超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定牛奶中氮氨菲啶殘留量不確定度評定

張艷芳,呂耀龍*,李照,白榮國

1(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學 職業(yè)技術(shù)學院,內(nèi)蒙古 包頭,014109)2(內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)(集團)股份有限公司,內(nèi)蒙古 呼和浩特,011517)

氮氨菲啶(isometamidium,ISM)是由一組復合的異構(gòu)體構(gòu)成[1-2],是一種長效抗錐蟲藥,通過抑制錐蟲DNA和RNA聚合酶,阻礙核酸的合成[3],作為預防和治療化學藥物被廣泛應用于牛羊等動物寄生蟲病的防治,同時也可對動物睡眠病進行預防和治療[4-6]。然而,氮氨菲啶作為牛羊動物寄生蟲防治藥物的同時,也伴隨著有致癌、致畸形和致突變等副作用[7]。濫用防治藥物對動物本身造成影響的同時,殘留物在動物性食品中對人類健康造成潛在的危害。

測量結(jié)果的不確定度可以保證檢測結(jié)果更加準確,同時,不確定度評價也可以判定測量結(jié)果質(zhì)量的高低,與檢驗結(jié)果的合格判定相關(guān)[8-10]。目前牛奶中氮氨菲啶含量的測定大多采用高效液相色譜法、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等,而采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定結(jié)果的不確定度評定較少。本實驗參照JJF 1059.1—2012《測量不確定度評定與表示》和JJF 1135—2005《化學分析測量不確定度評定》,按照GB 31660.8—2019《?？墒承越M織及牛奶中氮氨菲啶殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》中規(guī)定的檢測方法,評定牛奶中氮氨菲啶藥物的殘留檢測結(jié)果不確定度,為實驗室檢測質(zhì)量控制提供科學依據(jù)的同時,也為測量其他獸藥殘留量不確定度提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器

1.1.1 材料

牛奶,市售;氮氨菲啶,純度98%,壇默質(zhì)檢標準物質(zhì)中心;甲醇(色譜純),正己烷(色譜純),福晨(天津)化學試劑有限公司。

1.1.2 儀器設(shè)備

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備

準確稱取5 g牛奶試樣(精確到0.01 g)于50 mL的離心管中,加入20 mL提取液蓋好混勻,放于振蕩器上300 r/min振蕩10 min,以10 000 r/min離心5 min,將上層溶液用濾紙過濾于雞心瓶,殘渣再用20 mL提取液超聲提取10 min,以10 000 r/min離心5 min,將上層溶液用濾紙過濾,合并2次濾液,于<40 ℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干(約剩余2 mL以下),剩余液轉(zhuǎn)移至10 mL具塞刻度離心管中,用甲醇洗滌雞心瓶,合并溶液用甲醇定容至5.00 mL,漩渦混勻1 min,然后加入5 mL飽和了80%甲醇水的正己烷溶液,旋渦混勻1 min,以3 000 r/min離心3 min,棄去上層正己烷,再加入5 mL飽和了80%甲醇水的正己烷溶液,漩渦混勻1 min,以3 000 r/min離心3 min,取下層溶液過0.2 μm濾膜,供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。

1.2.2 液相色譜條件

A相：甲醇;B相：0.1%甲酸水;流速0.4 mL/min;柱溫35 ℃,其他參數(shù)見表1。

表1 梯度洗脫參考條件Table 1 Reference conditions of gradient elution

1.2.3 質(zhì)譜條件

選擇ESI離子源正離子掃描模式,離子源溫度110 ℃,電源電壓2.8 kV,霧化溫度350 ℃,錐孔氣流速50 L/h,霧化氣流速550 L/h,駐留時間0.3 s,多反應檢測(multiple reaction monitoring,MRM)采集參數(shù)見表2。

表2 氮氨菲啶的質(zhì)譜采集參數(shù)Table 2 Acquisition parameters of isometamidium for UPLC-MS/MS

1.2.4 測量樣品

樣品經(jīng)過凈化濃縮后用甲醇定容至5.00 mL,經(jīng)0.22 μm有機相濾膜過濾于測樣瓶,將樣品導入檢測器中,其峰面積與氮氨菲啶濃度成正比。

1.2.5 標樣制備

用1 mL刻度吸管吸取1 mL氮氨菲啶標準儲備液,置于100 mL A級容量瓶中,用甲醇定容至刻度,制成1 μg/mL氮氨菲啶標準工作溶液。再用100 μL移液器準確吸取100 μL氮氨菲啶標準工作液,置于10 mL A級容量瓶中,用陰性樣品基質(zhì)定容至刻度,制成10 ng/mL氮氨菲啶基質(zhì)標準工作溶液。

1.2.6 試樣分析

校準曲線取7個點,每個濃度點進樣2次,以響應值的峰面積對樣品濃度繪制工作曲線,外標法定量。2次空白對照試驗,并計算均值。

1.2.7 實驗條件、引用數(shù)據(jù)

室溫下進行本實驗,氮氨菲啶加標回收率(83.2%～100%)。

1.2.8 數(shù)學模型的建立

(1)

式中：X,試樣中被測組分殘留量,mg/kg;ρ,被測組分的溶液質(zhì)量濃度,μg/mL;V,樣品溶液定容體積,mL;m,樣品溶液所代表試樣質(zhì)量,g;F,換算系數(shù),牛奶F=1;計算結(jié)果扣除空白值。

1.2.9 樣品的標準不確定度(uncertainty,u)來源

根據(jù)試驗檢測的步驟和建立的數(shù)學模型,超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定牛奶中氮氨菲啶殘留量標準不確定度主要有以下幾個方面：(1)氮氨菲啶進樣濃度標準不確定度u0;(2)測量重復性的標準不確定度u1;(3)V(樣品定容體積)的標準不確定度u2;(4)質(zhì)量的標準不確定度u3;(5)氮氨菲啶標準儲備液的標準不確定度u4;(6)超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的不確定度u5;(7)取樣引入的標準不確定度u6;(8)實驗回收率引入的標準不確定度u7。

2 結(jié)果與分析

2.1 不確定度的評定

2.1.1 氮氨菲啶進樣濃度標準不確定度u0

制備7個不同質(zhì)量濃度氮氨菲啶標準溶液,每個濃度測定1次,得到相應的峰面積A,用最小二乘法擬合,得到擬合曲線方程A=a+b×ρ=621 026.2×ρ-140.9;r=0.999,如表3所示。

表3 不同濃度測得峰面積Table 3 Peak areas under different concentration of ISM

平行取2份樣品測定,所得的峰面積為11 133和10 633。利用擬合曲線校準的測定液氮氨菲啶含量分別為0.018 2和0.017 4 μg/mL,平均值為0.017 8 μg/mL。

(2)

平行測定的測定液濃度確定時的不確定度包含3個分量：定容的刻度離心管引入的標準不確定度、校準直線引入的不確定度、標準溶液在20 ℃的環(huán)境條件下引入的不確定度。

2.1.1.1 刻度離心管引入的標準不確定度

2.1.1.2 校準直線引入的不確定度

由于擬合曲線本身具有一定的不確定性,用擬合直線計算測定液的濃度所引入的標準不確定度按公式(3)計算：

(3)

式中殘余標準偏差按公式(4)計算:

(4)

2.1.1.3 溫度的變動引起標準溶液的不確定度

給出氮氨菲啶標準溶液在20 ℃時的濃度,實驗室溫度變化±5 ℃之間不需要溫度修正。甲醇體積膨脹系數(shù)1.1×10-3/℃,假設(shè)均勻分布,由溫度變化引起的標準溶液濃度相對不確定度按公式(5)計算:

(5)

顯然,氮氨菲啶進樣濃度標準不確定度應由以上3個分量合成計算,按公式(6)所示:

(6)

2.1.2 測量重復性的標準不確定度u1

重復性條件下,對樣品進行10次測量,測量結(jié)果如表4,其平均值為0.017 7。

表4 重復性條件下10次加標樣品測量數(shù)據(jù) 單位：mg/kg

2.1.3 樣品定容體積(V)標準不確定度u2

定容體積引入不確定度分量有：所用定容體積的量器、定容溶液隨溫度變化的影響。

2.1.3.1 所用定容體積不確定度

2.1.3.2 溫度的影響

2.1.4 質(zhì)量的標準不確定度u3

2.1.5 氮氨菲啶標準儲備液標準不確定度u4

氮氨菲啶標準儲備液擴展不確定度是0.5%,k=3,u4=0.005/3=0.001 67,那么u4rel=0.001 6/100=0.000 016。

2.1.6 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀不確定度u5

由超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜儀引起的分量不確定度u5=4.8%,k=3,那么u5rel=0.048/3=0.016。

2.1.7 取樣引入的標準不確定度u6

GB/T 22974—2008牛奶和奶粉中氮氨菲啶殘留量的測定,將牛奶隨機取樣,可認為樣品均勻,取樣的不確定度可忽略。

2.1.8 回收率引入的標準不確定度u7

2.2 合成標準不確定度uc(y)

氮氨菲啶的相對不確定度分量表如表5,假如不考慮各不確定度相關(guān)性,其合成不確定度按式(7)計算,結(jié)果為0.003 9 mg/kg。

uc(y)=0.017 8×0.218=0.003 9 mg/kg

(7)

表5 各不確定度分量值Table 5 Values of each uncertainty component

2.3 擴展不確定度(U)及結(jié)果表示

根據(jù)CNAS-GL006:2018《化學分析中不確定度的評估指南》,取k=2時,擴展不確定度U=k×uc(y)=2×0.003 9=0.007 8 mg/kg。測量結(jié)果為：y=0.017 8 mg/kg,U=0.007 8 mg/kg,k=2。

3 結(jié)論

在市售牛奶樣品氮氨菲啶殘留量檢測過程中,校準曲線的擬合、標準溶液的配制、超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜、實驗回收率引入等各過程都會引入測量的不確定度。本實驗綜合各因素考慮,發(fā)現(xiàn)在測定牛奶中氮氨菲啶殘留量檢測過程中,標準曲線引入的不確定度最大,其次是回收率實驗,標準儲備液引入的不確定度最小,取樣引入的不確定度可忽略不計。因此,在實驗過程中,需要實驗操作人員適當增加試驗的平行次數(shù)以及準確加標回收率試驗,定期維護檢測儀器的性能,使其有較高的靈敏度和精密度,做好儀器期間核查和校準檢定,減少因儀器引入的不確定度,提高檢測結(jié)果的準確度。