閩東野生金線蓮無(wú)菌體系建立與優(yōu)化研究

施滿容 羅義發(fā)

摘要 [目的]研究閩東野生金線蓮無(wú)菌體系建立的最佳培養(yǎng)基配方。[方法]以閩東野生金線蓮莖段為試材，通過正交試驗(yàn)得到無(wú)菌的誘導(dǎo)芽體，通過萌發(fā)的芽體增殖建立金線蓮的無(wú)菌培養(yǎng)體系，篩選出閩東野生金線蓮快繁的最佳培養(yǎng)基配方。[結(jié)果]閩東野生金線蓮莖段誘導(dǎo)芽體萌發(fā)最適培養(yǎng)基配方為MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+KT 1.5 mg/L，與其他配方之間具有極顯著差異;芽繼代增殖培養(yǎng)基配方為MS+ 6-BA 2.0 mg/L+ NAA 0.2 mg/L+KT 1.0 mg/L，且與其他處理間差異極顯著。[結(jié)論]誘導(dǎo)芽時(shí)應(yīng)適當(dāng)提高一定范圍內(nèi)細(xì)胞分裂素類濃度;芽增殖時(shí)應(yīng)適當(dāng)降低細(xì)胞分裂素濃度，細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素比值為10倍時(shí)有利于芽增殖生長(zhǎng)。

關(guān)鍵詞 野生金線蓮;無(wú)菌體系;閩東

中圖分類號(hào) S567.23? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A? 文章編號(hào) 0517-6611（2022）07-0096-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.07.022

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Study on the Establishment and Optimization of the Sterile System of Wild Aoectochilus roxburghii from Eastern Fujian Province

SHI Man-rong， LUO Yi-fa

（Ningde Vocational College， Fuan， Fujian 355000）

Abstract [Objective] To select the most suitable formula for the cultivation of bud inductions for Aoectochilus formosanus from eastern Fujian Province. [Method]The orthogonal experiment utilized the stem of wild Aoectochilus formosanus from eastern Fujian Province as object to obtain sterile bud inductions， which composed the sterile cultivating system through multiplying and figured out the formula of Aoectochilus formosanus that facilitated its generation. [Result]The most suitable formula for the cultivation of bud inductions for Aoectochilus formosanus from eastern Fujian Province was MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+KT 1.5 mg/L，which was significantly different from other treatments;multiplying formula for the subculture of the succession was MS+ 6-BA 2.0 mg/L+ NAA 0.2 mg/L+KT 1.0 mg/L， which was significantly different from other treatments. [Conclusion] Concentration of cytokinins was expected to be raised in certain range during bud inductions;concentration of cytokinins need to be deduced in bud cultivation， and the bud tend to multiply when cytokinins was 10 times higher than auxin.

Key words Wild Aoectochilus formosanus;Sterile system;Eastern Fujian Province

金線蓮是蘭科開唇蘭屬多年生草本植物，具有藥用、保健和觀賞多重價(jià)值。金線蓮喜陰涼、潮濕的環(huán)境，要求溫度20～25 ℃，忌陽(yáng)光直射，主要生長(zhǎng)在常綠闊葉林、毛竹林、竹闊混生林下的溝邊、石壁、土質(zhì)疏松的潮濕地帶。由于金線蓮種子沒有胚乳，只有在真菌共生下，才能促進(jìn)種子萌發(fā)，因此發(fā)芽率很低，難以滿足市場(chǎng)需求，組織培養(yǎng)已成為主要繁殖手段。

目前國(guó)內(nèi)許多學(xué)者從多個(gè)方面對(duì)金線蓮組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行了研究，郝麗麗等[1]以金線蓮莖尖外植體誘導(dǎo)的腋芽為試材，探討6-芐氨基嘌呤（6-BA）、萘乙酸（NAA）、玉米素（ZT）和激動(dòng)素（KT）對(duì)金線蓮腋芽增殖的影響;黃勇[2]以滇越金線蓮和花葉開唇蘭2個(gè)金線蓮品種果實(shí)為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)，建立并優(yōu)化了金線蓮組織培養(yǎng)體系;黃碧華[3]以優(yōu)良觀賞金線蓮莖段、莖尖、葉片為試材，研究其再生植株在不同外源激素配比下的適宜培養(yǎng)基;劉偉等[4]以金線蓮組培苗的莖段和頂芽為外植體進(jìn)行增殖培養(yǎng)，比較不同基本培養(yǎng)基、細(xì)胞分裂素、生長(zhǎng)素、添加物等因素對(duì)金線蓮生長(zhǎng)狀況的影響，篩選最佳增殖培養(yǎng)基;劉潤(rùn)東等[5]以福建羅源縣野生金線蓮為外植體，進(jìn)行芽叢誘導(dǎo)、繼代培養(yǎng)、芽分化和根誘導(dǎo)試驗(yàn)，結(jié)果表明，MS基本培養(yǎng)基中附加6-BA 1.0 mg/L、NAA 0.1 mg/L和ZT 0.02 mg/L，芽叢的誘導(dǎo)率最高可達(dá)9592%;王雅英等[6]以試管苗帶節(jié)莖段和頂芽為外植體，用正交試驗(yàn)篩選芽快速增殖的培養(yǎng)基配方;黃淑燕等[7]以福建永安、廣西玉林、臺(tái)灣南投不同產(chǎn)地金線蓮幼嫩莖段為外植體誘導(dǎo)叢生芽，通過不同培養(yǎng)基配方的篩選，建立不同產(chǎn)地金線蓮組培快繁體系;何碧珠等[8]以福建省福州市及三明市金線蓮莖段為試驗(yàn)材料，誘導(dǎo)愈傷組織和原球莖，建立金線蓮的無(wú)菌培養(yǎng)體系;楊紅麗等[9]以云南金線蓮莖段為外植體，研究不同的消毒方法和激素水平對(duì)組織培養(yǎng)的影響，篩選出合適的培養(yǎng)基配方;陸素君[10]以廣西野生金線蓮莖段為材料進(jìn)行研究試驗(yàn);汪佳秀等[11]以江西野生金線蓮莖段為外植體，分析莖段不同位置、培養(yǎng)基、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑和添加物對(duì)不定芽增殖和幼苗生長(zhǎng)的影響，建立金線蓮無(wú)菌繁殖體系。目前，有關(guān)福建閩東野生金線蓮組培快繁體系建立的研究仍較少。筆者以閩東野生金線蓮莖段為外植體，采用6-BA、NAA、KT 3因素3水平正交試驗(yàn)篩選最佳芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方，通過不同激素配比研究對(duì)其芽增殖的影響，從而建立無(wú)菌快繁體系，旨在為加快閩東金線蓮快繁產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以從福建省福安市社口鎮(zhèn)采集的野生金線蓮植株莖段為外植體材料。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外植體的處理。將金線蓮植株用自來水沖洗干凈后去除根、葉，在超凈工作臺(tái)上先用75%乙醇浸泡30 s，再用01% HgCl加1滴吐溫消毒液浸泡10 min，無(wú)菌水沖洗3～5遍至無(wú)泡沫。用消毒濾紙吸干表面水分，切除傷口部分約05 cm，再切成帶有1節(jié)1芽約1.0 cm的莖段，平放接種到不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，進(jìn)行芽叢誘導(dǎo)。

1.2.2 芽誘導(dǎo)。以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，進(jìn)行3因素3水平正交試驗(yàn)L 9（34）設(shè)計(jì)（表1），3次重復(fù)。每處理接種10瓶，每瓶接種3個(gè)莖段，各處理培養(yǎng)基均加入蔗糖30 g/L，瓊脂7 g/L，香蕉汁100 g/L，pH調(diào)至5.8～6.0，培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)芽體誘導(dǎo)率（誘導(dǎo)率=誘導(dǎo)芽的外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100%）。根據(jù)結(jié)果篩選最佳芽誘導(dǎo)培養(yǎng)方案。培養(yǎng)室溫度（25±2） ℃，光照強(qiáng)度1 500～2 000 lx，光照時(shí)間12 h/d。

1.2.3 繼代增殖培養(yǎng)。以最佳培養(yǎng)方案進(jìn)行誘導(dǎo)所得的芽體作為中間繁殖體，轉(zhuǎn)接到不同增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每瓶接種3個(gè)芽體，每種培養(yǎng)基接種10瓶，重復(fù)3次。各處理培養(yǎng)基均加入蔗糖30 g/L，瓊脂7 g/L，香蕉汁100 g/L，pH調(diào)至5.8～6.0。接種后置于培養(yǎng)室中進(jìn)行增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)30 d后，觀察外植體芽體增殖情況及長(zhǎng)勢(shì)，確定最佳增殖培養(yǎng)方案。增殖倍數(shù)=總芽數(shù)/接種數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用SPSS 22.0數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比對(duì)芽誘導(dǎo)的影響

金線蓮無(wú)菌莖段經(jīng)30 d培養(yǎng)后，統(tǒng)計(jì)萌芽數(shù)和誘導(dǎo)率情況，結(jié)果見表2。由表2可知，9種培養(yǎng)基均能誘導(dǎo)金線蓮?fù)庵搀w，其中處理⑤誘導(dǎo)率最高，達(dá)96.7%;處理⑦芽誘導(dǎo)率最低，僅600%。試驗(yàn)結(jié)果表明：

2.0、3.0、4.0 mg/L 6-BA濃度配比下的誘導(dǎo)率分別為78.9%、84.4%、63.3%，說明芽誘導(dǎo)率隨著6-BA濃度的升高先增大后下降，6-BA濃度太高反而不利于芽誘導(dǎo)。1.5、1.0、0.5 mg/L KT濃度配比的誘導(dǎo)率分別為78.9%、75.6%、72.2%，說明芽誘導(dǎo)率隨著KT濃度的升高而增大。0.1、0.2、0.3 mg/L NAA濃度配比下的誘導(dǎo)率分別為67.8%、82.2%、76.7%，說明芽誘導(dǎo)率隨著NAA濃度的升高先增大后下降。試驗(yàn)結(jié)果表明芽誘導(dǎo)最佳配方是MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+KT 1.5 mg/L。SPSS數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明，處理⑤與其他8個(gè)處理差異達(dá)到極顯著水平。表2結(jié)果表明，3種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)芽誘導(dǎo)培養(yǎng)影響表現(xiàn)為6-BA>NAA>KT。

2.2 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比對(duì)芽體增殖的影響

金線蓮腋芽接種10 d后，基部腋芽開始突出并明顯增長(zhǎng)，30 d后出現(xiàn)大小各異、數(shù)目不等的增殖腋芽，繼代增殖結(jié)果見表3。由表3可知，金線蓮腋芽增殖培養(yǎng)最佳培養(yǎng)基為MS+ 6-BA 20 mg/L+NAA 0.2 mg/L+KT 1.0 mg/L，獲得芽數(shù)最多為33個(gè)，增殖系數(shù)最大，為3.3。SPSS數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明，處理①與各組之間差異極顯著。

試驗(yàn)結(jié)果表明，在不同配比的培養(yǎng)基組合中，當(dāng)NAA、KT濃度相同時(shí)，較低濃度6-BA對(duì)芽體的增殖起促進(jìn)作用，隨著6-BA濃度上升，增殖系數(shù)反而下降。說明培養(yǎng)基中NAA、KT濃度不變時(shí)，只有適量的6-BA濃度才能達(dá)到最佳增殖效果。當(dāng)6-BA濃度保持不變，只變化NAA濃度時(shí)，處理1、處理5、處理8增殖倍數(shù)相對(duì)高于另外2組，說明6-BA與NAA比值大約控制在10倍左右，增殖效果最好。芽體增殖后不轉(zhuǎn)移繼續(xù)培養(yǎng)可以長(zhǎng)出不定根，直接成苗。

3 討論與小結(jié)

在金線蓮培養(yǎng)過程中，影響腋芽誘導(dǎo)和增殖的一個(gè)關(guān)鍵因素是培養(yǎng)基中激素濃度的配比。6-BA、NAA和KT是組織培養(yǎng)快速繁殖的3種常用生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，其使用濃度對(duì)芽誘導(dǎo)和增殖的影響很大。劉潤(rùn)東等[5]對(duì)福建省羅源縣采集的野生金線蓮研究結(jié)果表明，激素組合6-BA 1.0 mg/L和NAA 0.1 mg/L能誘導(dǎo)芽叢的發(fā)生，隨著6-BA和NAA濃度的升高則不利于芽叢的誘導(dǎo);當(dāng)6-BA濃度最高為5.0 mg/L、NAA為0.5 mg/L時(shí)，誘導(dǎo)材料幾乎全部壞死。何碧珠等[8]研究表明，福建省福州市及三明市金線蓮莖段出芽率隨著6-BA濃度的升高先增大后減小，說明莖段誘導(dǎo)芽體的培養(yǎng)基中6-BA的濃度不宜過高。黃淑燕等[7]研究表明，6-BA濃度對(duì)不同產(chǎn)地金線蓮作用效果不同，福建永安金線蓮對(duì)6-BA的濃度要求低，而廣西玉林金線蓮對(duì)6-BA濃度要求最高。該研究表明，當(dāng)6-BA增加到4.0 mg/L時(shí)誘導(dǎo)率均下降，與以上學(xué)者的研究基本一致。通過正交試驗(yàn)篩選出金線蓮腋芽誘導(dǎo)的最適培養(yǎng)基為MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+KT 1.5 mg/L，培養(yǎng)30 d后芽誘導(dǎo)率達(dá)到96.7%。正交試驗(yàn)中3種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)芽誘導(dǎo)的影響表現(xiàn)為6-BA>NAA>KT，這與王雅英等[6]的研究結(jié)果一致。

植物組織培養(yǎng)過程中，以芽繁芽的途徑來增殖，遺傳性穩(wěn)定，是最廣泛應(yīng)用的途徑之一。該試驗(yàn)篩選出最佳增殖培養(yǎng)基配方是MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+KT 1.0 mg/L，經(jīng)30 d培養(yǎng)增殖系數(shù)達(dá)到3.3。當(dāng)保持NAA 0.2 mg/L不變，6-BA增加到3.0 mg/L時(shí)，6-BA/NAA達(dá)到15倍時(shí)增殖系數(shù)為2.6，6-BA增加到4.0 mg/L，6-BA/NAA達(dá)到20倍時(shí)，增殖倍數(shù)僅為1.6。當(dāng)NAA 0.3 mg/L時(shí)，表現(xiàn)為隨著6-BA濃度升高增殖系數(shù)下降;當(dāng)NAA 0.5 mg/L時(shí)，則表現(xiàn)為隨著6-BA濃度升高增殖倍數(shù)下降，說明6-BA/NAA比值高不利芽增殖生長(zhǎng)，這可能與金線蓮芽體對(duì)6-BA有一定的忍耐力有關(guān)，在初代培養(yǎng)中芽體中已經(jīng)積累了一定濃度6-BA，增殖培養(yǎng)時(shí)6-BA濃度高反而抑制芽的再分化增殖生長(zhǎng)。說明培養(yǎng)基中NAA、KT濃度不變，6-BA濃度過高反而達(dá)不到理想的效果，只有適量才能達(dá)到最佳增殖效果。這與黃淑燕等[7]的研究結(jié)果基本一致，但與何碧珠等[8]的研究結(jié)果（NAA濃度一定時(shí)芽體的增殖速度隨著6-BA濃度的升高先增加后下降）不一致，這可能與金線蓮產(chǎn)地、培養(yǎng)條件等有關(guān)。

在組織培養(yǎng)中，生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素的比例決定器官分化，即脫分化時(shí)生長(zhǎng)素低，細(xì)胞分裂素高;再分化時(shí)生長(zhǎng)素高，細(xì)胞分裂低素。該研究結(jié)果表明，閩東野生金線蓮莖段脫分化誘導(dǎo)芽時(shí)，適當(dāng)提高細(xì)胞分裂素濃度有利于芽誘導(dǎo);芽增殖時(shí)應(yīng)適當(dāng)降低細(xì)胞分裂素濃度，當(dāng)細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素比值為10倍時(shí)，有利于芽增殖生長(zhǎng)。

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