淡水養(yǎng)殖水體細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與硝化速率的關(guān)系

何夢(mèng)瑩， 熊 英， 程 凱

(湖北工業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境工程學(xué)院， 河湖生態(tài)修復(fù)與藻類利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 武漢 430068)

氮污染是淡水養(yǎng)殖水體中主要污染問題之一，由于餌料投放量大，水產(chǎn)品代謝產(chǎn)物及糞便增多，水體中的氨氮濃度會(huì)明顯升高[1]，而當(dāng)硝化過程受到抑制時(shí)，亞硝氮作為硝化過程的中間產(chǎn)物，可在水體中大量積累，當(dāng)其濃度超過0.1 mg·L-1時(shí)，即會(huì)對(duì)水產(chǎn)品造成危害[2].

通常，氨的氧化分為兩步：亞硝化和硝化.其中，亞硝化是將氨氮轉(zhuǎn)化為亞硝氮，主要是通過氨氧化菌(ammonia-oxidizing bacteria，AOB)及氨氧化古菌(ammonia oxidizing archaea，AOA)等實(shí)現(xiàn)的；硝化則是將亞硝氮轉(zhuǎn)化為硝氮，主要是通過亞硝酸鹽氧化菌(nitrite-oxidizing bacteria，NOB)等實(shí)現(xiàn)的[1].具體而言，Jennifer等[3]通過電子顯微及熒光定量PCR技術(shù)研究了淡水低溫循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)中的硝化作用，發(fā)現(xiàn)起主要硝化作用的細(xì)菌是Nitrotoga；而李敬源等[4]通過克隆測(cè)序，發(fā)現(xiàn)在對(duì)蝦養(yǎng)殖水體中起硝化作用的細(xì)菌是硝化桿菌(Nitrobacter)；Papitchaya等[5]采用分子探針技術(shù)，發(fā)現(xiàn)在養(yǎng)蝦池塘中起硝化作用的細(xì)菌是硝化螺菌(Nitrospira).

上述研究均采用的是傳統(tǒng)的分子生物學(xué)技術(shù)，而這些技術(shù)由于通量很低，往往會(huì)低估了養(yǎng)殖水體中細(xì)菌的多樣性.目前，高通量測(cè)序方法越來越受到關(guān)注，Sharada等[6]采用高通量測(cè)序，在半咸水生物膜反應(yīng)器中發(fā)現(xiàn)硝化速率隨硝化細(xì)菌的豐度增加而提高；Cai等[7]通過高通量測(cè)序，發(fā)現(xiàn)生物濾池富集培養(yǎng)物中的硝化作用增強(qiáng)是由亞硝酸鹽氧化菌(NOB)及氨氧化菌(AOB)的共同作用所致；而Huepeden等[8]則通過高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)，循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)中的硝化作用是由NOB和其他未知的細(xì)菌共同作用.目前為止，上述高通量測(cè)序的研究都是以富集培養(yǎng)物或工廠化養(yǎng)殖的循環(huán)水處理系統(tǒng)為研究對(duì)象，而缺乏對(duì)無循環(huán)系統(tǒng)的淡水養(yǎng)殖水體“原水”的研究.

對(duì)此，本文選取了三種養(yǎng)殖品種和管理方式均不相同的常見淡水養(yǎng)殖水體(分別為精養(yǎng)蝦蟹池、湖泊養(yǎng)殖水體和精養(yǎng)魚池)，通過高通量測(cè)序獲得了15個(gè)淡水養(yǎng)殖水體的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，并同步測(cè)定了水樣的硝化速率，有助于深入認(rèn)識(shí)不同養(yǎng)殖水體中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與硝化速率的關(guān)系.

1 材料與方法

1.1 水樣采集

在本地選擇了3類具有代表性的養(yǎng)殖水體，從以下三類養(yǎng)殖水體中取樣：A)精養(yǎng)蝦蟹池；B)湖泊養(yǎng)殖水體；C)精養(yǎng)魚池.分別于春季(4月份)及夏季(8月份)采取水樣.采用YSI Pro Plus多參數(shù)水質(zhì)檢測(cè)儀現(xiàn)場(chǎng)測(cè)定溶解氧(DO)、pH、溫度、電導(dǎo)率、氧化還原電位(ORP)，采用塞式盤測(cè)量透明度.

表1 各養(yǎng)殖水體類型的基本情況

1.2 水質(zhì)指標(biāo)的測(cè)定

所采集水樣的氨氮、亞硝氮、硝氮、CODMn、總氮、總磷及葉綠素a的測(cè)量方法如表2所示.

表2 水質(zhì)測(cè)量方法

1.3 總菌數(shù)的測(cè)定

采集水樣后立即加入最終濃度為2%的戊二醛固定，經(jīng)用2 000目(孔徑為8 μm)篩網(wǎng)過濾的水樣，取1 mL過濾后的水樣，加入SYBR Green I染料[9]使其濃度為1/10 000，放入40 ℃水浴鍋遮光加熱10 min，在黑暗中冷卻到室溫，采用BD FACS Calibar Flow Cytometer流式細(xì)胞儀(激發(fā)光為488 nm)測(cè)量BLPs (bacterium-like particles)的數(shù)量.

1.4 高通量測(cè)序

將所采集的水樣，使用HiPure Soil DNA Kit B試劑盒提取DNA，并用Qubit? dsDNA HS Assay Kit檢測(cè)DNA濃度.

采用上游引物F-CCTACGGRRBGCASCAGKVRVGAAT和下游引物R-GGACTACNVGGGTWTCTAATCC對(duì)原核生物16S rDNA的V3和V4區(qū)[10]進(jìn)行PCR擴(kuò)增[11]，PCR產(chǎn)物由江蘇金唯智生物科技有限公司測(cè)序.序列相似性設(shè)為97%，比對(duì)的16S rRNA參考數(shù)據(jù)庫(kù)是Silva 132.然后用RDP classifier (ribosomal database program)貝葉斯算法對(duì)OTU的代表性序列進(jìn)行物種分類學(xué)分析，并在不同物種分類水平下統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣本的群落組成.

1.5 硝化速率測(cè)定

水樣采集后的24 h內(nèi)，取100 mL原水至250 mL滅菌錐形瓶中，添加亞硝氮使其初始濃度達(dá)到20 mg·L-1，150 r·min-1振蕩培養(yǎng)8 d后測(cè)定亞硝氮濃度，并據(jù)此計(jì)算平均硝化速率[12].此外，還在實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)測(cè)定了硝氮濃度，確認(rèn)了亞硝氮被轉(zhuǎn)化為硝氮的效率達(dá)92%～100%.

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2016、Origin 2017及SPSS 2.0統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)及作圖，用Spearman相關(guān)性分析了硝化速率與細(xì)菌豐度之間的關(guān)系，用t檢驗(yàn)分析了水體類型及季節(jié)之間的差異.

2 結(jié)果與分析

2.1 基本水質(zhì)情況

各采樣點(diǎn)的水質(zhì)情況見表3.從季節(jié)上看，春季的pH、溶解氧、透明度、總氮均高于夏季(p<0.05)，而夏季的水溫、CODMn則高于春季(p<0.05).從養(yǎng)殖水體類型上看，湖泊養(yǎng)殖水體的電導(dǎo)率和亞硝氮高于另兩類水體，而精養(yǎng)蝦蟹池塘的透明度則較高.

2.2 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成

春夏季細(xì)菌總數(shù)見表3，春夏季總菌數(shù)的范圍為9.3×105～8.1×106BLPs·mL-1，不同季節(jié)和不同水體類型的總菌數(shù)均無顯著性差異(p>0.05).

表3 水質(zhì)情況

養(yǎng)殖水體中的細(xì)菌種類涵蓋31門，83綱，180目，281科，289屬(表4).其中優(yōu)勢(shì)菌群門為變形菌門(Proteobacteria，其豐度為22.54%～75.33%)、放線菌門(Acidobacteria，其豐度為11.85%～47.28%)和擬桿菌門(Bacteroidetes，其豐度為17.41%～39.05%)，見圖1.

表4 細(xì)菌的分類結(jié)果

圖1 春夏季的優(yōu)勢(shì)門Fig.1 The dominant Phylum in spring and summer

從季節(jié)上看，春季的主要優(yōu)勢(shì)目為β變形桿菌目Betaproteobacteriales(7.70%～30.69%)、黃桿菌目Flavobacteriales(0.48%～28.06%)和Frankiales(0.21%～25.08%).而夏季的主要優(yōu)勢(shì)目為β變形桿菌目Betaproteobacteriales(8.16%～30.58%)、Frankiales(9.46%～25.25%)和Chitinophagales(4.47%～8.86%)，見圖2.

圖2 春夏季的優(yōu)勢(shì)目Fig.2 The dominant order in spring and summer

春夏季相對(duì)豐度排序前30位的屬如圖3所示，可見兩個(gè)季節(jié)均有超過60%的測(cè)序結(jié)果無法鑒定到屬.從時(shí)間上看，兩季優(yōu)勢(shì)屬的差異主要是：春季優(yōu)勢(shì)屬為棲湖菌屬Limnohabitans(0.05%～11.35%)、多核桿菌屬Polynucleobacter(0.42%～11.67%)及黃桿菌屬Flavobacterium(0.02%～11.36%)；夏季優(yōu)勢(shì)屬則為多核桿菌屬Polynucleobacter(1.11%～24.24%)、Candidatus＿Aquiluna(0.22%～20.58%)及Acinetobacter(0.03%～13.09%).

圖3 春夏季的優(yōu)勢(shì)屬Fig.3 The dominant genus in spring and summer

從養(yǎng)殖水體類型上來看，多核桿菌屬Polynuclebacter、棲湖菌屬Limnohabitans及黃桿菌屬Flavobacterium在三種類型水體中均是優(yōu)勢(shì)屬.其中精養(yǎng)蝦蟹池及湖泊養(yǎng)殖水體中的棲湖菌屬Limnohabitans及黃桿菌屬Flavobacterium豐度顯著高于精養(yǎng)魚池，精養(yǎng)蝦蟹池的多核桿菌屬Polynucleobacter豐度也顯著高于另兩類水體.

進(jìn)一步，在OUT水平上(表5)，從時(shí)間上看，夏季的ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)及Shannon指數(shù)均顯著高于春季，說明夏季細(xì)菌群落的豐富度及多樣性均高于春季.從養(yǎng)殖水體類型上看，春季湖泊養(yǎng)殖水體的ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)均顯著高于其他兩類水體，夏季則是精養(yǎng)魚池水體的ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)顯著高于其他兩類水體.說明春季時(shí)，湖泊養(yǎng)殖水體細(xì)菌多樣性顯著高于其他兩類水體，夏季時(shí)，則是精養(yǎng)魚池的細(xì)菌多樣性最高.

表5 在 OTU 水平上的α 多樣性指數(shù)

此外，盡管春夏季的NOB平均豐度均較低(低于0.05%)，但春季的NOB豐度顯著高于夏季(p<0.05).春季NOB主要為Nitrotoga及少量的硝化桿菌，其中：所檢出的Nitrotoga的序列與Nitrotogafabula KNB的相似度為99.77%，硝化桿菌的序列與Nitrobactersp. NBW2的相似度為100%.夏季NOB以硝化螺菌為主，僅在湖泊養(yǎng)殖水體中檢測(cè)到極少的Nitrotoga，其中：所檢出的硝化螺菌有兩種，分別與Nitrospirasp. clone CK-103及Nitrospirasp. clone 3d＿59402的相似度為98.41%及98.44%，而Nitrotoga則與CandidatusNitrotogasp. AM1的相似度為99.54%.

從養(yǎng)殖水體類型上來看，結(jié)合總菌數(shù)的測(cè)定結(jié)果，春季時(shí)，1 mL水體中精養(yǎng)魚池的Nitrotoga的菌數(shù)(6 157 BLPs)顯著高于湖泊養(yǎng)殖水體(780 BLPs)和精養(yǎng)蝦蟹池塘(211 BLPs)，而3種類型水體中的硝化桿菌數(shù)則無顯著差異(精養(yǎng)蝦蟹池塘104 BLPs，湖泊養(yǎng)殖水體297 BLPs，精養(yǎng)魚池121 BLPs).夏季時(shí)，湖泊養(yǎng)殖水體的硝化螺菌數(shù)(211 BLPs)則顯著高于精養(yǎng)魚池(27 BLPs)和精養(yǎng)蝦蟹池塘(2 BLPs)(p<0.05).

2.3 硝化速率

各樣點(diǎn)硝化速率見表6.從季節(jié)上來看，春夏季的平均硝化速率分別為2.24±1.8 μg·L-1·h-1和2.32±2.27 μg·L-1·h-1，二者之間無顯著性差異(p>0.05).

表6 春夏季的硝化速率

從養(yǎng)殖水體類型上看，3種類型水體的硝化速率(圖3)存在顯著性差異(p<0.05)，其中，春夏季湖泊養(yǎng)殖水體的硝化速率均顯著高于精養(yǎng)魚池及精養(yǎng)蝦蟹池塘的硝化速率(p<0.05)，見圖4.

圖4 平均硝化速率Fig.4 Average nitrification rate

2.4 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與硝化速率的關(guān)系

3種類型的水體中，湖泊養(yǎng)殖水體的硝化速率高于其他兩類水體.同時(shí)，湖泊養(yǎng)殖水體中的硝化桿菌屬的豐度顯著高于另兩類水體，而黃單胞桿菌目也是湖泊養(yǎng)殖水體中的優(yōu)勢(shì)目，其豐度可達(dá)1.28%.

如圖5、6所示，總菌數(shù)與春夏季的硝化速率均呈顯著正相關(guān)，其中，黃單胞桿菌目Xanthomonadales的豐度(兩季的平均豐度分別為1.1%和0.6%)均與春夏季的硝化速率顯著正相關(guān)(p<0.05).春/夏季時(shí)，僅硝化桿菌和硝化螺菌豐度分別與硝化速率顯著正相關(guān)(p<0.05).

右側(cè)的3個(gè)縱軸依次指示硝化桿菌、黃單胞桿菌目和總菌的豐度The three axes at right side indicate the abundance of Nitrobacter, Xanthomonadales and total bacterial count, respectively圖5 春季時(shí)硝化速率與細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的關(guān)系Fig.5 Relationship between nitrification rate and bacterial community structure in spring

右側(cè)的3個(gè)縱軸依次指示硝化螺菌、黃單胞桿菌目和總菌的豐度The three axes at right side indicate the abundance of Nitrospira, Xanthomonadales and total bacterial count, respectively圖6 夏季時(shí)硝化速率與細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的關(guān)系Fig.6 Relationship between nitrification rate and bacterial community structure in summer

3 討論

3.1 養(yǎng)殖水體中的水質(zhì)情況

本文測(cè)得的氨氮、亞硝氮、總氮、總磷等水質(zhì)指標(biāo)基本符合我國(guó)淡水養(yǎng)殖標(biāo)準(zhǔn)(NY5051—2001)，這也與王金毅等[13]在養(yǎng)殖池塘檢測(cè)的水質(zhì)狀況基本一致.此外，本文測(cè)得的總菌數(shù)均值為每毫升水體3.6±0.2×106BLPs，這與Del等[14]在養(yǎng)殖水體測(cè)得的總菌數(shù)相當(dāng).

3.2 養(yǎng)殖水體中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

變形菌門是各類型水體中最豐富菌群，是河流湖泊及海水中的主要菌群[15-16].李倩等[17]在養(yǎng)殖水體中也發(fā)現(xiàn)變形菌門為其優(yōu)勢(shì)菌群，這與本文觀測(cè)到結(jié)果是一致的.

細(xì)菌群落組成受多方面影響，其中水溫是影響?zhàn)B殖水體細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的重要因子[18].如循環(huán)養(yǎng)殖水體的細(xì)菌群落豐度和多樣性會(huì)受水溫的顯著影響[19]，張雅潔等[20]在北海湖也發(fā)現(xiàn)春夏季細(xì)菌多樣性存在顯著差異，夏季高于春季，這與本文的觀測(cè)結(jié)果是吻合的(夏季細(xì)菌的多樣性顯著高于春季).

通常，細(xì)菌有兩種典型的生存策略：K-策略和r-策略.K-策略是指細(xì)菌能夠適應(yīng)較低的底物濃度而生長(zhǎng)，但生長(zhǎng)緩慢，r-策略是指細(xì)菌在較高的底物濃度下快速生長(zhǎng)[21].其中，硝化桿菌是污水處理系統(tǒng)中的優(yōu)勢(shì)NOB，其通常被認(rèn)為是r-策略者，而硝化桿菌也分布在土壤[22]、沉積物[23]、養(yǎng)殖水體[24-25]及本文所研究的淡水養(yǎng)殖水體等亞硝氮濃度較低的環(huán)境中，說明部分硝化桿菌可能會(huì)適應(yīng)低濃度亞硝氮而生長(zhǎng).與硝化桿菌不同，Nitrotoga和硝化螺菌均能在較低底物濃度下生長(zhǎng)[26-27]，說明其對(duì)底物的親和力較強(qiáng)[12]，適合于低濃度亞硝氮環(huán)境中生長(zhǎng).淡水養(yǎng)殖水體中的亞硝氮普遍較低，硝化螺菌通常是淡水養(yǎng)殖系統(tǒng)中較常見的NOB[25].類似的，本文發(fā)現(xiàn)Nitrotoga和硝化螺菌分別是春季和夏季的優(yōu)勢(shì)NOB.

NOB的分布不僅僅受底物濃度的影響，還與水溫、溶解氧有關(guān)[28-29].本文中，春季的NOB豐度顯著高于夏季，說明水溫對(duì)NOB豐度有顯著影響：NOB的豐度隨溫度升高而降低[30].具體而言，本研究中所觀測(cè)到的春季NOB優(yōu)勢(shì)種Nitrotoga多分布于低溫環(huán)境中[31-32]，其能夠分布于0 ℃冰川凍土中[33]，甚至是冰下湖泊中能檢測(cè)到的唯一NOB[34].本文發(fā)現(xiàn)，夏季NOB以硝化螺菌為主，而硝化螺菌是唯一已知嗜熱NOB[35]，其甚至能夠分布于溫泉等水溫較高(但亞硝氮濃度較低)的環(huán)境中.

硝化螺菌與其他NOB的區(qū)別還在于其能夠適應(yīng)低溶解氧而生長(zhǎng)[25，27].相比之下，硝化桿菌則更適于高溶解氧環(huán)境[29].本研究中，夏季NOB以硝化螺菌為主，且完全未檢出硝化桿菌，可能與夏季較低的溶解氧有關(guān)(夏季溶解氧顯著低于春季).

3.3 硝化速率與細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)的關(guān)系

有報(bào)道指出，硝化桿菌和硝化螺菌與養(yǎng)殖水體中的硝化作用均有關(guān)[11，36]，類似的，本研究發(fā)現(xiàn)硝化桿菌與硝化螺菌的豐度和分別于春/夏的硝化速率呈顯著正相關(guān)(p<0.05).而且，根據(jù)測(cè)得的總菌數(shù)(9.3×105～8.1×106BLPs·mL-1)和NOB的豐度(0.028%±0.0007%)，及已知NOB的硝化速率范圍在0.01～23.0 fmol·cell-1·h-1之間[35,37]，計(jì)算得到NOB所能貢獻(xiàn)的硝化速率可達(dá)0.08～0.73 μg·L-1·h-1，考慮到測(cè)試8天的時(shí)間內(nèi)NOB的生長(zhǎng)(NOB的代時(shí)多為13 h～54 h[38,39])，將有可能接近或達(dá)到實(shí)測(cè)的硝化速率(2.28±2.02 μg·L-1·h-1).此外，本文發(fā)現(xiàn)黃單胞桿菌目在養(yǎng)殖水體中的優(yōu)勢(shì)度較高，且其豐度在春夏季均與硝化速率呈顯著正相關(guān)(p<0.05)，故推測(cè)如此稀少的NOB不太可能是硝化作用的主力軍或是淡水養(yǎng)殖水體中NOB硝化性能遠(yuǎn)高于已知的NOB.此外，本文發(fā)現(xiàn)黃單胞桿菌目是養(yǎng)殖水體中優(yōu)勢(shì)度較高的種類，且其豐度在春夏季均與硝化速率呈顯著正相關(guān)(p<0.05)，根據(jù)本文中所測(cè)得的總菌數(shù)及黃單胞桿菌目的豐度(0.85%±0.35%)，類比單個(gè)硝化細(xì)菌的硝化速率，計(jì)算得到黃單胞桿菌目可貢獻(xiàn)的硝化速率可達(dá)2.049 μg·L-1·h-1，這與實(shí)際所測(cè)得的硝化速率基本吻合(2.23±1.79 μg·L-1·h-1)，故推測(cè)黃單胞桿菌有可能在硝化過程中發(fā)揮了重要作用.盡管目前對(duì)于養(yǎng)殖水體中黃單胞桿菌目的硝化性能研究尚未見報(bào)道，但Colin等[40]在對(duì)污水處理系統(tǒng)中的研究中發(fā)現(xiàn)，黃單胞桿菌目中的藤黃色桿菌屬(Luteibacteryeojuensis)在自養(yǎng)和異養(yǎng)條件下均表現(xiàn)出了一定的硝化活性.此外，Baskaran等[41]在半咸水中，通過結(jié)合高通量測(cè)序與基因組功能預(yù)測(cè)，也推測(cè)黃單胞桿菌目中黃單胞桿菌科(Xanthomonadaceae)具有潛在的硝化活性.除了可能直接進(jìn)行硝化作用外，黃單胞桿菌目的細(xì)菌也可能通過某些間接作用而加強(qiáng)硝化活性，如崔麗慧等[42]在好養(yǎng)活性污泥中發(fā)現(xiàn)黃單胞桿菌科的細(xì)菌可分泌?；呓z氨酸內(nèi)酯促進(jìn)形成菌膠團(tuán)，而硝化細(xì)菌則更適于粘附在生物膜上生長(zhǎng)[43]，Dong等[44]也發(fā)現(xiàn)固定化能夠同時(shí)提高黃單胞桿菌目的豐度和硝化活性，說明黃單胞桿菌目也有可能通過復(fù)雜的菌種間的相互作用而促進(jìn)硝化.

4 結(jié)論

養(yǎng)殖水體中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌為變形菌門，且夏季細(xì)菌多樣性顯著高于春季.春季的NOB中包括Nitrotoga及硝化桿菌，夏季的NOB豐度顯著低于春季，且以硝化螺菌為主.硝化桿菌與硝化螺菌的豐度分別于春季和夏季的硝化速率正相關(guān)，而黃單胞桿菌目的豐度則與春夏季的硝化速率均呈正相關(guān).