一種新型比率型次氯酸熒光探針的合成及應(yīng)用研究

＊張路飛 姬媛

（江西科技師范大學(xué)有機(jī)功能分子研究所 江西 330013）

次氯酸以及次氯酸鹽（HClO/ClO-）是生物體內(nèi)一種重要的生物活性氧（ROS），對(duì)入侵細(xì)菌和其他病原體的免疫防御中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在生物體內(nèi)，HClO主要存在于各個(gè)器官、組織以及各個(gè)細(xì)胞器中。內(nèi)源性的HClO主要是過(guò)氧化氫和氯離子在髓過(guò)氧化酶（MPO）催化下合成，具有強(qiáng)氧化性，在抵御病原體和維持細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡等方面發(fā)揮重要作用[1]。外源性的HClO是由水的氯化消毒產(chǎn)生（Cl2+H2O2→HClO）。HClO含量過(guò)高可能導(dǎo)致各種組織損傷和多種人類疾病，例如關(guān)節(jié)炎、肺損傷、阿爾茨海默病、糖尿病、神經(jīng)退行性疾病、心血管疾病甚至癌癥[2-3]。在我們的日常生活中，次氯酸和次氯酸鹽被廣泛應(yīng)用在漂白劑、洗滌劑和飲用水消毒劑等方面[4]。過(guò)量的HClO會(huì)產(chǎn)生三鹵甲烷（THMs），對(duì)人體和動(dòng)植物造成非常嚴(yán)重的危害。因此，開發(fā)一種快速、靈敏的檢測(cè)方法來(lái)監(jiān)測(cè)生命體內(nèi)的HClO是至關(guān)重要的。

目前，檢測(cè)HClO/ClO-的方法通常有還原滴定法、電化學(xué)測(cè)試、色譜分析、比色分析、核磁共振和熒光探針技術(shù)等。熒光探針技術(shù)已成為臨床醫(yī)學(xué)和生物醫(yī)學(xué)研究中不可或缺的工具，與傳統(tǒng)的方法相比，熒光分析法在生理?xiàng)l件下的應(yīng)用具有許多優(yōu)點(diǎn)，例如較高的靈敏度、較好的選擇性、操作簡(jiǎn)單、低成本、快速響應(yīng)率、實(shí)時(shí)檢測(cè)、便捷的可視化等。除了良好的靈敏度和選擇性外，長(zhǎng)波長(zhǎng)發(fā)射的熒光探針更適合生物成像，因?yàn)樗哂猩飿悠饭鈸p傷最小、穿透深度高和背景自發(fā)熒光低的優(yōu)點(diǎn)。此外，比率型熒光探針能更好地消除背景信號(hào)的干擾，更利于獲取準(zhǔn)確的檢測(cè)信號(hào)，可以通過(guò)兩個(gè)相關(guān)發(fā)射進(jìn)行自校準(zhǔn)，具有更好的靈敏度。熒光探針的發(fā)光機(jī)理主要有光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移（PET）、分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移（ICT）、熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）、激發(fā)態(tài)分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移（ESIPT）、聚集熒光增強(qiáng)（AIE）等。熒光探針檢測(cè)法通過(guò)探針分子實(shí)現(xiàn)特異性識(shí)別目標(biāo)分子，探針與目標(biāo)分子結(jié)合后熒光光譜發(fā)生顯著變化。

在此，我們?cè)O(shè)計(jì)并合成了一種新型比率型熒光探針LyCl，對(duì)HClO的選擇性優(yōu)于其他分析物，1,4-二甲基吡啶碘化物增加了化合物的水溶性。在沒有HClO的情況下，探針的熒光是通過(guò)分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移（ICT）過(guò)程從供體到受體呈紅色。添加HClO后，ICT過(guò)程將中斷，導(dǎo)致紅色通道發(fā)射熄滅，黃色通道發(fā)射開啟，實(shí)現(xiàn)了通過(guò)比值法測(cè)定HClO，在次氯酸的分析檢測(cè)方面具有良好的應(yīng)用前景。

1.實(shí)驗(yàn)部分

(1)試劑和儀器

所有的化學(xué)試劑都是通過(guò)伊諾凱化學(xué)試劑公司購(gòu)買的，無(wú)需進(jìn)一步提純就可以使用。

表1 實(shí)驗(yàn)試劑及規(guī)格

續(xù)表

分析測(cè)試所用到的儀器及型號(hào)如下表：

表2 實(shí)驗(yàn)儀器及型號(hào)

(2)探針的合成和表征

圖1 探針LyCl的合成路線

①化合物2的合成。在0℃下將PBr3（7.2mL，76.6mmol）滴加到7.2mL DMF和25mL三氯甲烷的混合溶液中，然后將反應(yīng)溶液攪拌1h，滴加環(huán)己酮（2.6mL，25.5mmol），將混合物在室溫下攪拌8h。反應(yīng)完成后將反應(yīng)液倒入150mL的冰水中，加入碳酸氫鈉調(diào)節(jié)溶液的pH等于7，用二氯甲烷（50mL×3）萃取，然后用H2O和飽和食鹽水溶液洗滌有機(jī)層，加入無(wú)水硫酸鈉干燥。干燥完成后在真空中濃縮得到化合物1，無(wú)需進(jìn)一步純化直接用于下一步。將化合物1（1g，5.3mmol），2-羥基-4-甲氧基苯甲醛（0.8g，5.3mmol）和Cs2CO3（5.65g）溶解在DMF（20mL）中，在室溫下攪拌16h。濃縮，殘余物溶于二氯甲烷并用水（30mL×3）萃取，有機(jī)層經(jīng)無(wú)水硫酸鈉干燥后過(guò)濾、濃縮。所得的粗產(chǎn)品通過(guò)柱層析（石油醚:乙酸乙酯=4:1）進(jìn)一步提純，最后得到深黃色的化合物2（1g，78%）。

②化合物L(fēng)y-OH的合成。在0℃時(shí)，將BBr3（3mL）滴加到含有化合物2（0.6g，2.5mmol）的無(wú)水二氯甲烷溶液（20mL）中，反應(yīng)溶液在室溫下攪拌16h。反應(yīng)完成后，加入飽和碳酸氫鈉溶液淬滅反應(yīng)，隨后用二氯甲烷（30mL×3）萃取，然后加入無(wú)水硫酸鈉干燥，并在真空下濃縮，得到的粗產(chǎn)品用硅膠柱色譜法進(jìn)一步純化，二氯甲烷:甲醇（20:1-10:1）作為洗脫劑，最后得到黃色固體Ly-OH（0.65g，82%）。

③1,4-二甲基吡啶碘化物的合成。將1mL（10.7mmol）4-甲基吡啶和1mL（16mmol）甲基碘溶解在4mL無(wú)水乙醇中，攪拌并在80℃下回流0.5h。反應(yīng)完成后低溫冷卻并添加少量的環(huán)己烷洗滌固體，干燥得到白色固體（2.38g，94%）。

④探針LyCl的合成。在50ml三口燒瓶中加入化合物L(fēng)y-OH（0.1g，0.44mmol）、化合物2（0.11g，0.44mmol）、無(wú)水乙醇（4ml）和哌啶（2滴）。將反應(yīng)攪拌并加熱回流12h。反應(yīng)完成后冷卻并去除溶劑，然后通過(guò)使用CH2Cl2:CH3OH（20:1）硅膠柱層析純化，最后得到紫黑色固體LyCl（0.1g，72%）。1H NMR（500MHz，d6-DMSO，ppm）：δ=8.38（d，J=5Hz，2H），8.14（d，J=15Hz,1H），7.81（d，J=5Hz，2H），6.99（d，J=10Hz，1H），6.78（s，1H），6.51（s，1H），6.38（d，J=10Hz，2H），6.35（d，J=15Hz，2H），4.04（s，3H），2.51（m，2H），2.45（m，2H），1.71（m，2H）；13C NMR（500MHz，d6-DMSO，ppm）：δ=168.20，154.92，154.82，152.65，143.23，135.21，128.52，127.69，121.50，120.85，115.49，114.71，110.49，109.10，102.76，45.68，28.69，24.40，20.76。

(3)光譜分析

光譜實(shí)驗(yàn)是在PBS緩沖溶液（10mM，pH=7.4）中進(jìn)行測(cè)試的。通過(guò)添加少量的HCl溶液和NaOH溶液使PBS緩沖溶液的pH值在2.0和12.0之間。熒光發(fā)射光譜記錄范圍為475nm至900nm（激發(fā)波長(zhǎng)為465nm），吸收光譜記錄范圍為300nm至600nm。比率型熒光探針LyCl母液的制備：稱取適量探針LyCl溶于二甲基亞砜中，得到濃度為1.0mmol/L的母液。其他分析物溶液的制備：將適量的分析物溶解在純水中，制得濃度為10mmol/L的儲(chǔ)備液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

(4)檢測(cè)限的計(jì)算

檢測(cè)限=3σ/k

表示11次空白樣品的標(biāo)準(zhǔn)偏差，k是指熒光比率I580/I690與HClO濃度線性關(guān)系的斜率。

2.結(jié)果與討論

(1)探針對(duì)HClO的選擇性與干擾性響應(yīng)研究

對(duì)目標(biāo)分子的高選擇性是分子探針的一個(gè)主要問(wèn)題。圖2（a）顯示出含有探針LyCl的PBS緩沖溶液（10mM，pH=7.4）中加入HClO以及其他分析物（K+、Ca2+、Zn2+、Fe2+、Cu2+、Na+、GSH、Hcy、Cys、HS-、HCN-）后的熒光光譜變化?？梢钥闯?，探針LyCl在580nm處和690nm處有一個(gè)發(fā)射峰，添加HClO后，690nm處的熒光發(fā)射峰逐漸降低，580nm處的發(fā)射峰逐漸增強(qiáng)。因此，我們可以通過(guò)熒光發(fā)射信號(hào)的比率（I580/I690）來(lái)檢測(cè)HClO。在相同條件下，分別加入其他分析物后熒光發(fā)射光譜變化可忽略不計(jì)。同時(shí)，還測(cè)試了HClO對(duì)其他分析物的抗干擾能力（圖2b）。結(jié)果表明，在其他分析物的存在下，探針依舊能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)HClO進(jìn)行快速識(shí)別，且競(jìng)爭(zhēng)離子對(duì)HClO的干擾比較小。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，探針對(duì)HClO具有較好的選擇性與較強(qiáng)的抗干擾能力。

圖2 （a）向含有LyCl（20μM）的PBS緩沖溶液（10mM，pH=7.4）中加入HClO（120μM）以及其他分析物后的熒光光譜變化以及加入其他分析物后的I580/I690處的熒光強(qiáng)度變化；（b）λex=460nm

(2)熒光光譜性質(zhì)研究

我們對(duì)探針與不同濃度的HClO響應(yīng)后的熒光性質(zhì)進(jìn)行了研究。如圖3所示，探針本身在580nm和690nm處有兩個(gè)發(fā)射峰，隨著HClO濃度的增加，熒光光譜比率發(fā)生變化，690nm處的熒光強(qiáng)度逐漸減弱，580nm處的熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，并逐漸達(dá)到最大。此外，還發(fā)現(xiàn)熒光發(fā)射比率信號(hào)I580/I690與HClO濃度之間存在線性關(guān)系，檢測(cè)限為26.5μM。這些結(jié)果表明探針對(duì)HClO有很高的靈敏度。

圖3 （a）向含有探針LyCl（20μM）的PBS緩沖溶液（10mM，pH=7.4）中加入不同濃度HClO（20μM）溶液后的熒光光譜變化；（b）探針LyCl（20μM）在I580/I690處的熒光強(qiáng)度與不同濃度的HClO（0-150μM）的滴定曲線以及與HClO（20-120μM）線性關(guān)系；（c）（λex=460nm）

(3)pH效應(yīng)

為了探究pH值的變化是否會(huì)干擾探針對(duì)HClO的熒光響應(yīng)，記錄了不同pH值下探針的熒光發(fā)射強(qiáng)度比率變化。從圖4可以看出，在沒有HClO的情況下，探針在2.0到6.0的pH范圍內(nèi)是穩(wěn)定的，7.4到12.0略有增長(zhǎng)。而在HClO存在的條件下可以看出，在酸性條件下熒光強(qiáng)度比率幾乎無(wú)變化，在7.4到12.0的pH范圍內(nèi)熒光強(qiáng)度比率有一個(gè)明顯的增加，因此，探針LyCl也適合檢測(cè)生物體內(nèi)的HClO。

圖4 在是否存在HClO（120μM）的情況下，不同pH下的熒光發(fā)射強(qiáng)度比值I580/I690的變化（λex=460nm）

(4)熒光響應(yīng)時(shí)間的研究

為了更好地了解探針與HClO的反應(yīng)，監(jiān)測(cè)了探針的熒光光譜的時(shí)間依賴性，如圖所示。這些結(jié)果表明，當(dāng)溶液中存在HClO時(shí)，690nm處的熒光發(fā)射峰逐漸降低，580nm處的熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，熒光比率信號(hào)I580/I690能夠在10s內(nèi)達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。這意味著我們提出的探針將成為一種快速檢測(cè)HClO的分析方法。

圖5 （a）向含有探針LyCl（20μM）的PBS緩沖溶液（10mM，pH=7.4）中加入HClO（120μM）溶液后記錄不同時(shí)間的熒光光譜；（b）向含有探針LyCl（20μM）的PBS緩沖溶液（10mM，pH=7.4）中加入HClO（0μM和120μM）后熒光發(fā)射強(qiáng)度比值I580/I690隨時(shí)間的變化關(guān)系（λex=460nm）

(5)機(jī)理研究

為了探究體系的響應(yīng)機(jī)理，在探針LyCl（20μM）的PBS緩沖溶液（10mM，pH=7.4）中加入HClO（120μM），并進(jìn)行了質(zhì)譜分析。在質(zhì)譜圖中，m/z=229.09處有一個(gè)片段，這個(gè)認(rèn)為是探針LyCl與HClO響應(yīng)后的產(chǎn)物L(fēng)y-OH（如圖7）。另外，同時(shí)做了探針LyCl與HClO響應(yīng)后的熒光光譜和Ly-OH的熒光光譜，如圖6（b）所示，對(duì)比發(fā)現(xiàn)兩個(gè)熒光光譜均在580nm處有一個(gè)發(fā)射峰，可以說(shuō)明探針LyCl與HClO響應(yīng)后的產(chǎn)物是Ly-OH。根據(jù)上述結(jié)果，我們提出了響應(yīng)機(jī)制（圖6b）。HClO首先攻擊C=C鍵，然后形成的中間體被H2O/HClO進(jìn)一步親核攻擊，接著進(jìn)行消除，釋放出Ly-OH，導(dǎo)致熒光發(fā)射藍(lán)移，熒光增強(qiáng)。

圖6 （a）探針LyCl與HClO的響應(yīng)機(jī)理；（b）Ly-OH的熒光光譜以及探針LyCl與HClO響應(yīng)后的熒光光譜（λex=460nm）

圖7 探針LyCl與HClO的響應(yīng)后的高分辨質(zhì)譜圖

3.結(jié)論

綜上所述，我們開發(fā)了一種比率型次氯酸熒光探針，基于分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移機(jī)制（ICT），探針與HClO作用后，呈現(xiàn)出較大的藍(lán)移和較高的熒光比率變化，具有高選擇性和高靈敏度。我們還證明了探針對(duì)HClO表現(xiàn)出線性比率熒光響應(yīng)，在中性pH條件下，其熒光信號(hào)在0～120μM次氯酸濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，其檢測(cè)限為26.5μM。研究結(jié)果為設(shè)計(jì)其他生物分子的檢測(cè)提供了有益的參考。