馬鈴薯StASR基因的生物信息學(xué)分析及基因克隆

王樹(shù)林 李高峰 張榮 文國(guó)宏 李建武

摘要：將擬南芥AtASR基因核苷酸序列作為查詢序列，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)，得到馬鈴薯StASR基因（GenBank登錄號(hào)：XM_006359742）的序列。通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，該基因位于4號(hào)染色體上，基因長(zhǎng)度為654 bp，編碼108個(gè)氨基酸殘基，其編碼的蛋白質(zhì)具有典型的ABA/WDS保守結(jié)構(gòu)域。啟動(dòng)子區(qū)域分析后發(fā)現(xiàn)，馬鈴薯StASR基因含有水分響應(yīng)元件MYCATERD1、冷脅迫響應(yīng)元件DRECRTCOREAT和鹽脅迫響應(yīng)元件GT1GMSCAM4等多種與非生物脅迫響應(yīng)相關(guān)元件以及馬鈴薯生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)順式作用元件，對(duì)其進(jìn)行蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)的分析發(fā)現(xiàn)與低溫、水分脅迫等基因互作。用PCR技術(shù)成功的克隆到馬鈴薯StASR基因，其結(jié)果可以為深入研究馬鈴薯StASR基因的功能提供基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：ASR基因;干旱脅迫;馬鈴薯;生物信息學(xué)

中圖分類(lèi)號(hào)：Q781;S532? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? ? ? ? ? 文章編號(hào)：1001-1463（2022）03-0020-05

doi：10.3969/j.issn.1001-1463.2022.03.005

Bioinformatics Analysis and Cloning of the StASR Gene in

Solanum tuberosum

WANG Shulin 1， 2， LI Gaofeng 1， 2，? ZHANG Rong 1， 2， WEN Guohong 1， 2， LI Jianwu 1， 2

（1. Institute of Potato， Gansu Academy of Agricultural Sciences， Lanzhou Gansu 730070， China; 2. National Germplasm Resources Agricultural Experimental Station， Weiyuan Gansu 748201， China）

Abstract：In this experiment， the sequence of the potato StASR gene（Genbank Accession number：XM_006359742） was obtained by BLAST comparison in NCBI database using the nucleotide sequence of the Arabidopsis AtASR gene as the query sequence. Bioinformatics analysis revealed that the gene was located on chromosome 4 with a length of 654 bp and encodes 108 amino acid residues， and the encoded protein has a typical ABA/WDS conserved domain. After analyzing the promoter region， it was found that the potato StASR gene contains water response element MYCATERD1， cold stress response element DRECRTCOREAT， salt stress response element GT1GMSCAM4 and other abiotic stress response related elements as well as potato growth and development related cis-acting elements. The analysis of protein interaction network found that it interacted with genes such as low temperature and water stress. In addition， the potato StASR gene was successfully cloned by PCR technology， and the results can provide a basis study of the function of the potato StASR gene.

Key words：ASR gene;Drought stress;Potato;Bioinformatics

植物在生長(zhǎng)發(fā)育的過(guò)程中生長(zhǎng)環(huán)境對(duì)其產(chǎn)生重大的影響。為應(yīng)對(duì)環(huán)境中的各種非生物脅迫，植物自身發(fā)展出了復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)來(lái)適應(yīng)環(huán)境帶來(lái)的影響[1 ]。盡管越來(lái)越多的非生物脅迫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)被鑒定出來(lái)，但許多功能機(jī)制還尚未完全明確。

ASR蛋白是一類(lèi)高等植物中特有的蛋白質(zhì)，具有小而親水的特征[2 ]。第一個(gè)ASR蛋白在番茄（Solanum lycopersicum L.）中被分離出來(lái)后[3 ]，越來(lái)越多的植物中，如百合（Lilium L.）、葡萄（Vitis vinifera L.）、水稻（Oryza sativa L.）和玉米（Zea mays L.）中也相繼鑒定到ASR基因[4 ]。研究發(fā)現(xiàn)ASR蛋白具有典型的由60～80個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成高度保守的ABA/WDS（abscisic acid/water deficit stress） 結(jié)構(gòu)域，并且在N端具有鋅指結(jié)合位點(diǎn)。ASR蛋白能夠以單體或者復(fù)合體的形式與特定的DNA結(jié)構(gòu)結(jié)合[5 ]。雖然在多種作物中已經(jīng)克隆到ASR基因，但其ABA/WDS結(jié)構(gòu)域的功能并不明晰，其蛋白質(zhì)由70～230個(gè)氨基酸殘基組成[6 ]。具有ABA/WDS結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)復(fù)合物能夠響應(yīng)干旱脅迫、鹽堿脅迫、低溫脅迫。在干旱脅迫的調(diào)控中能夠響應(yīng)依賴于ABA的調(diào)控途徑[7 ]，在低溫脅迫的調(diào)控中以分子伴侶的形式進(jìn)行調(diào)控。另外在植物生長(zhǎng)發(fā)育的各個(gè)時(shí)期也具有重要的調(diào)控作用，如在花粉發(fā)育、果實(shí)成熟和植株衰老的過(guò)程中表達(dá)量都有顯著變化[8 ]。在干旱脅迫相關(guān)研究中，將ASR基因在水稻中進(jìn)行超表達(dá)后發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因水稻的耐旱能力得到大幅提升，其中ASR3也成為水稻耐旱關(guān)聯(lián)圖譜的候選基因[9 ]。將外源ASR基因在擬南芥中進(jìn)行超表達(dá)也提高了擬南芥的耐旱性和耐鹽堿性[10 ]。有研究證實(shí)，在水稻中ASR蛋白在干旱響應(yīng)調(diào)節(jié)通路中通過(guò)減輕細(xì)胞膜損傷，保持水分含量來(lái)提高作物的耐旱性[9 ]。然而，ASR蛋白是否在滲透脅迫下作為一個(gè)調(diào)控因子通過(guò)激活植物抗氧化系統(tǒng)和其他脅迫相關(guān)的基因開(kāi)始轉(zhuǎn)錄來(lái)參與ROS穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)目前還尚未闡明。

馬鈴薯（Solanum tuberosum L.）是世界上主要的糧食作物，非生物脅迫如干旱、鹽堿、低溫均對(duì)其植株生長(zhǎng)發(fā)育和塊莖的膨大具有較大的影響[11 ]。盡管有研究表明ASR蛋白在馬鈴薯塊莖中響應(yīng)鹽堿脅迫，但該基因在干旱和鹽堿脅迫中的信號(hào)通路機(jī)制尚不清楚[12 ]。我們分析了馬鈴薯StASR基因的結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)，以期為進(jìn)一步研究StASR基因在逆境脅迫響應(yīng)網(wǎng)絡(luò)中的功能提供參考。

1? ?材料與方法

1.1? ?試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用的PCR 酶、T4連接酶、限制性內(nèi)切酶和pMD18-T載體等均購(gòu)自大連寶生物公司。RNA提取試劑盒、cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒等均購(gòu)自TANGEN公司。指示馬鈴薯品種為大西洋。盆栽馬鈴薯在溫室中的生長(zhǎng)條件為：生長(zhǎng)溫度（24±2） ℃，白天/夜晚光照周期為16/8 h。取樣后立即用液氮處理并存儲(chǔ)于-80 ℃ 冰箱。

1.2? ?生物信息學(xué)分析

將擬南芥AtASR基因作為同源序列在NCBI中進(jìn)行BLAST比對(duì)，得到馬鈴薯StASR基因序列。將得到的馬鈴薯StASR基因的全基因組序列在NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中進(jìn)行BLAST同源比對(duì)，找到相似度較高的其他物種ASR基因序列做進(jìn)化樹(shù)。StASR基因在染色體上所處的位置分析使用馬鈴薯數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//solanaceae.plantbiology.msu.edu/pgsc_download. shtml）。啟動(dòng)子分析采用在線網(wǎng)站（https：//www.dna.affrc.go.jp/PLACE/？action= newplace）。蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)分析采用ExPAy （https：//web.expasy.org/protparam/）。蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析采用在線網(wǎng)站（https：//string-db.org/）。

1.3? ?馬鈴薯總RNA的提取及StASR基因的克隆

對(duì)供試馬鈴薯品種大西洋進(jìn)行取樣后，提取馬鈴薯總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA作為DNA克隆模板。根據(jù)馬鈴薯StASR 基因序列設(shè)計(jì)PCR克隆引物，正向引物為StASR-F：CGCGGATCCACAACA TTATCTCATCACTCACGC;反向引物為StASR-R：CGG GGTACCTCAAGCACTCTGAAGGGAAAC。用 1.5%的瓊脂糖凝膠電泳后將PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收。

2? ?結(jié)果與分析

2.1? ?馬鈴薯StASR基因及其蛋白質(zhì)分析

生物信息學(xué)分析表明，馬鈴薯StASR基因位于馬鈴薯第4號(hào)染色體上，基因長(zhǎng)度654 bp，放閱讀框長(zhǎng)度為327 bp。NCBI Splign分析結(jié)果（圖1）顯示，StASR蛋白結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)包含有典型的ABA/WDS結(jié)構(gòu)。采用蛋白質(zhì)分析在線軟件分析蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)化學(xué)式為：C538H819N165O158S1，該蛋白由108個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成。分子量為12 158.49 Da，理論等電點(diǎn)為6.65，其中含量較高的氨基酸有Glu、His和Lys，都達(dá)到了16.7%;含量較低的氨基酸有Gln和Met，僅占0.9%。另外分析發(fā)現(xiàn)有21個(gè)帶負(fù)電的氨基酸殘基（Asp + Glu），帶正電的（Arg + Lys）共有18個(gè)。蛋白質(zhì)不穩(wěn)定系數(shù)為46.37，將該蛋白性質(zhì)歸類(lèi)為不穩(wěn)定蛋白質(zhì)。

2.2? ?馬鈴薯StASR基因進(jìn)化分析

通過(guò)NCBI進(jìn)行BLAST得到7個(gè)物種與馬鈴薯StASR基因同源性較高的蛋白序列。通過(guò)MEGAX軟件使用NJ鄰進(jìn)法構(gòu)建分子系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖2）。結(jié)果顯示，馬鈴薯StASR基因與番茄具有高度相似的進(jìn)化關(guān)系，與黃瓜與鳳梨的次之，與水稻及玉米的進(jìn)化關(guān)系最遠(yuǎn)。分析結(jié)果與馬鈴薯進(jìn)化關(guān)系基本相一致。

2.3? ?馬鈴薯StASR基因的啟動(dòng)子區(qū)分析

對(duì)基因啟動(dòng)子上游序列1 000 bp的區(qū)域進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，馬鈴薯StASR基因包含不同的順式作用元件，如脫落酸（ABA）響應(yīng)元件ABREZMRAB28。脫水響應(yīng)元件ABRELATERD1。與非生物脅迫響應(yīng)的相關(guān)元件，如水分響應(yīng)元件MYCATERD1、冷脅迫響應(yīng)元件DRECRTCOREAT、鹽脅迫響應(yīng)元件GT1GMSCAM4。另外還包含一些與光調(diào)節(jié)相關(guān)的順式作用元件，如元件GT1CONSENSUS和較多的DNA結(jié)合元件ARR1AT（表1）。這些元件顯示馬鈴薯StASR基因可能在其逆境脅迫機(jī)制中發(fā)揮重要作用。

2.4? ?馬鈴薯StASR基因的克隆

以供試馬鈴薯品種大西洋提取RNA后反轉(zhuǎn)錄合成cDNA為模板進(jìn)行基因PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增引物根據(jù)馬鈴薯StASR基因序列設(shè)計(jì)，PCR擴(kuò)增引物為：正向引物為StASR-F：CGCGGATCCACAACATTAT CTCATCACTCACGC;反向引物為StASR-R：CGG GGTACCTCAAGCACTCTGAAGGGAAAC。PCR擴(kuò)增結(jié)束后用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳得到長(zhǎng)度為570 bp左右長(zhǎng)度的DNA片段（圖3），其大小符合預(yù)期。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收，回收目的片段通過(guò)T4-DNA連接酶將其連接在克隆載體上。

2.5? ?馬鈴薯StASR蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析

通過(guò)在線軟件STRING進(jìn)行馬鈴薯StASR蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析（圖4）顯示，馬鈴薯StASR蛋白與脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白（putative LTP）、磷酸酶蛋白、生長(zhǎng)素響應(yīng)蛋白（IAA4）、泛素連接酶蛋白、低溫響應(yīng)蛋白、肽酶、硝酸鹽蛋白具有互作作用，說(shuō)明馬鈴薯StASR蛋白能夠參與到生長(zhǎng)發(fā)育和逆境脅迫響應(yīng)當(dāng)中。

3? ?結(jié)論與討論

通過(guò)生物信息學(xué)的方法分析了馬鈴薯StASR基因與其他物種中的同源基因，從基因結(jié)構(gòu)、啟動(dòng)子區(qū)域分析、蛋白理化性質(zhì)、物種進(jìn)化關(guān)系、蛋白互作網(wǎng)絡(luò)5個(gè)角度分析表明，該基因位于4號(hào)染色體上，基因長(zhǎng)度為654 bp，編碼108個(gè)氨基酸殘基，其編碼的蛋白質(zhì)具有典型的ABA/WDS保守結(jié)構(gòu)域，并且在進(jìn)化關(guān)系上與番茄高度相似，說(shuō)明馬鈴薯StASR基因在與茄科作物進(jìn)化分歧前就發(fā)生復(fù)制現(xiàn)象，起源較早[13 ]。啟動(dòng)子區(qū)域分析后發(fā)現(xiàn)，馬鈴薯StASR基因含有水分響應(yīng)元件MYCATERD1、冷脅迫響應(yīng)元件DRECRTCOREAT和鹽脅迫響應(yīng)元件GT1GMSCAM4等多種與非生物脅迫響應(yīng)相關(guān)元件，對(duì)其進(jìn)行蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)的分析發(fā)現(xiàn)與低溫，水分脅迫等基因互作。另外用PCR技術(shù)成功的克隆到馬鈴薯StASR基因，其結(jié)果可以為深入研究馬鈴薯StASR基因的功能提供基礎(chǔ)。啟動(dòng)子區(qū)分析和蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)其基因上游區(qū)間有水分、低溫、鹽堿脅迫相關(guān)的響應(yīng)元件，表明馬鈴薯StASR基因能夠參與到逆境脅迫響應(yīng)的通路當(dāng)中。另外在蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)分析中發(fā)現(xiàn)馬鈴薯StASR蛋白能與低溫、干旱和生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的10個(gè)蛋白質(zhì)互作，也說(shuō)明其能夠調(diào)節(jié)作物響應(yīng)逆境脅迫的能力。

馬鈴薯是我國(guó)第三大糧食作物和四大主糧作物之一[14 - 15 ]。馬鈴薯StASR基因雖然結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，但其廣泛的參與到馬鈴薯對(duì)逆境脅迫響應(yīng)信號(hào)通路中，對(duì)馬鈴薯抗旱調(diào)節(jié)具有重要的潛在作用[16 ]。我們僅對(duì)馬鈴薯StASR基因在基因結(jié)構(gòu)、蛋白功能方面進(jìn)行了分析，其在調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的具體作用機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究。在干旱脅迫中依賴于ABA或者獨(dú)立于ABA的信號(hào)通路中都有ASR基因參與。在水分脅迫下，番茄SlASR基因與百合ASR基因表達(dá)量顯著升高[17 ]。 草莓FaASR基因與葡萄VsASR基因在外源ABA處理下都有顯著的升高[18 - 19 ]。另外有研究表明，病原菌也會(huì)誘導(dǎo)ASR基因的表達(dá)，如樟疫霉菌（Phytophthora cinnamomi）、枯萎病菌（F. oxysporun f. sp. Cubense）能夠使ASR基因或者同源蛋白的表達(dá)量增高[20 ]。在不同作物的不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期ASR基因的表達(dá)模式也不相同。番茄中果實(shí)在成熟期SlASR2基因表達(dá)量下降，草莓果實(shí)轉(zhuǎn)色后基因表達(dá)量上升，葡萄從坐果期到成熟期VvASR基因的表達(dá)量先升高后降低[21 ]。將PVX、PVS、PVY和PLRV 4種病毒CP融合基因?qū)腭R鈴薯，并對(duì)影響遺傳轉(zhuǎn)化的因素進(jìn)行了優(yōu)化[22 ]。

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收稿日期：2021 - 11 - 24;修訂日期：2022 - 01 - 09

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31760410）;甘肅省種業(yè)攻關(guān)項(xiàng)目（GZGG-2021-4）;現(xiàn)代絲路寒旱農(nóng)業(yè)馬鈴薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展項(xiàng)目（GNKJ-2020-1）;甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物育種專(zhuān)項(xiàng)（2020GAAS10）。

作者簡(jiǎn)介：王樹(shù)林（1992 — ），男，甘肅古浪人，研究實(shí)習(xí)員，碩士，研究方向?yàn)橹参锓肿由飳W(xué)。聯(lián)系電話：（0931）7706264。Email：1825631205@qq.com。