營(yíng)養(yǎng)脅迫對(duì)糞腸球菌Gr17細(xì)菌素合成的調(diào)控

段嬌嬌,聶蓉,劉國(guó)榮,王昭,朱澤康

(北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心 北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心 北京工商大學(xué),北京,100048)

細(xì)菌素是一種由細(xì)菌核糖體分泌的對(duì)近源微生物具有抑制作用的蛋白質(zhì)或多肽類物質(zhì),具有安全性高,易被人體消化吸收等優(yōu)點(diǎn),可作為天然食品防腐劑用于食品生產(chǎn)中[1]。乳酸菌細(xì)菌素由于具有良好的耐熱性、廣譜抑菌活性等優(yōu)點(diǎn)而成為研究熱點(diǎn)[2]。實(shí)驗(yàn)室前期從白酒酒醅中分離出1株高產(chǎn)細(xì)菌素的糞腸球菌Gr17(EnterococcusfaecalisGr17),其所產(chǎn)細(xì)菌素屬于Ⅱa類乳酸菌細(xì)菌素,能夠抑制多種食品腐敗菌和食源性致病菌[3]。但菌株在自然環(huán)境和食品生產(chǎn)中常常會(huì)面臨多種環(huán)境脅迫,如酸脅迫[4]、滲透壓脅迫[5]、高壓脅迫[6]、冷脅迫[7]等。細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖和代謝活動(dòng)均依賴于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),營(yíng)養(yǎng)脅迫下細(xì)菌代謝活動(dòng)產(chǎn)生變化,影響菌體生長(zhǎng)及細(xì)菌素合成。馬佳歌等[8]研究表明在缺乏葡萄糖的條件下LactiplantibacillusplantarumKLDS 1.0328的生長(zhǎng)和細(xì)菌素抑菌活性均受到抑制。KUMAR等[9]發(fā)現(xiàn)碳源脅迫(1/2葡萄糖)和氮源脅迫(1/2蛋白胨、牛肉膏、酵母浸粉)對(duì)PediococcuspentosaceusNKSM1的生長(zhǎng)與細(xì)菌素合成均有不利影響。VERLUYTEN等[10]研究表明復(fù)合營(yíng)養(yǎng)脅迫(1/2 MRS)抑制LactobacilluscurvatusLTH 1174生長(zhǎng),但可促進(jìn)細(xì)菌素合成。由于菌株本身的特異性,不同脅迫條件對(duì)菌體生長(zhǎng)及細(xì)菌素合成調(diào)控作用不同。

群體感應(yīng)(quorum sensing,QS)是細(xì)菌的一種調(diào)節(jié)機(jī)制,細(xì)胞通過(guò)隨菌體密度波動(dòng)的特定信號(hào)分子誘導(dǎo)特定基因表達(dá),從而實(shí)現(xiàn)對(duì)生物膜形成、胞外多糖形成、細(xì)菌素合成等一系列微生物行為的調(diào)控[11-13]。QS是乳酸菌細(xì)菌素合成的關(guān)鍵調(diào)控機(jī)制,目前普遍認(rèn)為與乳酸菌細(xì)菌素合成相關(guān)的QS調(diào)控系統(tǒng)由自誘導(dǎo)肽(autoinducing peptides,AIPs)和雙組份信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)(two component system,TCS)組成[14]。TCS包括組氨酸蛋白激酶(histidine protein kinase,HPK)和感應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白(response regulator protein,RR)。AIPs隨菌體密度增大而增加,當(dāng)達(dá)到一定閾值后,激活細(xì)胞膜上的HPK,使其發(fā)生自我磷酸化。磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移至RR信號(hào)輸出區(qū)域的保守天冬氨酸殘基位點(diǎn),使其發(fā)生磷酸化。磷酸化的RR與目的基因特定位點(diǎn)結(jié)合,激活細(xì)菌素基因表達(dá)。已有研究表明營(yíng)養(yǎng)脅迫可以對(duì)乳酸菌QS系統(tǒng)產(chǎn)生影響[15-16]。由此QS系統(tǒng)可能在營(yíng)養(yǎng)脅迫調(diào)控細(xì)菌素的合成中起重要作用。但目前關(guān)于營(yíng)養(yǎng)脅迫如何通過(guò)QS系統(tǒng)調(diào)控細(xì)菌素合成少有研究報(bào)道。

基于上述原因,本研究以糞腸球菌Gr17為研究對(duì)象,測(cè)定了營(yíng)養(yǎng)脅迫對(duì)其生長(zhǎng)及細(xì)菌素活性的影響,篩選可正向調(diào)控細(xì)菌素合成的營(yíng)養(yǎng)脅迫條件,并初步探究這一正向調(diào)控的具體機(jī)制,以期為營(yíng)養(yǎng)脅迫對(duì)細(xì)菌素合成的調(diào)控相關(guān)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

腸球菌Gr17,由本實(shí)驗(yàn)室保存于-80 ℃;大腸桿菌(Escherichiacoli)1.90,中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心;NaOH、NaCl,天津大茂化學(xué)試劑廠;TSB培養(yǎng)基、TSA培養(yǎng)基、MRS肉湯培養(yǎng)基,杭州百思生物;細(xì)菌總RNA提取試劑盒、FastKing一步法反轉(zhuǎn)錄-熒光定量試劑盒(FP314)、SuperReal彩色熒光定量預(yù)混試劑(SYBR Green),天根生化科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TG-16G離心機(jī),常州隆和儀器制造有限公司;TG600酶標(biāo)儀,云鉑儀器有限公司;FastDry-1真空離心濃縮儀,北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;HJ-6AB多頭磁力攪拌器,金壇市華城潤(rùn)華實(shí)驗(yàn)儀器廠;HZQ-F400全溫振蕩培養(yǎng)箱,常州普天儀器制造有限公司;CFX96 Real-Time System、C1000 Touch PCR儀,美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌種的活化

將甘油管中的糞腸球菌Gr17以1%接種量接種于已滅菌的MRS液體培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)18 h,連續(xù)活化2代后用于實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 營(yíng)養(yǎng)脅迫處理菌株

用9 g/L的生理鹽水稀釋MRS培養(yǎng)基(營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度48.3 g/L),得1/4 MRS、1/2 MRS和3/4 MRS,質(zhì)量濃度分別為12.075、24.15、36.225 g/L。將活化后的Gr17以1%的接種量接種于不同濃度的培養(yǎng)基中,37 ℃靜置培養(yǎng)28 h。

1.3.3 菌體生長(zhǎng)測(cè)定

取1.3.2所得發(fā)酵液200 μL加入96孔板中,用酶標(biāo)儀測(cè)定其OD600 nm。

1.3.4 抑菌活性的測(cè)定

取1.3.2所得發(fā)酵液,8 000 r/min離心10 min,用0.1 mol/L的NaOH溶液將上清液pH調(diào)至7.0,采用真空離心濃縮儀濃縮25倍,得細(xì)菌素粗提液。按參考文獻(xiàn)[17-18]采用瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定粗提液抑菌活性,以大腸桿菌1.90為指示菌。

1.3.5 正常條件與最佳脅迫條件下細(xì)菌生長(zhǎng)性能比較

按1%接種量將Gr17分別接種于MRS和1/4 MRS液體培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)40 h,每隔4 h取樣,按1.3.3與1.3.4中方法測(cè)定樣品菌體生長(zhǎng)情況及抑菌活性。

1.3.6 正常條件與最佳脅迫條件下部分基因表達(dá)的比較

由實(shí)驗(yàn)室對(duì)Gr17進(jìn)行的全基因組測(cè)序結(jié)果,該菌具有10個(gè)與細(xì)菌素合成有關(guān)的基因,entI、entJ和entGr17編碼細(xì)菌素結(jié)構(gòu)蛋白,分別編碼細(xì)菌素enterocin L50A、enterocin L50B,enterocin Gr17;AS-48E、AS-48F、AS-48G、AS-48H共同編碼ABC(ATP-Binding Cassette)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及其輔助蛋白;hpk和rr分別編碼TCS中的HPK和RR;AIP編碼自誘導(dǎo)肽。在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究這10個(gè)基因在最佳營(yíng)養(yǎng)脅迫條件下表達(dá)量的變化。

1.3.6.1 總RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄

按1%接種量將Gr17分別接種于MRS和1/4 MRS液體培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)48 h,每隔6 h取樣,按天根細(xì)菌總RNA提取試劑盒(DP430)說(shuō)明書提取總RNA,將提取的RNA在冰浴上按FastKing一步法反轉(zhuǎn)錄-熒光定量試劑盒(FP314)說(shuō)明書混合體系并合成cDNA。

1.3.6.2 RT-qPCR引物設(shè)計(jì)

采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)RT-qPCR引物,設(shè)計(jì)結(jié)果如表1。

表1 RT-qPCR引物Table 1 RT-qPCR primers

續(xù)表1

1.3.6.3 RT-qPCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)

以16S rRNA為內(nèi)參基因[19],按SuperReal彩色熒光定量預(yù)混試劑試劑盒說(shuō)明書配制反應(yīng)體系,具體見(jiàn)表2,RT-qPCR參數(shù)如表3。記錄數(shù)據(jù)并分析得到的Ct值,以2-ΔΔCt相對(duì)定量法分析目的基因表達(dá)量的變化。按公式(1)計(jì)算：

F=2-ΔΔCt=

2-(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)實(shí)驗(yàn)組-(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)對(duì)照組

(1)

表2 RT-qPCR反應(yīng)體系Table 2 RT-qPCR reaction system

表3 RT-qPCR參數(shù)Table 3 RT-qPCR parameters

1.4 數(shù)據(jù)分析

結(jié)果均為3 次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的平均值,采用Origin 8.5進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和作圖,并利用SPSS 17.0進(jìn)行方差分析。P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 營(yíng)養(yǎng)脅迫對(duì)Gr17的生長(zhǎng)及細(xì)菌素合成的影響

由圖1可知,相同條件下培養(yǎng)28 h后,對(duì)照組Gr17的菌體密度最大,處理組菌體密度隨培養(yǎng)基初始營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度降低逐漸減小,表明營(yíng)養(yǎng)脅迫條件抑制菌體生長(zhǎng)。1/2 MRS和3/4 MRS的脅迫條件下細(xì)菌素抑菌活性均低于對(duì)照組且變化趨勢(shì)與菌體密度一致。但菌株在1/4 MRS中所產(chǎn)細(xì)菌素抑菌活性最大(效價(jià)704 AU/mL),較對(duì)照組增加80 AU/mL?；谏鲜鼋Y(jié)果,選擇1/4 MRS作為最佳脅迫條件進(jìn)行后續(xù)研究。

圖1 營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度對(duì)腸球菌Gr17生長(zhǎng)和細(xì)菌素合成的影響Fig.1 Effects of nutrient concentrations on the growth and bacteriocin synthesis of E.faecalis Gr17

2.2 可正向調(diào)控細(xì)菌素合成的最佳脅迫條件對(duì)Gr17的生長(zhǎng)及細(xì)菌素合成的影響

測(cè)定不同時(shí)間下MRS和1/4 MRS中的菌體密度和細(xì)菌素抑菌活性(圖2),結(jié)果表明脅迫處理的菌株生長(zhǎng)至24 h開(kāi)始進(jìn)入穩(wěn)定期,較對(duì)照組延遲4 h,OD600 nm值也顯著降低(P<0.05),最大OD600 nm僅為0.725,較對(duì)照組最大OD600 nm(0.883)顯著降低(P<0.05)(圖2-a)。表明1/4 MRS的脅迫條件會(huì)抑制Gr17生長(zhǎng)。

a-生長(zhǎng)情況;b-細(xì)菌素抑菌活性圖2 正常條件與營(yíng)養(yǎng)脅迫下腸球菌Gr17生長(zhǎng)情況與細(xì)菌素抑菌活性Fig.2 Growth and bacteriocin activity of E.faecalis Gr17 under normal and nutritional stress condition

由圖2-b可知,在MRS中,菌株自8 h開(kāi)始合成細(xì)菌素,28 h細(xì)菌素抑菌活性達(dá)到最高(640 AU/mL),此后細(xì)菌素產(chǎn)量隨菌體密度減小逐漸下降。1/4 MRS中,菌株自12 h開(kāi)始合成細(xì)菌素,較對(duì)照組延后4 h,原因?yàn)楫?dāng)菌體細(xì)胞達(dá)到一定密度,AIPs積累至一定閾值激活QS,細(xì)菌素才開(kāi)始合成,營(yíng)養(yǎng)脅迫下菌株生長(zhǎng)狀況差,從而菌體密度達(dá)到細(xì)菌素開(kāi)始合成的閾值的時(shí)間延長(zhǎng)(圖2-b)。自20 h,同一時(shí)間脅迫條件下的細(xì)菌素抑菌活性更強(qiáng),且其在36 h時(shí)達(dá)到的最大抑菌活性(720 AU/mL)顯著高于對(duì)照組的最大抑菌活性(640 AU/mL)(P<0.05),表明1/4 MRS這一脅迫條件可促進(jìn)細(xì)菌素的合成分泌(圖2-b)。

2.3 可正向調(diào)控細(xì)菌素合成的最佳脅迫條件對(duì)Gr17細(xì)菌素合成相關(guān)基因表達(dá)的影響

2.3.1 編碼自誘導(dǎo)肽相關(guān)基因的表達(dá)

基因AIP在MRS和1/4 MRS下的表達(dá)量如圖3所示,兩種條件下AIP的表達(dá)趨勢(shì)均與菌體密度的變化趨勢(shì)基本一致。12 h前,營(yíng)養(yǎng)脅迫下菌體密度較對(duì)照組減小(圖2-a),AIPs積累量較低,這與圖3營(yíng)養(yǎng)脅迫條件下AIP的表達(dá)量低于對(duì)照組結(jié)果一致。自18 h,1/4 MRS中AIP的表達(dá)量卻較對(duì)照組顯著上調(diào)(P<0.05),表明1/4 MRS下AIP的表達(dá)受到正向調(diào)控。

a-6 h;b-12 h;c-18 h;d-24 h;e-36 h;f-48 h圖3 正常條件與營(yíng)養(yǎng)脅迫下基因hpk、rr、AIP表達(dá)量變化Fig.3 Changes in the expression of genes hpk,rr and AIP under normal and nutritional stress conditions

2.3.2 編碼雙組分系統(tǒng)中組氨酸蛋白激酶和感應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白基因的表達(dá)

如圖3所示,hpk與rr的表達(dá)量變化趨勢(shì)與AIP的趨勢(shì)基本一致。6～12 h,與對(duì)照組相比,營(yíng)養(yǎng)脅迫條件下hpk和rr表達(dá)量較低,這可能是因?yàn)闋I(yíng)養(yǎng)脅迫影響菌體生長(zhǎng),導(dǎo)致AIPs積累量低,hpk和rr未被大量激活。18 h起,AIP表達(dá)量上調(diào),AIPs合成量增加,hpk與rr被大量激活,表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.05)。表明1/4 MRS這一脅迫條件可能通過(guò)影響AIP正向調(diào)控hpk與rr的表達(dá)。

2.3.3 編碼細(xì)菌素相關(guān)基因的表達(dá)

entI、entJ和entGr17在MRS和1/4 MRS中的表達(dá)量如圖4,兩種條件下entI、entJ和entGr17的表達(dá)趨勢(shì)與細(xì)菌素產(chǎn)量的趨勢(shì)基本一致。6～12 h,營(yíng)養(yǎng)脅迫條件下entI、entJ和entGr17的表達(dá)量低于正常培養(yǎng)條件;但自18 h,營(yíng)養(yǎng)脅迫條件下entI、entJ和entGr17的表達(dá)量較對(duì)照組均出現(xiàn)顯著上調(diào)(P<0.05)。這一結(jié)果與2.3.1和2.3.2中結(jié)論相符,推測(cè)1/4 MRS這一營(yíng)養(yǎng)脅迫條件通過(guò)上調(diào)AIP的表達(dá),進(jìn)而上調(diào)hpk、rr的表達(dá),最終實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)菌素結(jié)構(gòu)基因的調(diào)控。

2.3.4 編碼ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及其輔助蛋白相關(guān)基因的表達(dá)

AS-48E、AS-48F、AS-48G、AS-48H在MRS和1/4 MRS下的表達(dá)量如圖5所示,兩種條件下這4個(gè)基因的表達(dá)均與細(xì)菌素產(chǎn)量的趨勢(shì)基本一致。6 h之前,QS系統(tǒng)尚未啟動(dòng),細(xì)菌素未開(kāi)始合成,僅有少量AIPs需借助ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)運(yùn)送至胞外,而脅迫條件下AIPs積累量較低,故AS-48E、AS-48F、AS-48G、AS-48H的表達(dá)量低于對(duì)照組。12～18 h,菌體密度已達(dá)到啟動(dòng)QS系統(tǒng)的閾值,這4個(gè)基因的表達(dá)量上調(diào),以合成足量ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與AIPs及細(xì)菌素的轉(zhuǎn)運(yùn),但此時(shí)僅有少量AIPs及細(xì)菌素需要運(yùn)輸,故上調(diào)不明顯。18 h后,大量AIPs及細(xì)菌素被生產(chǎn)出來(lái),對(duì)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白需求量增大,這4個(gè)基因的表達(dá)量較對(duì)照組顯著上調(diào)(P<0.05)。36 h左右,菌體生長(zhǎng)到達(dá)后期,AIPs減少,細(xì)菌素合成量降低,對(duì)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白需求量減小,AS-48E、AS-48F、AS-48G、AS-48H的表達(dá)量相應(yīng)下調(diào)。但營(yíng)養(yǎng)脅迫條件下AS-48E、AS-48F、AS-48G和AS-48H的表達(dá)量仍高于對(duì)照組。表明1/4 MRS可間接上調(diào)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)相關(guān)基因表達(dá)量(P<0.05)。

a-6 h;b-12 h;c-18 h;d-24 h;e-36 h;f-48 h圖4 正常條件與營(yíng)養(yǎng)脅迫下基因ent I、ent J和ent Gr17表達(dá)量變化Fig.4 Changes in the expression of genes ent I,ent J and ent Gr17 under normal and nutritional stress conditions

a-6 h;b-12 h;c-18 h;d-24 h;e-36 h;f-48 h圖5 正常條件與營(yíng)養(yǎng)脅迫下ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)相關(guān)基因表達(dá)量變化Fig.5 Changes in the expression of genes related to ABC transport system under normal and nutritional stress conditions

3 結(jié)論與討論

本研究表明,營(yíng)養(yǎng)脅迫抑制糞腸球菌Gr17的生長(zhǎng),MATARAGAS等[20]研究表明氮源脅迫可對(duì)L.curvatusL442產(chǎn)生生長(zhǎng)抑制;PARLINDUNGAN等[21]發(fā)現(xiàn)L.plantarumB21受到葡萄糖脅迫時(shí),細(xì)胞活力和生長(zhǎng)速度明顯降低;LEROY等[22]也發(fā)現(xiàn)糖和復(fù)合營(yíng)養(yǎng)素(蛋白胨、肉膏、酵母提取物)脅迫下,E.faeciumRZS C5細(xì)胞生長(zhǎng)下降,最大生物量減小,與本文研究結(jié)果相似。

關(guān)于營(yíng)養(yǎng)脅迫對(duì)乳酸菌細(xì)菌素合成的影響,有研究表明[21]葡萄糖脅迫對(duì)L.plantarumB21細(xì)菌素的合成無(wú)明顯影響;LEROY等[22]也發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基葡萄糖質(zhì)量濃度為2.5、5.0、10.0、20.0、30.0、40.0、80.0 g/L以及1/4、1/2復(fù)合氮源(蛋白胨、肉膏、酵母提取物)脅迫條件下,屎腸球菌RZS C5的細(xì)菌素產(chǎn)量無(wú)明顯變化。但葡萄糖及蛋白胨、酵母抽提物等氮源脅迫條件抑制細(xì)菌素的合成[8-9]。然而,KIM等[23]發(fā)現(xiàn)與總營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度較高時(shí)相比,營(yíng)養(yǎng)濃度較低時(shí)Lactococcuslactissubsp.lactisC2SmPrt-細(xì)菌素產(chǎn)量較高;LEROY等[24]測(cè)定了不同復(fù)合氮源(牛肉粉、蛋白胨、酵母提取物)濃度下LactobacillussakeiCTC 494的細(xì)菌素活性,結(jié)果表明低氮源濃度下細(xì)菌素活性更高。CALLEWAERT等[25]發(fā)現(xiàn)MRS中復(fù)合氮源(牛肉浸粉、蛋白胨、酵母提取物)增加,LactobacillusamylovorusDCE 471的特異性細(xì)菌素產(chǎn)量降低;VERLUYTEN等[10]發(fā)現(xiàn)L.curvatusLTH 1174在1/2 MRS中的細(xì)菌素產(chǎn)量較MRS中增加。不同研究中所得結(jié)論的差異可能與菌株本身特性和具體脅迫條件有關(guān)。目前很多研究通過(guò)富營(yíng)養(yǎng)條件或調(diào)整培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)成分及配比提高細(xì)菌素產(chǎn)量[26-28],但成本高且增產(chǎn)效果有限。本研究發(fā)現(xiàn)1/4 MRS下Gr17的細(xì)菌素活性顯著提高,表明適當(dāng)?shù)臓I(yíng)養(yǎng)脅迫條件可以正向調(diào)控細(xì)菌素合成。這是因?yàn)榧?xì)菌在自然環(huán)境下面臨多種競(jìng)爭(zhēng),細(xì)菌通過(guò)合成細(xì)菌素抑制其他細(xì)菌的生長(zhǎng)以達(dá)到自我保護(hù)的目的。營(yíng)養(yǎng)豐富時(shí),細(xì)菌缺少競(jìng)爭(zhēng)壓力,細(xì)菌素的合成分泌下降。但脅迫條件使細(xì)菌素生產(chǎn)機(jī)制處于活躍狀態(tài),細(xì)菌素產(chǎn)量由此增大。

對(duì)于營(yíng)養(yǎng)脅迫調(diào)控細(xì)菌素合成的機(jī)制目前無(wú)明確定論,基于本文研究結(jié)果,推測(cè)1/4 MRS營(yíng)養(yǎng)脅迫條件正向調(diào)控細(xì)菌素合成的機(jī)制為：營(yíng)養(yǎng)脅迫促使編碼AIPs的基因AIP上調(diào),AIPs合成量增大。AIPs積累達(dá)閾值后,激活HPK,HPK發(fā)生自磷酸化,接著激活RR,RR靶向激活細(xì)菌素結(jié)構(gòu)基因entI、entJ和entGr17,細(xì)菌素合成量增大。因?yàn)锳IPs和已合成的細(xì)菌素需借助ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)運(yùn)送至胞外,故編碼ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的基因表達(dá)量也發(fā)生上調(diào),具體見(jiàn)圖6。

圖6 營(yíng)養(yǎng)脅迫正向調(diào)控細(xì)菌素合成機(jī)制預(yù)測(cè)圖Fig.6 Prediction of the mechanism of nutrient stress positively regulating bacteriocin synthesis

本研究結(jié)果表明營(yíng)養(yǎng)脅迫可以通過(guò)種內(nèi)QS系統(tǒng)調(diào)控細(xì)菌素合成。目前有研究表明fsrQS系統(tǒng)在糞腸球菌合成抗菌肽的過(guò)程中具有調(diào)控作用,該系統(tǒng)通過(guò)fsrABCD4個(gè)基因調(diào)控編碼重要蛋白酶和抗菌蛋白的靶位點(diǎn)fsrBCD,gelE-sprEoperons,ef1097,進(jìn)而影響抗菌肽的合成[29-30]。還有研究表明由信號(hào)分子AI-2介導(dǎo)的LuxS種間QS系統(tǒng)可能參與饑餓環(huán)境下乳酸菌的應(yīng)激反應(yīng),YEO等[16]發(fā)現(xiàn)乳桿菌在饑餓脅迫下,QS系統(tǒng)中的AI-2活性升高。GU等[15]研究稀釋的MRS中AI-2活性顯著高于對(duì)照組,且QS相關(guān)基因LuxS過(guò)表達(dá)。營(yíng)養(yǎng)脅迫下還可能存在其他細(xì)菌素合成調(diào)控機(jī)制,隨著相關(guān)研究的深入,營(yíng)養(yǎng)脅迫有望成為一種有效提高細(xì)菌素產(chǎn)量的方法。