全局轉(zhuǎn)錄機(jī)器工程調(diào)控微生物代謝的應(yīng)用進(jìn)展

田鑫,戴健欣,田園,王光強(qiáng),艾連中,熊智強(qiáng)

(上海理工大學(xué) 健康科學(xué)與工程學(xué)院,上海食品微生物工程研究中心,上海,200093)

微生物精細(xì)調(diào)節(jié)自身轉(zhuǎn)錄翻譯和復(fù)雜代謝網(wǎng)絡(luò),而在全局水平擾動(dòng)其轉(zhuǎn)錄調(diào)控,可有效引起多基因協(xié)同調(diào)控效應(yīng)。σ因子和全局轉(zhuǎn)錄因子作為微生物改造中極其重要的工程靶標(biāo),與多個(gè)協(xié)同因子共同維持細(xì)胞碳氮代謝和抗逆性等生理功能,突變后將顯著影響下游眾多基因的表達(dá)。因此,全局轉(zhuǎn)錄機(jī)器工程(global transcription machinery engineering,gTME)通過對(duì)全局轉(zhuǎn)錄因子改造,建立轉(zhuǎn)錄因子基因突變文庫(kù),精準(zhǔn)篩選以獲得滿足需要的超能細(xì)胞株,有效提高細(xì)胞代謝活力[1]。但高效特異性進(jìn)化手段與靈敏快速的高通量方法是gTME主要限制環(huán)節(jié)。本文主要從gTME分子機(jī)制和應(yīng)用方向展開綜述,介紹與gTME相配合的改造技術(shù)和篩選策略,以期為微生物代謝改造提供參考。

1 gTME作用機(jī)制

原核生物RNA聚合酶(RNA polymerase,RNAP)由α2ββ’ω核心酶和σ亞基構(gòu)成,σ亞基識(shí)別啟動(dòng)子-35和-10區(qū)開啟轉(zhuǎn)錄,負(fù)責(zé)所有基因轉(zhuǎn)錄起始延伸和終止。gTME通過改造σ亞基引起大量調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄水平波動(dòng),進(jìn)而全局水平上影響細(xì)胞蛋白表達(dá)[2]。其中σ70家族指導(dǎo)參與應(yīng)激反應(yīng)和細(xì)胞生長(zhǎng)的基因轉(zhuǎn)錄,RpoD、RpoS、RpoE、RpoN、RpoH、RpoF和FecI等σ70因子協(xié)同全局轉(zhuǎn)錄因子(如CRP、ArcAB、H-NS、FNR、FIS、LRP和IHF)構(gòu)成gTME主調(diào)控網(wǎng)絡(luò),有激活和抑制轉(zhuǎn)錄的雙重調(diào)節(jié)作用[3](圖1)。RpoD和RpoS調(diào)節(jié)1 000多個(gè)基因,具有控制轉(zhuǎn)錄開關(guān)、協(xié)同調(diào)控多個(gè)分類功能轉(zhuǎn)錄因子的能力,結(jié)合gTME改良細(xì)胞生長(zhǎng)和穩(wěn)定期壓力等表型[4]。CRP、ArcAB和H-NS分別負(fù)責(zé)不同功能群基因表達(dá),參與穩(wěn)定期生長(zhǎng)和應(yīng)答反應(yīng)的基因轉(zhuǎn)錄。CRP調(diào)控分解代謝,由環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)形成復(fù)合體激活啟動(dòng)子區(qū)域間蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)-DNA之間相互作用,影響95%受體蛋白表達(dá),被廣泛用于gTME改良微生物滲透壓和氧化應(yīng)激等方面。BASAK等[5]采用gTME改造大腸桿菌CRP,通過2.0 mmol/L H2O2富集篩選得出高耐受菌株OM3,相比野生型(不生長(zhǎng))生長(zhǎng)速率提高到0.6/h,氧化耐受性提高36.84%。提高機(jī)理是CRP突變體與啟動(dòng)子結(jié)合作用發(fā)生變化,使其轉(zhuǎn)錄水平增加8.9倍,同時(shí)RpoS和OxyR(氧化還原敏感調(diào)節(jié)因子)轉(zhuǎn)錄水平提高至7.76倍和3.48倍,共同加強(qiáng)OM3菌株氧化應(yīng)激能力。H-NS是一種15.5 kDa的類核相關(guān)蛋白,生成的Hha-H-NS復(fù)合物調(diào)節(jié)操縱子特定序列和162個(gè)基因。GAO等[6]采用過表達(dá)和敲除建立大腸桿菌H-NS與耐酸性相關(guān)性,再利用gTME改造H-NS,耐酸性提高100倍。其中谷氨酸和谷氨酰胺依賴的耐酸系統(tǒng)中ybaS、ybaT和gadA顯著上調(diào),證實(shí)H-NS可激活和調(diào)控多個(gè)耐酸系統(tǒng)提高耐酸性。ArcAB調(diào)節(jié)厭氧呼吸蛋白,控制氧化還原相關(guān)基因表達(dá)。CABEZAS等[7]依靠gTME改造ArcA,得到突變株Arc-D54,相比野生菌株在NaClO氧化應(yīng)激下耐受性提高7倍,使ArcA下游基因(acrB,tdcB,fadB和cyoE)激活,但arcA敲除菌株不生長(zhǎng),表明ArcA顯著提高沙門氏菌抵抗NaClO氧化應(yīng)激的能力。

圖1 RNA聚合酶與主調(diào)控網(wǎng)絡(luò)(全局轉(zhuǎn)錄因子和sigma因子)Fig.1 RNA polymerase and master regulatory network(global transcription factor and sigma factor)注:圓大小與調(diào)控基因數(shù)量相關(guān),箭頭反應(yīng)表達(dá)方向

真核生物中Spt蛋白是轉(zhuǎn)錄起始輔助因子Spt-Ada-Gcn5-乙酰轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體(Spt-Ada-Gcn5-acetyltransferase，SAGA)的組成部分，調(diào)節(jié)染色質(zhì)TATA結(jié)合蛋白(TATA binding protein，TBP)啟動(dòng)子結(jié)合,與RNA聚合酶Ⅱ及十幾種轉(zhuǎn)錄因子完成基因組mRNA轉(zhuǎn)錄。Spt15是TFIID(轉(zhuǎn)錄起始因子)的亞基,是RNA聚合酶Ⅱ和Ⅲ的組成成分,結(jié)合TBP激活轉(zhuǎn)錄。通過gTME構(gòu)建Spt15文庫(kù)操縱酵母TFIID組分引起轉(zhuǎn)錄子多基因重排,使RNAⅡ轉(zhuǎn)錄譜偏好變化,得到一株實(shí)現(xiàn)葡萄糖和木糖共發(fā)酵的釀酒酵母,木糖利用率達(dá)98.9%,而出發(fā)菌株不能利用木糖,此研究豐富了gTME在真核細(xì)胞中適用性[8]。人工轉(zhuǎn)錄因子(artifical transcription factor,ATF)通常由一種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子DNA結(jié)合域和另一種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子效應(yīng)域融合形成的調(diào)控蛋白。gTME采用隨機(jī)組裝不同類型的鋅指蛋白(zinc finger proteins,ZFs)與CRP效應(yīng)域構(gòu)建ATF文庫(kù),展現(xiàn)高度特異性和特征性,篩選得到的大腸桿菌MG1655突變株耐熱性增加并可耐受1.5%丁醇?？傊?σ因子、全局轉(zhuǎn)錄因子和人工轉(zhuǎn)錄因子都在gTME中展現(xiàn)出強(qiáng)序列特異性和作用效果[9]。

2 gTME在應(yīng)變工程中的應(yīng)用

提高微生物抗逆性是gTME的重要應(yīng)用,轉(zhuǎn)錄因子促進(jìn)或抑制RNAP,差異化調(diào)節(jié)編碼蛋白質(zhì)表達(dá),在應(yīng)變過程能顯著提高抵抗有機(jī)溶劑、高糖、高溫和強(qiáng)滲透壓等極端環(huán)境(表1)的能力。以大腸桿菌為例,RpoD和RpoS分別調(diào)控細(xì)胞對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期與壓力響應(yīng)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄,全局轉(zhuǎn)錄因子CRP通過調(diào)節(jié)RpoS表達(dá),間接調(diào)控細(xì)胞應(yīng)激能力。ALPER等[10]采用gTME對(duì)大腸桿菌RpoD進(jìn)行三輪突變,分離出突變株對(duì)乙醇有強(qiáng)耐受性,在70 g/L乙醇中能保持6 h倍增時(shí)間(對(duì)照不生長(zhǎng))。rpoD突變?cè)斐蒰roEL和htpG等乙醇脅迫相關(guān)基因顯著上調(diào)。CHONG等[11]揭示全局轉(zhuǎn)錄因子CRP對(duì)提高大腸桿菌乙酸和甲苯耐受性有顯著功效,采取gTME獲得最優(yōu)菌株A2的CRP氨基酸序列第138位點(diǎn)天冬氨酸替換成酪氨酸,影響CRP的DNA結(jié)合親和力,A2乙酸耐受性提高5倍,微陣列分析耐酸相關(guān)基因yfid、pflb和gadA表達(dá)水平上升,從而抑制細(xì)胞內(nèi)酸化。另外,利用gTME構(gòu)建CRP突變文庫(kù)調(diào)控有機(jī)溶劑耐受性,得到的大腸桿菌在0.23%甲苯中比生長(zhǎng)速度達(dá)到0.51/h(對(duì)照無(wú)生長(zhǎng)),對(duì)突變株測(cè)序分析CRP第136位苯丙氨酸替換為異亮氨酸導(dǎo)致β發(fā)夾結(jié)構(gòu)改變,影響CRP調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄水平,導(dǎo)致耐有機(jī)溶劑相關(guān)基因arcAB和rpoS轉(zhuǎn)錄水平提高,促進(jìn)甲苯排出細(xì)胞[12]。

相比細(xì)胞展示技術(shù)、單基因敲除等傳統(tǒng)方法,gTME提高酵母抗逆性的優(yōu)勢(shì)在于無(wú)需將融合蛋白定位宿主表面,改造表型廣泛且效率更高[13]。gTME誘導(dǎo)真核細(xì)胞強(qiáng)化抗逆性方法主要包括：(1)構(gòu)建Spt或Taf突變庫(kù),Spt亞基和Taf蛋白與編碼乙醇脫氫酶Ⅱ復(fù)合物功能相關(guān)。ALPER等[14]構(gòu)建Spt15和Taf25的gTME文庫(kù)改良釀酒酵母乙醇耐受性和產(chǎn)量,篩選出突變株spt15p-100可耐受20%乙醇,乙醇產(chǎn)率增加到2 g/(L·h),而對(duì)照組僅為1.2 g/(L·h)。突變株在轉(zhuǎn)錄水平上數(shù)百基因差異表達(dá),對(duì)高表達(dá)的12個(gè)基因進(jìn)行單獨(dú)過表達(dá)和敲除,均未能達(dá)到gTME作用效果,表明細(xì)胞耐受性提高為多基因共同調(diào)控的結(jié)果。(2)通過下游基因結(jié)構(gòu)性刺激提高有機(jī)溶劑耐受性。如酵母中Pdr1p(多藥耐藥轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因)不參與有機(jī)溶劑脅迫的反應(yīng),但由gTME修飾Pdr1p,使其在821位點(diǎn)由絲氨酸突變?yōu)榫彼?下游編碼ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因pdr10、pdr15、snq2和yor1等6個(gè)編碼細(xì)胞壁蛋白的基因顯著上調(diào),正壬烷耐受性提高23%,gTME改造效果明顯優(yōu)于單獨(dú)過量表達(dá)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。因此,gTME通過修飾轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控多個(gè)基因是提高酵母抗逆性的有效策略[15]。

3 gTME在代謝調(diào)控中的應(yīng)用

gTME有強(qiáng)定向性,能高效生產(chǎn)各種代謝產(chǎn)物和縮短改造周期(表1)。MCKENNA等[16]利用gTME技術(shù)構(gòu)建RpoD文庫(kù)篩選高效表達(dá)抗體的大腸桿菌,改造后RpoD僅包含第4區(qū)567-613氨基酸組成的截短體。在突變株基礎(chǔ)上過表達(dá)促進(jìn)蛋白質(zhì)折疊和組裝基因DsbA、DsbC和FkpA,得到最高抗體滴度達(dá)130.7 mg/L,效價(jià)比出發(fā)菌株提高13倍。gTME應(yīng)用在改善微生物糖酸轉(zhuǎn)化率,如YU等[17]構(gòu)建大腸桿菌RpoD和RpoS的隨機(jī)突變庫(kù),其中rpoD突變株D72透明質(zhì)酸產(chǎn)量最高,相比對(duì)照組提高35%。而單獨(dú)rpoD和rpoS過表達(dá)菌株產(chǎn)量增長(zhǎng)不明顯,證明gTME技術(shù)可促進(jìn)透明質(zhì)酸積累。周筱飛等[18]通過gTME改造sigA,篩選出高產(chǎn)L-異亮氨酸的黃色短桿菌ART-1,產(chǎn)量達(dá)24.1 g/L,比出發(fā)菌株提高33.9%。目前gTME積累有益突變是非線性函數(shù)優(yōu)化最快速基因改造方式之一,已成為提高底物消耗或積累能力、激活合成目標(biāo)產(chǎn)物的高效方法。

表1 gTME提高工業(yè)微生物代謝的應(yīng)用Table 1 Application of gTME in improving industrial microbial metabolism

4 gTME中定向進(jìn)化和高通量篩選的應(yīng)用

gTME可通過體外隨機(jī)突變技術(shù)引入遺傳多樣性,改進(jìn)目標(biāo)性能(表2)。例如,易錯(cuò)PCR和DNA改組對(duì)σ因子和全局轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行堿基突變或DNA片段重組,操作簡(jiǎn)單且不需要深入了解序列和結(jié)構(gòu)。隨機(jī)片段交換法(random insertional strand exchange mutagenesis,RAISE)將目標(biāo)基因破碎、添加隨機(jī)短序列和重新組裝,可匯集多種突變形式,豐富gTME文庫(kù)種類。GAO等[20]利用RAISE技術(shù)對(duì)大腸桿菌rpoD隨機(jī)突變,將末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶隨機(jī)添加到rpoD的3’末端,進(jìn)行重新組裝生成突變文庫(kù)。采用低pH值脈沖對(duì)104液體突變庫(kù)進(jìn)行表型篩選,最強(qiáng)耐酸菌株在pH=4條件下生長(zhǎng)速率可提高2.8倍。可調(diào)基因間隔區(qū)(tunable intergenic regions,TIGRs)是指基因與基因間的一段非編碼序列,通過在全局因子σ70后插入TIGRs實(shí)現(xiàn)gTME改造,改變轉(zhuǎn)錄終止、mRNA穩(wěn)定性和翻譯起始過程,增強(qiáng)甲羥戊酸代謝途徑上游atoB、hMGS和tHMGR等多個(gè)基因的表達(dá)轉(zhuǎn)錄,使甲羥戊酸產(chǎn)量增加了7倍[35]。隨著CRISPR/Cas介導(dǎo)的EvlovR、CRISPR-X和CasPER等新型進(jìn)化技術(shù)出現(xiàn),gTME改造可以同時(shí)靶向多個(gè)sgRNA誘發(fā)基因組位點(diǎn)突變,實(shí)現(xiàn)多重基因組工程,完成高效定向進(jìn)化。HALPERIN等[36]使用EvolvR靶向進(jìn)化rspE和rspL(核糖體蛋白亞基),與野生型相比全局突變率提高223倍,在20 mg/mL 壯觀霉素抗性下菌株數(shù)量提高16 000倍,顯著提高大腸桿菌耐藥性。因此,gTME可通過多種策略擴(kuò)大目標(biāo)突變范圍,提高微生物的定向進(jìn)化能力。

表2 gTME改造方法Table 2 gTME modification methods

gTME應(yīng)用局限主要為篩選難度和分析成本,實(shí)現(xiàn)gTME高通量篩選可以在滿足遺傳多樣性的同時(shí),實(shí)現(xiàn)高效大規(guī)模篩選(圖2)。gTME的高通量篩選分為三類：(1)gTME改造可標(biāo)記表型,根據(jù)瓊脂平板水解圈、抑制圈的大小及菌落形態(tài)等表型對(duì)乙醇和乳酸等耐受程度進(jìn)行快速篩選。YIN等[37]利用gTME改造黃色短桿菌中σ因子編碼基因sigA,將突變文庫(kù)涂布營(yíng)養(yǎng)缺陷平板,根據(jù)菌落生長(zhǎng)圈直徑大小推斷異亮氨酸產(chǎn)量高低,篩選出突變株BF3的L-異亮氨酸產(chǎn)量達(dá)4.5 g/L,比出發(fā)菌株提高60%。(2)gTME改造代謝產(chǎn)量,通過測(cè)定可見光譜或熒光光譜吸光值對(duì)代謝產(chǎn)物實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)。HUANG等[38]利用gTME改造大腸桿菌CRP,用酶標(biāo)儀測(cè)定472 nm處吸光值定量番茄紅素產(chǎn)量,24 h完成105文庫(kù)篩選,獲得的高產(chǎn)菌株MT-1番茄紅素產(chǎn)量達(dá)到18.49 mg/g DCW。CHOI等[39]利用gTME改造σ70因子篩選高產(chǎn)3-羥基丁酸脂(poly-3-hydroxybutyrate,PHB)菌株,采用尼羅紅作為親脂熒光染料與PHB結(jié)合產(chǎn)生熒光,通過熒光強(qiáng)度反映細(xì)胞PHB產(chǎn)量,對(duì)5×105文庫(kù)高效率篩選得到最優(yōu)菌株M54,PHB產(chǎn)量比出發(fā)菌株提高2.5倍。(3)gTME使用熒光生物傳感器將生物表型信號(hào)轉(zhuǎn)化為熒光信號(hào),實(shí)現(xiàn)基因型和表型關(guān)聯(lián)。ZHANG等[40]采用改造NCgl0581(L-絲氨酸特異性轉(zhuǎn)錄因子)和黃色熒光蛋白相融合,構(gòu)建生物傳感器質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌生成gTME文庫(kù),采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行熒光分選,以每秒數(shù)千次分辨速度完成1.2×105文庫(kù)篩選,篩選到的A36-pDser菌株可積累34.78 g/L絲氨酸,比出發(fā)菌株提高66.7%。此外,分子克隆和微生物篩選自動(dòng)化平臺(tái)和工作站等高新技術(shù)設(shè)備使高通量篩選更加快捷高效,進(jìn)一步拓展gTME工業(yè)應(yīng)用。

圖2 gTME篩選流程Fig.2 Screening process of gTME

5 結(jié)論

gTME在微生物改造中具有廣闊的應(yīng)用前景,可顯著擴(kuò)大遺傳和性狀多樣性。本文主要介紹gTME全局調(diào)控機(jī)制,結(jié)合定向進(jìn)化和高通量篩選實(shí)現(xiàn)在應(yīng)變工程和代謝途徑中應(yīng)用。在傳統(tǒng)基因工程技術(shù)中,受到載體構(gòu)建和轉(zhuǎn)化效率等條件的限制,無(wú)法同時(shí)在多個(gè)基因位點(diǎn)進(jìn)行改造,且對(duì)多基因控制表型的作用有限,而gTME在多基因控制生物合成和菌株育種等方面顯示出強(qiáng)大潛力。隨著gTME調(diào)控機(jī)制的深入研究及定向進(jìn)化和高通量篩選的快速發(fā)展,未來gTME研究方向可以(1)著眼于各項(xiàng)轉(zhuǎn)錄因子的具體功能,進(jìn)一步豐富全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件,為利用gTME改善特定表型提供理論基礎(chǔ);(2)深入探索RNAP其他亞基進(jìn)行g(shù)TME研究的可行性,對(duì)轉(zhuǎn)錄關(guān)鍵環(huán)節(jié)突變產(chǎn)生更加寬泛的全局?jǐn)_動(dòng);(3)拓展多策略組合的改造方式,精準(zhǔn)高效篩選出各種理想表型和生理特性的菌株;(4)結(jié)合生物信息學(xué)、計(jì)算生物學(xué)和蛋白質(zhì)功能結(jié)構(gòu)等方法,完善gTME技術(shù)體系,提高目標(biāo)產(chǎn)物的生產(chǎn)效率;(5)完善基因編輯定向改造工具和高通量技術(shù),快速優(yōu)化特定表型。在此基礎(chǔ)上,進(jìn)一步闡明細(xì)胞代謝網(wǎng)絡(luò)的分子機(jī)制、穩(wěn)定性和相互作用關(guān)系,為gTME在食品與發(fā)酵工業(yè)應(yīng)用提供新思路。