與黑暗交替12 h的條件下培養(yǎng)3 d。挑取帶有從葉片組織中生長(zhǎng)出來的菌絲尖端部分的培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移接種到另一個(gè)PDA培養(yǎng)皿上，在相同條件下培養(yǎng)3 d后再挑取接種一次尖端菌絲，完成菌株純培養(yǎng)。觀察純培養(yǎng)菌落的形態(tài)特征，并挑取菌絲進(jìn)行顯微鏡觀察，初步確定菌株的種類。

選取3個(gè)菌株的純培養(yǎng)接種到PDA培養(yǎng)皿上，在25 ℃、光照與黑暗交替12 h的條件下培養(yǎng)3 d后，用直徑8 mm的打孔器在菌落周邊幼嫩菌絲部位打取圓形培養(yǎng)基塊，接種到經(jīng)過表面消毒的烤煙幼苗葉片上。接種點(diǎn)覆蓋保鮮膜，并用浸濕無菌水的脫脂棉球保濕。每個(gè)菌株接種5次，并接種空白PDA培養(yǎng)基塊作為對(duì)照。接種后的煙苗在25 ℃、光照與黑暗交替12 h、相對(duì)濕度80%的條件下培養(yǎng)5 d，去掉保鮮膜和培養(yǎng)基塊。然后繼續(xù)在相同條件下培養(yǎng)，觀察產(chǎn)生病斑的形態(tài)，并利用前述表面消毒的方法分離病原菌。

1.2 DNA提取與ITS分子標(biāo)記測(cè)序 將剪成培養(yǎng)皿形狀和大小的生物半透膜（泰州中茂教育設(shè)備）經(jīng)過滅菌之后鋪展在PDA培養(yǎng)皿表面之后，挑取一塊帶菌株純培養(yǎng)的菌落到半透膜上，在25 ℃、光照與黑暗交替12 h的條件下培養(yǎng)5 d，進(jìn)行菌絲總DNA的提取。

用滅菌并冷卻的手術(shù)刀片刮去半透膜表面菌落周邊的幼嫩菌絲約100 mg到裝有1 mL裂解緩沖液的離心管中，根據(jù)Li等[21]的方法提取DNA。步驟：將含有幼嫩菌絲的裂解液渦旋振蕩20 s，然后在65 ℃下水浴20 min。水浴結(jié)束后離心，將上清液轉(zhuǎn)移到第2個(gè)離心管中，加入200 μL醋酸銨后在4 ℃冰箱中冷藏10 min。冷藏結(jié)束后再次離心，轉(zhuǎn)移上清液到第3個(gè)離心管中，加入等體積的異丙醇，充分搖晃混合，產(chǎn)生DNA沉淀。充分離心之后倒掉上清液，用無水乙醇沖洗DNA沉淀中脂溶性雜質(zhì)2次，倒掉所有上清液。用50 μL無菌去離子水溶解DNA沉淀，用于后續(xù)反應(yīng)。

用提取的總DNA為模板，利用真菌ITS分子標(biāo)記的通用引物ITS1和ITS4進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為25 μL，包含1 μL的DNA模板，1 μL 的上、下游引物（濃度均為10 μmol/L）與13 μL 的2×SanTaq PCR Master Mix（with Blue Dye，生工生物）。PCR反應(yīng)程序：94 ℃變性2 min;然后是30個(gè)循環(huán)，包括94 ℃反應(yīng)30 s，52 ℃反應(yīng)30 s，72 ℃反應(yīng)30 s;最后72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物由生工生物進(jìn)行雙向Sanger測(cè)序。

測(cè)序得到的序列由DnaSP6（Universitat de Barcelona）進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，然后利用NCBI的BLAST把2個(gè)方向的高質(zhì)量序列整合成該菌株的ITS序列。將各個(gè)菌株的ITS在NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對(duì)，確定菌株的種類。

1.3 菌株融合群的分子比較

根據(jù)國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展，從NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫中下載立枯絲核菌不同融合群的菌株ITS序列4條作為參考，詳細(xì)信息見表1。

利用MEGA7[22]軟件將整合得到的貴陽煙區(qū)的立枯絲核菌菌株的ITS序列與4條參考序列進(jìn)行比對(duì)分析。然后用Tamura-Nei模型[23]，將boostrap設(shè)定為1 000，構(gòu)建極大似然（ML）發(fā)育樹，比較貴陽煙區(qū)菌株的融合群歸屬。

1.4 戊唑醇的室內(nèi)毒力測(cè)定

選用低毒殺菌劑富力庫（拜耳作物科學(xué)中國(guó)有限公司），其中有效成分戊唑醇含量430 g/L，對(duì)貴陽煙區(qū)分離得到的立枯絲核菌菌株進(jìn)行室內(nèi)毒力測(cè)定試驗(yàn)。在配制PDA時(shí)，加入不同濃度的富力庫稀釋液，得到6種濃度梯度（0.100 0、0.030 0、0.010 0、0.003 0、0.001 0、0.000 3 mg/mL）的含戊唑醇的PDA培養(yǎng)皿。

用直徑8 mm的打孔器在貴陽煙區(qū)立枯絲核菌菌株純培養(yǎng)上打取含菌落的圓形培養(yǎng)基塊，分別接種到含6種濃度梯度戊唑醇的PDA培養(yǎng)皿上，同時(shí)接種不含戊唑醇的PDA培養(yǎng)皿作為對(duì)照。在25 ℃、光照與黑暗交替12 h的條件下培養(yǎng)5 d。通過直尺測(cè)量菌落的直徑，并扣除接種體圓形培養(yǎng)基塊的尺寸，得到該種濃度下菌絲生長(zhǎng)速率。每種濃度重復(fù)2次。再通過與對(duì)照培養(yǎng)基的生長(zhǎng)速率比較計(jì)算該種濃度的戊唑醇對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制率。將抑制率與該戊唑醇濃度的自然對(duì)數(shù)在Excel中進(jìn)行Probit回歸分析，計(jì)算出戊唑醇對(duì)該菌株的半致死率（EC 50）。

2 結(jié)果與分析

2.1 立枯絲核菌的鑒定

貴陽煙區(qū)收集到煙葉的癥狀見圖1，每個(gè)葉片表面具有若干壞死病斑。病斑接近圓形，直徑1.5～3.0 cm，壞死區(qū)域有明顯的“箭靶”狀輪紋，壞死區(qū)域有深褐色邊界，周圍有褪綠暈圈，一些病斑出現(xiàn)破洞穿孔。少部分病斑還能看見泛白的病原菌初侵染點(diǎn)。

經(jīng)過表面消毒，挑取菌株純培養(yǎng)的菌絲在顯微鏡下觀察，結(jié)果見圖2。菌株沒有明顯的孢子和產(chǎn)孢子結(jié)構(gòu)，菌絲有明顯隔膜。在部分菌絲的分支部位，能夠觀察到立枯絲核菌典型的“T”型分支結(jié)構(gòu)，即分支處菌絲出現(xiàn)縊縮，直接分支的部位沒有，但旁邊有隔膜。

接種過立枯絲核菌的煙苗在5 d去掉保鮮膜和培養(yǎng)基塊之后開始出現(xiàn)枯萎壞死癥狀。接種10 d后，壞死癥狀進(jìn)一步擴(kuò)大，且在初始接種培養(yǎng)基的部位出現(xiàn)輪紋狀病斑（圖3）。

通過測(cè)序質(zhì)量檢測(cè)與2個(gè)方向序列的整合，得到菌株約700 bp的ITS序列，通過與GenBank數(shù)據(jù)庫中參考序列比對(duì)，與立枯絲核菌的參考序列具有很高的相似性。

根據(jù)菌絲形態(tài)觀察和ITS分子標(biāo)記測(cè)序，共從貴陽煙區(qū)純化得到立枯絲核菌菌株15株，編號(hào)為7E、8C、8D、8E、8F、8G、12A、14C、15A、16A、19A、19B、19D、20A和20C。

2.2 立枯絲核菌的融合群劃分

將15株貴陽煙區(qū)菌株的ITS序列與4條立枯絲核菌的參考序列構(gòu)建的極大似然系統(tǒng)發(fā)育樹見圖4。15個(gè)菌株的ITS序列都與來自融合群AG-3的菌株MZ-2的序列聚集在一起。他們同融合群AG-2-2的MIAE01336a與ZS11-7，以及AG-4的LC11-10這3個(gè)參考菌株的ITS序列均存在較大的分歧。

2.3 戊唑醇的室內(nèi)毒力測(cè)定

6個(gè)濃度梯度的戊唑醇對(duì)貴陽煙區(qū)立枯絲核菌菌株室內(nèi)毒力測(cè)定結(jié)果表明，15個(gè)菌株的半致死率（EC 50）的分布范圍見圖5。10個(gè)菌株的EC 50小于測(cè)試的最低濃度0.000 3 mg/mL。另外有3個(gè)菌株的EC 50為0000 3～0.001 0 mg/mL，2個(gè)菌株為<0.001 0～0.003 0 mg/mL。

3 討論

該研究通過田間葉部壞死癥狀的形態(tài)觀察、菌株的分離純化與“T”型分枝結(jié)構(gòu)觀察，以及ITS分子標(biāo)記序列測(cè)定與比對(duì)，將貴陽煙區(qū)葉部分離得到的菌株確定為靶斑病的病原菌立枯絲核菌，并經(jīng)過回接試驗(yàn)驗(yàn)證了科赫法則。靶斑病引起的葉部病斑具有輪紋狀結(jié)構(gòu)，類似的結(jié)構(gòu)在赤星病等真菌性葉斑病的晚期癥狀中也有發(fā)生[3]。通過對(duì)幾種烤煙真菌性葉斑病癥狀的比較，Shew等[1]發(fā)現(xiàn)靶斑病的病斑中間具有一個(gè)灰白色的圓形區(qū)域，判斷其應(yīng)該是對(duì)應(yīng)于病原菌最初侵染的部位，該侵染斑點(diǎn)在病斑發(fā)展到面積較大時(shí)仍然存在。該研究中，從貴陽煙區(qū)收集得到的靶斑病病葉也具有這些特征，可以作為與赤星病等其他葉斑病區(qū)分的標(biāo)志。

靶斑病在高濕度的環(huán)境情況下，流行與傳播較快[4]。20世紀(jì)80年代中期，美國(guó)東部煙區(qū)的靶斑病大暴發(fā)，與前一年夏天的極端暴雨天氣存在密切關(guān)系[9]。我國(guó)遼寧煙區(qū)在靶斑病的首次報(bào)道中，也有烤煙生長(zhǎng)季節(jié)降水偏多，煙田相對(duì)濕度較高的描述[4]。云南煙區(qū)開展的試驗(yàn)表明，空氣的相對(duì)濕度達(dá)100%的情況下，立枯絲核菌的擔(dān)孢子可以很快地完成侵染烤煙葉片的過程[24]。在貴陽煙區(qū)，也有連續(xù)2年6月暴雨，同田間靶斑病的發(fā)生也存在對(duì)應(yīng)關(guān)系。因此，在烤煙種植區(qū)遭遇極端天氣，尤其是引起田間相對(duì)濕度顯著增加的特大暴雨之后，及時(shí)開展防控措施對(duì)于阻斷靶斑病的流行與傳播非常重要。

菌絲融合群與靶斑病的病原菌立枯絲核菌的遺傳物質(zhì)交換有重要關(guān)系，是這種類型的真菌多樣性分化的重要指標(biāo)。該研究使用ITS分子標(biāo)記的方法[3]，鑒定從貴陽煙區(qū)分離得到的15株立枯絲核菌菌株的融合群。序列系統(tǒng)發(fā)育樹表明，15個(gè)菌株全部屬于融合群AG-3，是國(guó)內(nèi)外分布最為廣泛的引起靶斑病的融合群[12]。此外，該融合群也在我國(guó)的吉林、黑龍江[5]和云南煙區(qū)[6]被分離得到，因此可以表明融合群AG-3在我國(guó)煙區(qū)具備大范圍分布的特征，是我國(guó)立枯絲核菌的優(yōu)勢(shì)融合群。陳媛媛等[13]從同貴州毗鄰的廣西煙區(qū)分離得到立枯絲核菌屬于融合群AG-2-2和AG-4，同該研究中的菌株存在明顯的分化，融合群類型具有很大的獨(dú)特性，所以兩?。▍^(qū)）交界處的烤煙種植區(qū)是后續(xù)開展融合群多樣性研究的重點(diǎn)區(qū)域。

國(guó)外煙區(qū)靶斑病的發(fā)生歷史長(zhǎng)，開展的病害防控的研究也多，積累了一些經(jīng)驗(yàn)[10]。我國(guó)煙區(qū)出現(xiàn)靶斑病之后，東北煙區(qū)也進(jìn)行了許多低毒殺菌劑藥效試驗(yàn)。伏穎等[17]選用10種殺菌劑進(jìn)行立枯絲核菌的室內(nèi)毒力測(cè)定，結(jié)果表明三唑類殺菌劑烯唑醇的抑菌效果最好。劉斯泓等[18]研究表明，50% 腐霉利·惡霉靈800 倍液對(duì)靶斑病相對(duì)防效達(dá)60%;王潮鐘等[19]開展了2次施用苯醚甲環(huán)唑·丙環(huán)唑和20%噻氟酰胺的靶斑病防控試驗(yàn)，2次施藥間隔7 d能達(dá)70%以上的相對(duì)防效，以上藥劑均屬于三唑類殺菌劑。三唑類殺菌劑的主要靶標(biāo)是真菌細(xì)胞膜中甾醇類物質(zhì)的合成途徑，因此具有很好的防治效果。該試驗(yàn)選用的戊唑醇，經(jīng)過室內(nèi)毒力測(cè)定，對(duì)于貴陽煙區(qū)分離得到的15個(gè)立枯絲核菌菌株均有良好的抑制效果，半致死率（EC 50）全部小于0.003 0 mg/mL，是后續(xù)田間藥效測(cè)試的一個(gè)重要候選殺菌劑。所以，可以對(duì)戊唑醇進(jìn)行后續(xù)的大田防治試驗(yàn)，將利用戊唑醇防控靶斑病納入烤煙葉斑類病害統(tǒng)防統(tǒng)治體系中，進(jìn)一步支撐貴州煙區(qū)烤煙病害綠色防控技術(shù)研究。

4 結(jié)論

根據(jù)癥狀分析、菌絲形態(tài)觀察、ITS分子標(biāo)記測(cè)序和回接毒力測(cè)定，貴陽煙區(qū)近年暴發(fā)的葉部病害為靶斑病，病原菌為立枯絲核菌。從貴陽煙區(qū)純化得到立枯絲核菌菌株15株，根據(jù)ITS序列分析，全部屬于立枯絲核菌融合群AG-3。戊唑醇對(duì)于貴陽煙區(qū)菌株具有很好的抑制效果，可以用于開展后續(xù)大田防治試驗(yàn)。

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