菌絲霉素抗菌肽高密度發(fā)酵生產(chǎn)及其特性研究

宋士良 陸克文

摘要 [目的]開發(fā)菌絲霉素抗菌肽，以替代抗生素在飼料生產(chǎn)中添加使用。[方法]以高產(chǎn)菌絲霉素畢赤酵母基因工程菌PPle-BC01為供試菌株，在15 L實(shí)驗(yàn)室發(fā)酵罐優(yōu)化發(fā)酵工藝的基礎(chǔ)上，通過50 L、5 t、60 t發(fā)酵罐高密度發(fā)酵工藝進(jìn)一步優(yōu)化放大試驗(yàn)，實(shí)現(xiàn)了60 t罐規(guī)模的穩(wěn)定生產(chǎn)。經(jīng)層析柱分離、純化，得到相對(duì)純度≥90%的純品。純品水解后的游離氨基酸樣品，經(jīng)PITC衍生化處理后，再經(jīng)過HPLC檢測(cè)及氨基酸組成摩爾百分比計(jì)算與氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)，分析其氨基酸組成。純品經(jīng)多肽蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量分析測(cè)試，測(cè)得plectasin單同位素相對(duì)分子量。純品經(jīng)蛋白濃度、抗菌效價(jià)測(cè)定、比活計(jì)算以及產(chǎn)品抗菌效價(jià)測(cè)定，獲得產(chǎn)品中plectasin含量，同時(shí)測(cè)試了解其產(chǎn)品特性。[結(jié)果]60 t發(fā)酵罐穩(wěn)定3批次試生產(chǎn)發(fā)酵液菌體濕重峰值分別為43.34%、43.78%和43.78%，抗菌效價(jià)峰值分別為10 566.99、10 986.45和10 788.56 U/mL;噴霧干燥產(chǎn)品收率分別為12.19%、12.30%和12.50%，抗菌效價(jià)分別為100 672.10、103 561.20和99 765.50 U/g。3批次試生產(chǎn)產(chǎn)品中plectasin含量分別為2.26%、2.32%和2.24%。純品經(jīng)檢測(cè)符合plectasin由40個(gè)氨基酸組成的多肽的理論氨基酸殘基個(gè)數(shù)值，分子量為4.440 7 kD。產(chǎn)品在95 ℃溫度以下具有良好的熱穩(wěn)定性;pH? 3.0～9.0具有良好的酸堿穩(wěn)定性;在0.03%～0.30%豬膽鹽濃度具有較好的膽鹽耐受性;對(duì)胃蛋白酶、胰蛋白酶和蛋白酶K均具有良好的抗降解性。[結(jié)論]發(fā)酵終產(chǎn)品收率達(dá)10%，產(chǎn)品抗菌效價(jià)達(dá)8萬U/g以上，產(chǎn)品中plectasin含量達(dá)2%以上，實(shí)現(xiàn)了60 t罐規(guī)模的產(chǎn)業(yè)化穩(wěn)定生產(chǎn)。

關(guān)鍵詞 菌絲霉素抗菌肽;高密度發(fā)酵工藝;菌絲霉素含量檢測(cè);產(chǎn)品特性

中圖分類號(hào) Q939.92? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A? 文章編號(hào) 0517-6611（2022）07-0078-10

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.07.019

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Study on High-density Fermentation Production and Characteristics of Plectasin Antimicrobial Peptide

SONG Shi-liang，LU Ke-wen

（Shanghai Bornsun Bioengineering Co.，Ltd.， Shanghai 201506）

Abstract [Objective]To develop plectasin antimicrobial peplide to replace antibiotics in feed production.[Method]In this study， a high-yield plectasin-producing Pichia pastoris strain PPle-BC01 was used as the experimental strain，the steady production of 60-ton fermenters were realized by the scale-up experiments of high-density fermentation process in 50 L ，5 t and 60 t fermentor that based on the optimization of fermentation process in 15-liter fermentor.The purified sample of plectasin with relative purity above 90% was obtained by chromatographic column separation and purification.The amino acid composition of the purified sample were analyzed by HPLC determination，calculation of molar percentage of amino acid composition and comparison with reference standards for amino acid mixtures after it’s hydrolyzed free amino acid sample and reference standards for amino acid mixtures were derivatized by PITC.The single-isotope relative molecular weight of plectasin was measured by the relative molecular mass analysis of polypeptide proteins.The content of plectasin in spray-dried products were obtained by determining the concentration， antibacterial titer of pure protein and the antibacterial titer of spray-dried products.The characteristics of spray-dried products were known through the property test.[Result]Peak values of wet weight and antibacterial titer of fermentation broths were 4334%，43.78%，4378% and 10 566.99，10 986.45，10 788.56 U/mL，the yield and antibacterial titer of spray-dried products were 1219%，1230%，12.50% and 100 672.10，103 561.20，99 765.50 U/g ，the content of plectasin in spray-dried products were 2.26%，232% and 224%， respectively in stable three batchs trial production of 60-ton fermentors.The purified sample was determined to be composed of 40 amino acids and the molecular weight was 4.440 7 kD.The spray-dried product had good thermal stability under 95 ℃， had good acid-base stability in the pH 3.0-9.0 range，had good tolerance at the salt concentration of 0.03%-0.30% in pig bile，had good anti-degradability to pepsin， trypsin and proteinase K.[Conclusion]The yield of the final spray-dried products reached 10%，the antibacterial titer was over 80 000 U/g，the content of plectasin in spray-dried products was more than 2%.The industrial and stable production of 60-ton fermenters was realized.

Abstract Plectasin antimicrobial peptide;High-density fermentation process;Determination of plectasin content;Product characteristics

2019年7月10日，《農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第194號(hào)》指出，2020年7月1日起，除中草藥外，飼糧中禁用其他促生長類藥物飼料添加劑。因此，開發(fā)替代抗生素的綠色、生態(tài)、安全、高效的新型飼料添加劑是我國畜禽養(yǎng)殖業(yè)的熱點(diǎn)及重點(diǎn)。益生菌、中草藥、多糖、抗菌肽等無抗藥性、無殘留、毒副作用小，具有良好的市場(chǎng)開發(fā)及應(yīng)用前景，是高效、綠色環(huán)保型飼料添加劑[1]?？咕模╝ntimicrobial peptide，AMPs）是由12～50個(gè)氨基酸組成的小生物分子肽，是先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分，具有分子量小、易溶于水、耐熱性、抗菌譜廣和不易產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn)[2];還具有一定的免疫學(xué)活力[3]。因此，開發(fā)利用抗菌肽取代傳統(tǒng)抗生素，對(duì)提高畜產(chǎn)品品質(zhì)、推動(dòng)綠色畜牧業(yè)的發(fā)展、保障食品安全具有重要意義。目前獲得抗菌肽的方式主要有從生物體內(nèi)直接分離提純有生物活性的抗菌肽，再對(duì)其結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行研究。這種方法比較煩瑣，且得到的抗菌肽含量普遍很低，不適合規(guī)?；a(chǎn)。人工合成抗菌肽。根據(jù)已知的抗菌肽基因序列，用化學(xué)方法合成抗菌肽。這種方法成本高，不適于普及應(yīng)用。酶解法。主要是通過將有抗菌活性的蛋白用特定的蛋白酶切割下其有抗菌活性的部分進(jìn)行純化，繼而得到抗菌肽。這種方法得到的抗菌肽活性較高，但產(chǎn)量低，成本高。利用基因工程菌生產(chǎn)抗菌肽，可以在一定程度上解決這些困難，通過這種方法得到的抗菌肽目的性強(qiáng)，技術(shù)上有提高產(chǎn)量的空間，成本低，應(yīng)用廣，是生產(chǎn)抗菌肽的一條理想途徑[4]。目前用于基因工程的異源表達(dá)系統(tǒng)在生產(chǎn)不同大小、折疊和復(fù)雜性的異源抗菌肽方面取得了很大的進(jìn)步，抗菌肽生產(chǎn)的主要表達(dá)系統(tǒng)是細(xì)菌和酵母表達(dá)系統(tǒng)。畢赤酵母是酵母表達(dá)系統(tǒng)中應(yīng)用最廣泛的表達(dá)系統(tǒng)[4]。喬瑩等[5]通過Eco31 I限制性內(nèi)切酶定向連接方法合成大黃魚與美國紅魚抗菌肽Piscidin串聯(lián)基因，以畢赤酵母的穿梭表達(dá)載體pPICZαA構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZαA-PSP，轉(zhuǎn)化入畢赤酵母SMD1168菌株中，實(shí)現(xiàn)了PSP重組串聯(lián)肽的誘導(dǎo)表達(dá)和純化，初步鑒定Piscidin抗菌肽對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和愛德華氏菌等均有抑制生長的活性。鄧贛奇等[6]將優(yōu)化的目的蛋白堿基序列與標(biāo)簽MBP基因序列融合，通過雙酶切將重組基因序列插入到畢赤酵母pGAPZaA表達(dá)載體上并進(jìn)行連接反應(yīng)，成功獲得一種能分泌菌絲霉素的畢赤酵母，對(duì)其分泌蛋白進(jìn)行Western blot檢測(cè)、純化、活性分析和質(zhì)譜鑒定，得到的重組蛋白為55 ku左右，濃度為700 mg/L，純度達(dá)80%以上，質(zhì)譜鑒定結(jié)果表明，蛋白序列的覆蓋率達(dá)98%，純化后的蛋白對(duì)金黃色葡萄球菌具有抑制作用。到該研究實(shí)施前為止，重組菌絲霉素抗菌肽尚處于研發(fā)階段，國內(nèi)尚未見產(chǎn)業(yè)化報(bào)道。通過畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)抗菌肽是一種有效的生產(chǎn)方法，相對(duì)于細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)抗菌肽，表現(xiàn)出更多的優(yōu)勢(shì)。因此，開展重組菌絲霉素基因工程抗菌肽產(chǎn)業(yè)化研發(fā)具有現(xiàn)實(shí)意義。該研究通過高產(chǎn)菌絲霉素畢赤酵母基因工程菌高密度發(fā)酵工藝優(yōu)化及其特性研究，完成菌絲霉素抗菌肽工藝放大試生產(chǎn)、產(chǎn)品試制、試運(yùn)行，成果轉(zhuǎn)化達(dá)到產(chǎn)業(yè)化目標(biāo)。如何提高基因工程菌絲霉素抗菌肽菌株發(fā)酵生物表達(dá)量，提高生產(chǎn)效率、降低成本，實(shí)現(xiàn)廉價(jià)、規(guī)?；a(chǎn)，已成為目前抗菌肽研究開發(fā)產(chǎn)業(yè)化過程中，亟待需要解決的關(guān)鍵問題。筆者通過補(bǔ)料高密度發(fā)酵工藝優(yōu)化試驗(yàn)，并完成菌絲霉素結(jié)構(gòu)、分子量及產(chǎn)品中菌絲霉素成分含量檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)室15 L發(fā)酵罐基礎(chǔ)上發(fā)酵菌體鮮生物量提高到400 g/L、抗菌效價(jià)表達(dá)量提高到8 000 U/mL以上，使發(fā)酵終產(chǎn)品收率達(dá)10%、產(chǎn)品抗菌效價(jià)達(dá)8萬U/g、產(chǎn)品中菌絲霉素含量達(dá)2%以上，實(shí)現(xiàn)60 t罐規(guī)模的產(chǎn)業(yè)化穩(wěn)定生產(chǎn)的要求。該產(chǎn)業(yè)化成果，經(jīng)上?？茖W(xué)技術(shù)情報(bào)研究所科技查新，國內(nèi)外未見有同類研究。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地點(diǎn)

試驗(yàn)于2017年1月—2018年12月在上海邦成生物工程有限公司微生物及發(fā)酵研究所發(fā)酵實(shí)驗(yàn)室及發(fā)酵中試、生產(chǎn)車間進(jìn)行。

1.2 主要儀器

超低溫冷凍柜（DW-86L338J，青島海爾特種電器有限公司）;生物顯微鏡（XSP-BM-2CA，上海彼愛姆光學(xué)儀器制造有限公司）;超凈工作臺(tái)（YJ-1340，蘇州蘇信環(huán)境科技有限公司）;隔水式恒溫培養(yǎng)箱（GHF-9270，上海一恒科學(xué)儀器有限公司）;立式壓力蒸汽滅菌器（YXQ-50SⅡ，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司）;冷凍干燥機(jī)（TF-FD-1，上海田楓實(shí)業(yè)有限公司）;分析天平（Sartorius SQP，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司）;pH計(jì)（PHS-3C，上海雷磁儀器有限公司）;電導(dǎo)率儀（DDS-307，上海雷磁儀器有限公司）;恒溫?fù)u床（TS-211C，常州冠軍儀器制造有限公司）;紫外分光光度計(jì)（752N，上海儀電分析儀器有限公司）;實(shí)驗(yàn)室噴霧干燥機(jī)（WPG-1500，常州市永昌制粒干燥設(shè)備有限公司）;水分測(cè)定儀（SYF-6D，深圳冠亞水分儀科技有限公司）;低速臺(tái)式離心機(jī)（TDL-5-A，上海安亭科學(xué)儀器廠）;高速臺(tái)式離心機(jī)（TCL-18G-C，上海安亭科學(xué)儀器廠）;核酸蛋白檢測(cè)儀（HD-21-88，上海琪特分析儀器有限公司）;酶標(biāo)儀（Multiskan MK3，賽默飛世爾（上海）儀器有限公司）;電熱恒溫水浴鍋（HWS28，上海一恒科學(xué)儀器有限公司）;高效液相色譜儀（LC-20AT，日本島津公司）;質(zhì)譜儀（AB Sciex 5800 MALDI-TOF/TOF，美國愛博才思公司）;實(shí)驗(yàn)室發(fā)酵罐（15 L、50 L，上海洋格生物工程設(shè)備有限公司）;中試、試生產(chǎn)發(fā)酵罐（50 L、100 L、0.5 t、1 t、5 t、10 t、60 t，鎮(zhèn)江東方生物工程設(shè)備技術(shù)有限責(zé)任公司）;壓力噴霧干燥設(shè)備（水分蒸發(fā)量1 000 kg/h，無錫市現(xiàn)代噴霧干燥設(shè)備有限公司）。

1.3 試劑、標(biāo)準(zhǔn)品和測(cè)試專用附件

氨基酸混合溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（中國北京）購自中國計(jì)量科學(xué)研究院;濃鹽酸、冰醋酸、無水乙酸鈉（中國上海）購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;三乙胺、乙腈、PITC、CHCA、ProteoMass Peptide & Protein MALDI-MS Calibration Kit購自Sigma（美國）;甲醇購自Fisher Scientific（美國）;SA購自Fluka（美國）;SP Sepharose填料購自GE（美國）;2.6 cm×10 cm層析柱（中國上海）購自上海錦華層析設(shè)備廠;HL-1B數(shù)顯恒流泵（中國上海）購自上海滬西分析儀器廠有限公司;Symmetry C 18色譜柱購自Waters（美國）;氨基酸分析柱（中國北京）購自北京迪科馬科技有限公司;水解管購自CNW Technologies GmbH（德國）;Block Heater（中國上海）購自上海比朗儀器有限公司;樣品靶購自AB Sciex（美國）;BCA蛋白定量分析試劑盒購自Thermo（美國）。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 菌種保藏。

高產(chǎn)菌絲霉素（plectasin）畢赤酵母（Pichia pastoris）基因工程菌PPle，菌株編號(hào)BC01。冷凍干燥管、甘油管菌種保藏于上海邦成生物工程有限公司微生物及發(fā)酵研究所菌種保藏庫-80 ℃低溫冷凍柜。菌落特征為在YPD平板上，菌落乳白色，平板培養(yǎng)時(shí)間較長，泛微黃，菌落光滑圓潤，有酒香。

1.4.2 菌絲霉素基因工程菌構(gòu)建。

1.4.2.1 基因工程菌構(gòu)建技術(shù)路線?；蚬こ叹鷺?gòu)建技術(shù)路線見圖1。

1.4.2.2 技術(shù)路線中關(guān)鍵技術(shù)。

（1）菌絲霉素是由40個(gè)氨基酸組成的多肽，其結(jié)構(gòu)式（即氨基酸組成）為GFGCNGPWNEDDLRCHNHCKSIKGYKGGYCAKGGFVCKCY。

（2）構(gòu)建誘導(dǎo)型畢赤酵母基因工程菌株前后酵母發(fā)酵過程中生物量的變化情況。

通過構(gòu)建誘導(dǎo)型高產(chǎn)菌絲霉素畢赤酵母基因工程菌株后，采用實(shí)驗(yàn)室15 L發(fā)酵罐，經(jīng)正交試驗(yàn)、響應(yīng)面分析、補(bǔ)料高密度發(fā)酵工藝優(yōu)化，有效提高發(fā)酵過程中菌體的生物量，結(jié)果發(fā)酵液菌體鮮生物量可達(dá)300 g/L。

（3）構(gòu)建誘導(dǎo)型畢赤酵母基因工程菌株前后菌絲霉素表達(dá)能力的變化情況。

通過構(gòu)建誘導(dǎo)型高產(chǎn)菌絲霉素畢赤酵母基因工程菌株后，采用實(shí)驗(yàn)室15 L發(fā)酵罐，經(jīng)正交試驗(yàn)、響應(yīng)面分析、補(bǔ)料高密度發(fā)酵工藝優(yōu)化，有效提高發(fā)酵過程中發(fā)酵液的抗菌效價(jià)，結(jié)果發(fā)酵液抗菌效價(jià)可達(dá)到6 000 U/mL。

1.4.3 高密度發(fā)酵工藝優(yōu)化試驗(yàn)

1.4.3.1 50 L罐工藝。培養(yǎng)基：

①固體斜面培養(yǎng)基（W/V）。葡萄糖2.00%，蛋白胨200%，酵母浸粉1.00%，瓊脂200%，pH自然。

②搖瓶種子培養(yǎng)基（W/V）。葡萄糖200%，蛋白胨200%，酵母浸粉1.00%，pH自然。

③50 L罐發(fā)酵培養(yǎng)基（W/V）。甘油4.00%，磷酸100%，七水硫酸鎂1.00%，氫氧化鉀0.60%，硫酸銨0.17%，氯化鈉 0.05%，泡敵0.05%，微量元素0.20%，pH 5.0。微量元素（W/V）有硫酸亞鐵6.50%，氯化鋅2.0%，硫酸銅0.60%，碘化鉀0.08%，濃硫酸0.50%，硫酸錳0.30%，氯化鈷005%，鉬酸鈉002%，硼酸0.02%，生物素0.02%（以上培養(yǎng)基均經(jīng)121 ℃滅菌20 min）。

培養(yǎng)方法：

①固體斜面培養(yǎng)。28～30 ℃培養(yǎng)72 h。

②搖瓶種子培養(yǎng)。取斜面菌種，無菌操作接種1環(huán)斜面菌苔，接入已經(jīng)滅菌處理冷卻，裝有120 mL培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，置搖床以轉(zhuǎn)速170 r/min、28～30 ℃培養(yǎng)24 h。

③50 L罐發(fā)酵。將培養(yǎng)好的二級(jí)搖瓶種子液以5%（V/V）的接種量，無菌操作接入已經(jīng)滅菌處理冷卻、裝有30 L培養(yǎng)基的50 L發(fā)酵罐中。培養(yǎng)條件為25～30 ℃，轉(zhuǎn)速350～750 r/min，風(fēng)量600～2 500 L/h，罐壓0.02～0.05 MPa。

1.4.3.2 5 t罐工藝。培養(yǎng)基：

①搖瓶種子培養(yǎng)基。蛋白胨20.00 g/L，酵母浸粉1000 g/L。121 ℃滅菌20? min，滅菌完畢后加入終濃度為2000 g/L葡萄糖（115 ℃，15 min單獨(dú)滅菌），pH自然。

②50 L罐發(fā)酵培養(yǎng)基。一級(jí)種子同搖瓶種子培養(yǎng)基。裝液量30 L。

③500 L罐發(fā)酵培養(yǎng)基。二級(jí)種子同搖瓶種子培養(yǎng)基。裝液量300 L。121 ℃滅菌20 min，滅菌后100 L罐分裝80 L（分裝前100 L罐先進(jìn)行空罐滅菌處理）。

④5 t罐發(fā)酵培養(yǎng)基。甘油40.00 g/L，磷酸10.00 g/L，七水硫酸鎂 10.00 g/L，氫氧化鉀6.00 g/L，硫酸銨1.72 g/L，氯化鈉 0.50 g/L，泡敵0.50 g/L，微量元素0.20 g/L，pH 5.0。微量元素（W/V）有硫酸亞鐵6.50%，氯化鋅2.00%，碘化鉀008%，硫酸銅0.60%，濃硫酸0.50%，氯化鈷0.05%，硫酸錳0.30%，鉬酸鈉0.02%，硼酸0.02%，生物素0.02%。裝液量3 t。121 ℃滅菌20 min，滅菌后1 t罐分裝800 L（分裝前1 t罐先進(jìn)行空罐滅菌處理）。

發(fā)酵條件：

①搖瓶。28～30 ℃，轉(zhuǎn)速170 r/min，培養(yǎng)周期24 h。

②50 L罐發(fā)酵。28～30 ℃，轉(zhuǎn)速350 r/min，風(fēng)量40 L/min，罐壓0.02～0.05 MPa，培養(yǎng)周期24 h。

③500 L罐發(fā)酵。28～30 ℃，轉(zhuǎn)速290 r/min，風(fēng)量25 m3/h，罐壓0.06～0.08 MPa，培養(yǎng)周期24 h。

④5 t罐發(fā)酵。25～30 ℃，轉(zhuǎn)速170 r/min，風(fēng)量400 m3/h，罐壓0.06～0.08 MPa。

1.4.3.3 60 t罐工藝。培養(yǎng)基：

①搖瓶種子培養(yǎng)基。同5 t罐工藝中搖瓶種子培養(yǎng)基。

②500 L罐發(fā)酵培養(yǎng)基。一級(jí)種子同搖瓶種子培養(yǎng)基。裝液量300 L。

③5 t罐發(fā)酵培養(yǎng)基。二級(jí)種子同搖瓶種子培養(yǎng)基。裝液量3 t。121 ℃滅菌20 min，滅菌后1 t罐分裝800 L（分裝前1 t罐先進(jìn)行空罐滅菌處理）。

④60 t罐發(fā)酵培養(yǎng)基。同5 t罐發(fā)酵培養(yǎng)基。裝液量30 t。滅菌后10 t罐分裝8 t（分裝前10 t罐先進(jìn)行空罐滅菌處理）。

發(fā)酵條件：

①搖瓶。28～30 ℃，轉(zhuǎn)速170 r/min，培養(yǎng)周期24 h。

②500 L罐發(fā)酵。28～30 ℃，轉(zhuǎn)速290 r/min，風(fēng)量25 m3/h，罐壓0.06～0.08 MPa，培養(yǎng)周期24 h。

③5 t罐發(fā)酵。28～30 ℃，轉(zhuǎn)速170 r/min，風(fēng)量400 m3/h，罐壓0.06～008 MPa，培養(yǎng)周期24 h。

④60 t罐發(fā)酵。25～30 ℃，轉(zhuǎn)速80 r/min，風(fēng)量3 000 m3/h，罐壓0.06～0.08 MPa。

1.4.4 發(fā)酵液噴霧干燥方法。

進(jìn)風(fēng)溫度控制在170～190 ℃;出風(fēng)溫度控制在70～90 ℃;水分蒸發(fā)量控制在1 000 kg/h。

1.4.5 菌絲霉素分離、純化方法。

1.4.5.1 樣品處理。

菌絲霉素發(fā)酵液→10 000 r/min，4 ℃離心15 min→上清液95 ℃熱處理15 min →冷卻→10 000 r/min，4 ℃離心15 min→收集上清液→等體積加入20 mmol/L pH 6.7的磷酸鉀緩沖液 →加入2倍體積的純水（電導(dǎo)率≤4 mS/cm）→0.45 μm的濾膜過濾→置4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.5.2 層析柱準(zhǔn)備。

10 mL的SP Sepharose FF填料裝入26 cm×10 cm層析柱中，用5倍柱體積的純水平衡柱子，然后用3倍柱體積的20 mmol/L pH 6.7的磷酸鉀緩沖液平衡柱子。

1.4.5.3 純化。

上樣→上樣結(jié)束后用3倍柱體積的20 mmol/L pH 6.7的磷酸鉀緩沖液沖洗柱子→然后用3倍柱體積含0.2 mol/L NaCl的20 mmol/L pH 6.7的磷酸鉀緩沖液洗雜 → 再用3倍柱體積含0.5 mol/L NaCl的20 mmol/L pH 6.7的磷酸鉀緩沖液洗脫→收集峰值→最后用3倍柱體積含1 mol/L NaCl的20 mmol/L pH 6.7的磷酸鉀緩沖液沖洗柱子。

1.4.6 菌絲霉素抗菌肽特性。

1.4.6.1 熱穩(wěn)定性試驗(yàn)。

菌絲霉素發(fā)酵液→分別于40、50、60、70、80、95 ℃水浴加熱15 min → 5 000 r/min離心10 min → 檢測(cè)效價(jià)。

1.4.6.2 pH穩(wěn)定性試驗(yàn)。

產(chǎn)品 → 加水復(fù)溶 → 分別將pH調(diào)至2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0→ 5 000 r/min離心10 min→ 檢測(cè)效價(jià)。

1.4.6.3 耐膽鹽試驗(yàn)。

產(chǎn)品 → 加水1∶9復(fù)溶 → 分別加入豬膽鹽0.03%、0.10%、0.20%、0.30%、1.00%? → 25 ℃反應(yīng)4 h → 6 000 r/min離心10 min → 檢測(cè)上清液效價(jià)。

1.4.6.4 抗蛋白酶降解測(cè)試。

產(chǎn)品 → 加水復(fù)溶 →調(diào)最適pH（胃蛋白酶pH 2.0、胰蛋白酶pH 7.5、蛋白酶K pH 75）→ 按終質(zhì)量濃度1.0 mg/mL加入3種酶 → 分別水浴40 ℃（胃蛋白酶）、37 ℃（胰蛋白酶）和58 ℃（蛋白酶K）酶解2 h → 調(diào)pH至5.9 → 5 000 r/min離心10 min → 檢測(cè)效價(jià)。

1.5 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.5.1 OD 600 nm的測(cè)定。

取發(fā)酵液，用蒸餾水稀釋至適宜菌濃度，用分光光度計(jì)，在600 nm波長處，用比色管定時(shí)測(cè)定發(fā)酵液的吸光度（OD 600 nm），測(cè)定時(shí)用蒸餾水作空白。

1.5.2 pH的測(cè)定。

取一定量的發(fā)酵液，用pH計(jì)測(cè)定發(fā)酵液的pH，測(cè)定前用標(biāo)準(zhǔn)緩沖溶液校正。

1.5.3 菌體濕重的測(cè)定。

取發(fā)酵液，將一定體積的待測(cè)發(fā)酵液（25 mL）倒入離心管中，設(shè)定一定的離心時(shí)間和轉(zhuǎn)速（3 000 r/min，15 min），進(jìn)行離心處理，處理完倒掉上清液并稱重，計(jì)算菌體濕重（W/V，%）。

1.5.4 發(fā)酵液抗菌效價(jià)的測(cè)定。

從甘油管中取革蘭氏陽性菌（G+），金黃色葡萄球菌指示菌ATCC25923（Staphylococcus aureus ATCC25923）菌種平板劃線，37 ℃培養(yǎng)過夜，將單菌落接種至無抗LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)過夜，將菌液稀釋OD 600 nm至1.0，然后將稀釋菌液按1∶1 000的比例加入溫度不高于50 ℃融化的無抗LB瓊脂培養(yǎng)基中，混勻倒平板，冷卻備用。用Ф2.7 mm打孔器在LB平板上打孔，每皿至少打3個(gè)孔，每孔接種5 μL發(fā)酵液（使用前吸1.5 mL至2 mL離心管中，10 000 r/min離心5 min，再用0.22 μm過濾器用針筒吸取過濾），用無菌水作空白對(duì)照，37 ℃培養(yǎng)過夜。根據(jù)抑菌圈大小計(jì)算抗菌效價(jià)。

計(jì)算公式：抗菌效價(jià)U（U/mL）=2x×1 000×稀釋倍數(shù)，x=（y-2.7）/2.1。

其中，y為抗菌肽抑菌圈直徑（Φmm），取平均值;

2.7為孔穴直徑（Φmm）;

2.1為抗菌肽濃度與抑菌圈直徑的比值常數(shù)。

1.5.5 產(chǎn)品抗菌效價(jià)的測(cè)定。

準(zhǔn)確稱取1.000 0 g產(chǎn)品至9 mL無菌生理鹽水中（10倍稀釋），充分振蕩溶解，溶解后吸1.5 mL至2 mL離心管中，10 000 r/min離心5 min，再用0.22 μm濾膜過濾器用針筒吸離心上清液過濾。測(cè)定方法同“1.4.4”方法。

計(jì)算公式：抗菌效價(jià)U（U/g）=2x×1 000×稀釋倍數(shù)，其他同“1.4.4”。

1.5.6 菌絲霉素純品純度鑒定方法。

1.5.6.1 純品收集。

在用含0.5 mol/L NaCl的20 mmol/L pH 6.7的磷酸鉀緩沖液洗脫時(shí)，共收集10管（每管4～5 mL）;HPLC測(cè)得第4～10管菌絲霉素的含量較高，其中第4管含量最高菌絲霉素的峰面積最大，因此單獨(dú)保留第4管，進(jìn)行HPLC法純度鑒定。

1.5.6.2 HPLC法純度鑒定。

流動(dòng)相A：取1 mL三氟乙酸，加入1 000 mL乙腈，充分混勻。流動(dòng)相B：取1 mL三氟乙酸，加入1 000 mL純水（電導(dǎo)率≤4 mS/cm），充分混勻。Symmetry C 18色譜柱（250.0 mm×4.6 mm，5.0 μm），流速1 mL/min，波長280 nm，柱溫35 ℃，進(jìn)樣量20 μL。

1.5.7 菌絲霉素氨基酸組成分析。

1.5.7.1 純品酸水解。

取一定量純品，轉(zhuǎn)移至水解管中，加入1 mL 6 mol/L的鹽酸，充入N 2約10 min，之后密封放置于Block Heater干式加熱器模塊中，110 ℃水解反應(yīng)24 h。反應(yīng)完畢后，將游離氨基酸溶液轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管中，抽真空濃縮至干。

1.5.7.2 異硫氰酸苯酯（PITC）衍生方法。

（1）混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品衍生化處理。取25 μL混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液，加入12.5 μL 1 mol/L三乙胺渦旋混合振蕩，之后加入12.5 μL 1 mol/L PITC渦旋混合振蕩室溫靜置1 h，加入100 μL正己烷劇烈混合振蕩后靜置10 min，取下層溶液20 μL，加入180 μL流動(dòng)相A溶液，混合后0.22 μm過濾處理待測(cè)試。

（2）純品溶液衍生化處理。取適量流動(dòng)相A液復(fù)溶已凍干樣品游離氨基酸，取25 μL樣品游離氨基酸溶液，其他操作同（1）。

（3）HPLC測(cè)試。衍生化好的氨基酸衍生物進(jìn)行液相色譜測(cè)試。A液為0.05 mol/L乙酸鈉水溶液;B液為甲醇乙腈水溶液[甲醇∶乙腈∶水=20∶60∶20（V∶V∶V）]。流速為1.0 mL/min;柱溫35 ℃;色譜柱以95%的A液平衡后，樣品由自動(dòng)進(jìn)樣器上樣到氨基酸分析柱。

1.5.8 菌絲霉素相對(duì)分子質(zhì)量分析方法。

1.5.8.1 點(diǎn)樣。

將1 μL純品樣點(diǎn)至樣品靶上，自然干燥后，再取0.6 μL CHCA（Sigma）基質(zhì)溶液點(diǎn)至對(duì)應(yīng)靶位上并自然干燥，用相同方法在樣品靶位相鄰位置點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)樣。

1.5.8.2 校準(zhǔn)。

在正離子模式下，選擇反射方法對(duì)樣品測(cè)試范圍進(jìn)行校準(zhǔn)測(cè)試。

1.5.8.3 相關(guān)參數(shù)。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)校準(zhǔn)范圍為1 046.54±050、1 533.86±0.50、2 465.20±0.50、3 494.65±0.50。

1.5.8.4 測(cè)試樣品。

在正離子模式下，選擇反射方法測(cè)試樣品分子量。

1.5.8.5 質(zhì)譜數(shù)據(jù)及圖譜處理。

5800MALDI-TOF/TOF產(chǎn)生的原始數(shù)據(jù)及圖譜由4000Series Explorer V3.5軟件導(dǎo)出。

1.5.9 純品的蛋白濃度C 1（mg/mL）測(cè)定方法。

采用BCA蛋白定量分析試劑盒法（Thermo Scientific Pierce 23225型）測(cè)定。

1.6 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)無特別標(biāo)注均為2次測(cè)定值的平均值，數(shù)據(jù)經(jīng)過Excel 2016處理后，定量測(cè)定數(shù)據(jù)利用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，差異顯著時(shí)采用Duncan’s法進(jìn)行多重比較，試驗(yàn)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）”表示，顯著性水平為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 高密度發(fā)酵工藝優(yōu)化試驗(yàn)

2.1.1 50 L罐試驗(yàn)結(jié)果。

50 L罐發(fā)酵過程控制：發(fā)酵18～24 h后液體內(nèi)溶氧（DO）開始上升后定量流加甘油，再補(bǔ)甘油8～10 h，菌體濕重達(dá)25%以上。流加完甘油后，開始流加甲醇，5 h后降溫至25 ℃進(jìn)行維持，利用氨水調(diào)節(jié)pH 50左右，誘導(dǎo)至下罐。50 L試驗(yàn)罐進(jìn)行發(fā)酵工藝優(yōu)化試驗(yàn)，3批次穩(wěn)定發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果見圖2～4。

從圖2～4可以看出，3批次50 L罐穩(wěn)定小試發(fā)酵試驗(yàn)，在發(fā)酵液達(dá)到最高OD 600 nm時(shí)，分別取樣測(cè)定菌體濕重和抗菌效價(jià)，檢測(cè)結(jié)果見表1。

從表1可以看出，3批次發(fā)酵液最高OD 600 nm值相對(duì)應(yīng)的菌體濕重和抗菌效價(jià)分別為（43.98±0.52）%、（43.91±008）%、（43.57±0.38）%和（8 736.18±135.76）、（8 226.29±244.66）、（8 286.31±140.01）U/mL;3批次之間菌體濕重和抗菌效價(jià)均無顯著差異。

2.1.2 5 t罐試驗(yàn)結(jié)果。

5 t罐中試發(fā)酵過程控制：發(fā)酵12～18 h后液體內(nèi)溶氧（DO）開始上升后定量流加甘油，流加甘油8～10 h，菌體濕重達(dá)25%以上。流加完甘油后，開始流加甲醇，5 h后降溫至25 ℃進(jìn)行維持，利用氨水調(diào)節(jié)pH 50左右，誘導(dǎo)至下罐。5 t罐3批次穩(wěn)定中試發(fā)酵檢測(cè)結(jié)果分別見圖5～7。

從圖5～7可以看出，3批次5 t罐穩(wěn)定中試發(fā)酵試驗(yàn)，在發(fā)酵液達(dá)到最高OD 600 nm值時(shí)，分別取樣測(cè)定菌體濕重和抗菌效價(jià)，檢測(cè)結(jié)果見表2。

從表2可以看出，3批次發(fā)酵液最高OD 600 nm值相對(duì)應(yīng)的菌體濕重和抗菌效價(jià)分別為（43.45±0.34）%、（44.45±034）%、（43.88±0.42）%和（10 350.54±438.41）、（10 564.35±328.10）、（11 001.81±202.23）U/mL;3批次之間菌體濕重和抗菌效價(jià)均無顯著差異。

2.1.3 60 t罐試驗(yàn)結(jié)果。

2.1.3.1 60 t罐試生產(chǎn)發(fā)酵。

60 t罐試生產(chǎn)發(fā)酵過程控制：發(fā)酵10～14 h后液體內(nèi)溶氧（DO）開始上升后定量流加甘油，流加甘油8～10 h，菌體濕重達(dá)25%以上。流加完甘油后，開始流加甲醇，5 h后降溫至25 ℃進(jìn)行維持，利用氨水調(diào)節(jié)pH 5.0左右，誘導(dǎo)至下罐。60 t罐3批次穩(wěn)定試生產(chǎn)發(fā)酵結(jié)果見圖8～10。發(fā)酵過程發(fā)酵液最高菌體濕重和抗菌效價(jià)測(cè)定結(jié)果見表3～5。

從圖8～10及表3～5可以看出，3批次60 t罐穩(wěn)定試生產(chǎn)發(fā)酵試驗(yàn)，批號(hào)20180627發(fā)酵64 h菌體生長進(jìn)入穩(wěn)定期，菌體積累達(dá)到峰值，此時(shí)菌體濕重為（43.34±0.27）%;批號(hào)20180721發(fā)酵67 h菌體生長進(jìn)入穩(wěn)定期，菌體積累達(dá)到峰值，此時(shí)菌體濕重為（43.78±0.40）%;批號(hào)20180828發(fā)酵65 h菌體生長進(jìn)入穩(wěn)定期，菌體積累達(dá)到峰值，此時(shí)菌體濕重為（43.98±0.38）%。批號(hào)20180627發(fā)酵64 h發(fā)酵液抗菌效價(jià)達(dá)到峰值，此時(shí)抗菌效價(jià)為（11 002.12±217.79）U/mL;批號(hào)20180721發(fā)酵70 h發(fā)酵液抗菌效價(jià)達(dá)到峰值，此時(shí)抗菌效價(jià)為（11 579.37±147.38）U/mL;批號(hào)20180828發(fā)酵68 h發(fā)酵液抗菌效價(jià)達(dá)到峰值，此時(shí)抗菌效價(jià)為（10 820.91±18364）U/mL。菌體濕重與抗菌效價(jià)之間相關(guān)聯(lián)，但并非線性相關(guān)關(guān)系。

2.1.3.2 ?60 t罐試生產(chǎn)結(jié)果。

高產(chǎn)菌絲霉素畢赤酵母基因工程菌PPle-BC01，60 t罐3批次穩(wěn)定試生產(chǎn)，發(fā)酵液及噴霧干燥產(chǎn)品抗菌效價(jià)及收率，結(jié)果見表6。從表6可以看出，60 t罐3批次穩(wěn)定試生產(chǎn)發(fā)酵液菌體濕重、抗菌效價(jià)峰值，噴霧干燥產(chǎn)品抗菌效價(jià)之間均無顯著差異。噴霧干燥產(chǎn)品的收率在12%以上。

2.2 菌絲霉素結(jié)構(gòu)、分子量及含量檢測(cè)

2.2.1 菌絲霉素純品純度鑒定。

HPLC法鑒定，檢測(cè)波長280 nm，檢測(cè)結(jié)果顯示，菌絲霉素可以在4.756 min的峰處檢測(cè)到，純品相對(duì)純度≥90%（圖11）。

2.2.2 菌絲霉素氨基酸組成分析。

純品水解后的游離氨基酸樣品，經(jīng)PITC衍生化處理后，經(jīng)過HPLC分析，得到的原始數(shù)據(jù)經(jīng)過Labsolution（SHIMADZU）經(jīng)外標(biāo)法自動(dòng)積分標(biāo)峰，所得的標(biāo)峰圖譜見圖12。

經(jīng)純品氨基酸組成摩爾百分比計(jì)算與氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)，測(cè)試結(jié)果符合菌絲霉素（plectasin）是由40個(gè)氨基酸組成的多肽的理論氨基酸殘基個(gè)數(shù)值。

2.2.3 菌絲霉素相對(duì)分子質(zhì)量分析。

標(biāo)準(zhǔn)品校準(zhǔn)測(cè)試通過后，測(cè)試純品相對(duì)分子質(zhì)量，純品測(cè)試圖譜見圖13。

菌絲霉素（plectasin）是由40個(gè)氨基酸組成的多肽，其結(jié)構(gòu)式（即氨基酸組成）的序列是GFGCNGPWNEDDLRCHNHCKSIKGYKGGYCAKGGFVCKCY。菌絲霉素的理論分子量為4.400 0 kD。圖13質(zhì)譜圖測(cè)得單同位素相對(duì)分子量為4.440 7 kD。該分子量與理論分子量相似，因此Plectasin被檢測(cè)到。

2.2.4 菌絲霉素含量。

2.2.4.1 純蛋白的比活。

（1）純品的蛋白濃度C 1（mg/mL）測(cè)定。

蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定結(jié)果見圖14。

37 ℃反應(yīng)30 min，用酶標(biāo)儀測(cè)定492 nm處的吸光度值，測(cè)得菌絲霉素純品的吸光度值，計(jì)算得到蛋白濃度C 1=（161±0.04）mg/mL。

（2）純品的抗菌效價(jià)U 1（U/mL）測(cè)定。

在用含0.5 mol/L NaCl的20 mmol/L pH 6.7的磷酸鉀緩沖液洗脫時(shí)，共收集10管（每管4～5 mL）;HPLC檢測(cè)結(jié)果表明，第4～10管菌絲霉素的含量較高，其中第4管含量最高菌絲霉素的峰面積最大，將各管混合后混合液進(jìn)行抗菌效價(jià)檢測(cè)，測(cè)得混合液的效價(jià)U 1=（7 174.12±101.44）U/mL。

（3）純蛋白的比活計(jì)算。

純蛋白比活計(jì)算公式為RU=U 1/C 1（U/mg）。計(jì)算純蛋白的比活RU=U 1/C 1=4 455.98 U/mg。

2.2.4.2 產(chǎn)品抗菌效價(jià)。U 0（U/g）測(cè)定結(jié)果見表6。

2.2.4.3 菌絲霉素含量。

1 g產(chǎn)品中菌絲霉素含量（mg/g）=U 0/RU。60 t罐3批次穩(wěn)定試生產(chǎn)產(chǎn)品中菌絲霉素含量檢測(cè)值分別為批號(hào)20180627的1 g產(chǎn)品中菌絲霉素含量U 0/RU=22.59 mg/g，折算百分含量2.26%（W/W）。批號(hào)20180721的1 g產(chǎn)品中菌絲霉素含量U 0/RU=23.24 mg/g，折算百分含量2.32%（W/W）。批號(hào)20180828的1 g產(chǎn)品中菌絲霉素含量U 0/RU=22.39 mg/g，折算百分含量2.24%（W/W）。

2.3 菌絲霉素抗菌肽產(chǎn)品特性

2.3.1 ?熱穩(wěn)定性。

熱穩(wěn)定性測(cè)試結(jié)果見圖15。

從圖15可以看出，菌絲霉素抗菌肽產(chǎn)品在95 ℃以下抗菌效價(jià)無顯著差異，說明其具有較良好的熱穩(wěn)定性。

2.3.2 pH穩(wěn)定性。

pH穩(wěn)定性測(cè)試結(jié)果見圖16。

從圖16可以看出，菌絲霉素抗菌肽產(chǎn)品在pH 3.0～9.0時(shí)抗菌效價(jià)測(cè)試結(jié)果無顯著差異，說明在此pH范圍內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性（pH 2.0抑菌效價(jià)測(cè)試結(jié)果偏高，應(yīng)該是酸影響的結(jié)果）。

2.3.3 耐膽鹽試驗(yàn)。

耐膽鹽試驗(yàn)結(jié)果見圖17。

從圖17可以看出，菌絲霉素抗菌肽產(chǎn)品在0.03%～030%膽鹽濃度下抗菌效價(jià)無顯著差異，說明其對(duì)膽鹽具有較好的耐受性。

2.3.4 抗蛋白酶降解測(cè)試。

抗蛋白酶降解測(cè)試結(jié)果見圖18。

從圖18可以看出，菌絲霉素抗菌肽產(chǎn)品對(duì)胃蛋白酶、胰蛋白酶和蛋白酶K的抗菌效價(jià)無顯著差異，說明其對(duì)上述3種蛋白酶均具有良好的抗降解性。

3 結(jié)論與討論

3.1 討論

Mygind等[7]首先從腐生子囊菌假黑盤菌菌絲體中克隆到菌絲霉素的cDNA，將其轉(zhuǎn)化至米曲霉表達(dá)系統(tǒng)中，分泌出菌絲霉素，并進(jìn)行了其結(jié)構(gòu)和活性研究。之后，人們開展了一系列針對(duì)菌絲霉菌的研究。Yang等[8]研究表明，菌絲霉素具有強(qiáng)抗革蘭氏陽性菌、無溶血性等作用，可作為一種潛在的治療革蘭氏陽性菌感染的非抗菌素類藥物。王少然[9]在畢赤酵母X-33中融合表達(dá)單體Plectasin。將設(shè)計(jì)的單體基因重組到載體pPICZaA上，轉(zhuǎn)入畢赤酵母X-33中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)表達(dá)120 h后，X-33（pPICZaA/PPD）分泌表達(dá)的總蛋白濃度為339 μg/mL，X-33（pPICZaA/PN）分泌表達(dá)的總蛋白濃度為307 μg/mL。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)鎳柱純化、化學(xué)試劑切割后，進(jìn)行抑菌活性鑒定，發(fā)現(xiàn)切割后獲得的單體PPD和PN均可以抑制金黃色葡萄球菌的生長。萬津[10]將Ple多聚體基因克隆加入畢赤酵母分泌型表達(dá)載體pPICZaA，轉(zhuǎn)化畢赤酵母X-33后得到一株基因工程菌PPle;在1%甲醇誘導(dǎo)下，其表達(dá)產(chǎn)物Plectasin能夠有效分泌到培養(yǎng)基中;重組菌絲霉素分子大小約為4.1 kD;在搖瓶中誘導(dǎo)，畢赤酵母基因工程菌PPle分泌水平為143 μg/mL。體外抑菌試驗(yàn)表明，重組菌絲霉素對(duì)豬鏈球菌和金黃色葡萄球菌有強(qiáng)烈的抑制作用，最小抑菌濃度顯示其對(duì)豬鏈球菌最為敏感，最小抑菌濃度為4 μg/mL;能從pH 2.0～10.0保持抗菌活性;經(jīng)胃蛋白酶消化處理后仍能保持較強(qiáng)的抑菌活性。試驗(yàn)采用60只4周齡健康SD大鼠，按體重相近、雌雄各半原則，隨機(jī)分為6個(gè)處理，單籠飼養(yǎng)進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)。分別通過腹腔連續(xù)注射重組菌絲霉素、萬古霉素和培養(yǎng)上清液（對(duì)照）后，對(duì)其中一半大鼠進(jìn)行金黃色葡萄球菌攻毒（另一半作為對(duì)照注射生理鹽水），所有大鼠繼續(xù)飼養(yǎng)14 d后宰殺取樣，結(jié)果表明，腹腔注射菌絲霉素和萬古霉素均能提高大鼠血清免疫球蛋白含量，改善大鼠免疫功能。葉滔等[11]構(gòu)建表達(dá)菌絲霉素NZ2114蛋白的真核重組表達(dá)質(zhì)粒pPicZα-NZ2114，并轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，Zeocin抗性篩選陽性重組子，通過PCR鑒定、Tricine-SDS-PAGE分析和瓊脂孔穴擴(kuò)散法篩選獲得菌絲霉素NZ2114組成型表達(dá)菌株，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在4.4 kD處有明顯的目的條帶，經(jīng)50 L罐中試發(fā)酵，甲醇誘導(dǎo)96 h，菌體濕重達(dá)151.23 g/L，菌體細(xì)胞數(shù)達(dá)37億個(gè)/mL，蛋白濃度達(dá)606 μg/mL，重組轉(zhuǎn)化子甲醇誘導(dǎo)發(fā)酵上清液對(duì)金黃色葡萄球菌CMCC26003具有明顯的抑制作用。萬津等[12]采用30 L液體發(fā)酵罐對(duì)畢赤酵母基因工程菌PPle進(jìn)行高密度誘導(dǎo)培養(yǎng)，采用分批-補(bǔ)料式發(fā)酵工藝和甘油基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基，研究了畢赤酵母工程菌生長及重組蛋白表達(dá)規(guī)律，并考察了重組菌絲霉素對(duì)金黃色葡萄球菌感染大鼠腸道健康和免疫功能的影響。結(jié)果表明，在30 ℃下，經(jīng)甲醇連續(xù)誘導(dǎo)72 h，其最大菌體濕重達(dá)402 g/L，最高發(fā)酵上清蛋白總濃度為3.94 g/L。李延等[13]利用30 L發(fā)酵罐對(duì)畢赤酵母基因工程菌（PPle）進(jìn)行液體發(fā)酵，采用分批-補(bǔ)料式發(fā)酵工藝，比較低鹽、基礎(chǔ)甘油和基礎(chǔ)可溶性淀粉3種不同培養(yǎng)基對(duì)重組菌絲霉素分泌表達(dá)的影響。結(jié)果表明，發(fā)酵114 h，低鹽組、基礎(chǔ)甘油組和基礎(chǔ)可溶性淀粉組菌體濕重達(dá)到最高，分別為450、402、277 g/L。發(fā)酵114 h，測(cè)得發(fā)酵上清液蛋白總濃度低鹽組0.38 g/L、基礎(chǔ)甘油組3.94 g/L、基礎(chǔ)可溶性淀粉組5.63 g/L。選用30頭24日齡健康的“杜長大”斷奶仔豬，按體重一致原則隨機(jī)分配各組進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)。結(jié)果表明，與對(duì)照組（無抗飼糧）相比，菌絲霉素抗菌肽能顯著提高ADFI（P<0.05）和ADG（P<0.05），顯著降低F/G（P<005），顯著提高回腸食糜雙歧桿菌的含量（P<0.05），并有降低腹瀉率、提高能量和干物質(zhì)表觀消化率的趨勢(shì)（0.05<P<0.10）。李連彬[14]以牛奶來源的金黃色葡萄球菌為供試菌株，研究菌絲霉素源抗菌肽（NZ2114和MP1102）在培養(yǎng)基、牛奶和奶牛乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)的殺菌效果，并選用常規(guī)抗生素四環(huán)素作對(duì)照。結(jié)果表明，8株牛奶來源的金黃色葡萄球菌對(duì)2種抗菌肽均敏感，2種抗菌肽在牛奶和奶牛乳腺上皮細(xì)胞中具有對(duì)金黃色葡萄球菌E48高效殺菌能力，且效果優(yōu)于四環(huán)素處理組。通過牛奶源金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)小鼠乳腺炎模型，然后據(jù)此評(píng)估抗菌肽（NZ2114和MP1102）在體內(nèi)乳腺環(huán)境中的殺菌和抗炎效果。結(jié)果表明，經(jīng)過抗菌肽或四環(huán)素治療后乳腺組織中金黃色葡萄球菌數(shù)量顯著下降，且抗菌肽效果優(yōu)于四環(huán)素（四環(huán)素、NZ2114和MP1102分別下降了1.481、2.901和3.151 g單位的數(shù)量）。張清娟等[15]研究了菌絲霉素源抗菌肽（NZ2114）對(duì)奶牛乳房炎源停乳鏈球菌的體外殺菌效果及其作用機(jī)制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)抗菌肽NZ2114對(duì)奶牛乳房炎源停乳鏈球菌殺菌活性強(qiáng)，其破壞細(xì)菌細(xì)胞膜后可直接作用于胞內(nèi)的基因組DNA并改變其二級(jí)結(jié)構(gòu)。Ma等[16]為了評(píng)估日糧中添加重組菌絲霉素（Ple）對(duì)肉仔雞生長性能、腸道健康和血清免疫參數(shù)的影響，開展了288 d的動(dòng)物試驗(yàn)，采用1日齡肉仔雞進(jìn)行飼喂試驗(yàn)，試驗(yàn)分4組，包括飼喂基礎(chǔ)日糧（NC），添加10 mg/kg恩拉霉素（PC）、100 mg/kg菌絲霉素（LPle）和200 mg/kg菌絲霉素（HPle）。結(jié)果顯示，與NC組相比，Ple能極顯著提高ADG（P<0.01）、顯著降低F/G（21 d，P<0.05），極顯著提高十二指腸脂肪酶（42 d，P<0.01）和胰蛋白酶活性（P<0.01）。與PC組類似，Ple還能提高空腸絨毛高度和隱窩深度（21 d）;與NC組相比，空腸絨毛高度與隱窩深度比值（V/C）極顯著提高（42 d，P<0.01）。PC與Ple均能顯著提高IgG（21和42 d，P<005）和IgM值（42 d，P<0.05）。與NC組相比，PC、LPle和HPle組都能極顯著降低空腸內(nèi)丙二醛含量（21 d，P<0.01）。此外，Ple還能極顯著降低回腸和盲腸中E.coli和總需氧菌的數(shù)量（21和42 d，P<0.01）。

該研究以高產(chǎn)菌絲霉素畢赤酵母基因工程菌PPle-BC01為供試菌株，通過50 L、5 t、60 t發(fā)酵罐高密度發(fā)酵工藝優(yōu)化試驗(yàn)，實(shí)現(xiàn)了60 t罐規(guī)模的穩(wěn)定生產(chǎn)，3批次穩(wěn)定試生產(chǎn)發(fā)酵液菌體濕重峰值分別為43.34%、43.78%和43.78%，抗菌效價(jià)峰值分別為10 566.99、10 986.45和10 788.56 U/mL;噴霧干燥產(chǎn)品收率分別為12.19%、12.30%和12.50%，抗菌效價(jià)分別為100 672.10、103 561.20和99 765.50 U/g。經(jīng)層析柱分離、純化，得到相對(duì)純度≥90%的純品。純品水解后的游離氨基酸樣品，經(jīng)PITC衍生化處理后，再經(jīng)過HPLC分析及氨基酸組成摩爾百分比計(jì)算與氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)，分析純品在水解過程中，門冬酰胺和谷氨酰胺易轉(zhuǎn)化為門冬氨酸和谷氨酸，故將其理論個(gè)數(shù)合并計(jì)算;色氨酸、甲硫氨酸和胱氨酸易被破壞;故檢測(cè)氨基酸個(gè)數(shù)與理論個(gè)數(shù)有所減少，但從氨基酸組成總摩爾百分比計(jì)算仍符合Plectasin由40個(gè)氨基酸組成的多肽的理論氨基酸殘基個(gè)數(shù)值。純品經(jīng)多肽蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量分析測(cè)試，測(cè)得Plectasin單同位素相對(duì)分子量為4.440 7 kD，該分子量與理論分子量4.400 kD一致。純品經(jīng)蛋白濃度、抗菌效價(jià)測(cè)定、比活計(jì)算以及產(chǎn)品抗菌效價(jià)測(cè)定，計(jì)算3批次試生產(chǎn)產(chǎn)品中Plectasin含量分別為2.26%、2.32%和2.24%。產(chǎn)品經(jīng)性質(zhì)測(cè)試，95 ℃溫度以下具有良好的熱穩(wěn)定性;pH 3.0～9.0具有良好的酸堿穩(wěn)定性;在0.03%～0.30%豬膽鹽濃度下具有較好的膽鹽耐受性;對(duì)胃蛋白酶、胰蛋白酶和蛋白酶K均具有良好的抗降解性。

3.2 結(jié)論

該研究以高產(chǎn)菌絲霉素基因工程畢赤酵母PPle-BC01為供試菌株，通過50 L、5 t、60 t罐規(guī)模補(bǔ)料高密度發(fā)酵工藝優(yōu)化試驗(yàn)，并完成菌絲霉素（Plectasin）結(jié)構(gòu)、分子量及產(chǎn)品中含量檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)室15 L發(fā)酵罐基礎(chǔ)上發(fā)酵菌體鮮生物量提高到400 g/L，抗菌效價(jià)提高到8 000 U/mL以上。發(fā)酵終產(chǎn)品收率達(dá)10%，產(chǎn)品抗菌效價(jià)達(dá)8萬U/g以上，產(chǎn)品中Plectasin含量達(dá)2%以上，實(shí)現(xiàn)了60 t罐規(guī)模的產(chǎn)業(yè)化穩(wěn)定生產(chǎn)。

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