交泰丸對慢性溫和不可預(yù)知性應(yīng)激抑郁大鼠腸道菌群的影響*

王月兒，李珠，馮曼，李琳，高杉，于春泉

（天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617）

抑郁癥是最常見的精神疾病之一，以情緒低落、興趣缺乏為主要癥狀，具有患病率高、復(fù)發(fā)率高、致殘率高的特點(diǎn)。據(jù)柳葉刀最近調(diào)查發(fā)現(xiàn)，全世界每年約有5%的成年人患有抑郁癥，患病人數(shù)約3.5億，其中中國的抑郁癥的終身患病率為6.9%，人群約有9 500萬，且人數(shù)還在持續(xù)增加[1-2]。抑郁癥的病因及發(fā)病機(jī)制尚不明確，現(xiàn)有抗抑郁藥物也不能完全滿足抑郁癥患者的治療需求[3]。因此，尋找有效的治療方法迫在眉睫。近年來，研究發(fā)現(xiàn)腸道和大腦之間擁有雙向的調(diào)節(jié)系統(tǒng)，而腸道菌群與大腦之間的關(guān)系對抑郁癥具有一定的影響[4]。

交泰丸記載于明代《韓氏醫(yī)通》，由黃連、肉桂（10∶1）配伍組成，方名出自《四科簡要方·安神》：生川連五錢，肉桂心五分，研細(xì)，白蜜丸，空心淡鹽湯下，治心腎不交，怔忡無寐，名交泰丸。黃連味苦性寒，入心經(jīng)，寒可清火，苦能降泄，故可清降心火；肉桂性辛味甘大熱，入腎陽，能溫腎水，引火歸元，兩藥一寒一熱，一陰一陽，共奏交通心腎，調(diào)神定志，臨床上常用于治療失眠，糖尿病等疾病[5-6]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)交泰丸可以改善利血平誘導(dǎo)小鼠抑郁模型、慢性溫和不可預(yù)知性應(yīng)激大鼠抑郁模型的抑郁行為，并可通過調(diào)節(jié)cAMP-PKA-CREB-BDNF等細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路達(dá)到抗抑郁的目的[7-11]。課題組前期采用CUMS方法成功制備抑郁大鼠模型，并且發(fā)現(xiàn)交泰丸通過調(diào)節(jié)PI3K、AKT、mTOR、4EBP1蛋白表達(dá)水平，從而調(diào)控大鼠PI3K/AKT/mTOR信號通路，發(fā)揮抗抑郁作用[12]。因此在前期研究的基礎(chǔ)上，本研究采用16S rDNA高通量測序技術(shù)，觀察交泰丸對CUMS大鼠腸道菌群組成的調(diào)控作用，闡明交泰丸通過調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)而發(fā)揮抗抑郁的作用，為臨床上使用交泰丸治療抑郁癥提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 健康Wistar雄性大鼠135只，體質(zhì)量240～260 g，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，合格證號為1100111911013744，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2016-0006，飼養(yǎng)于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所動物房。飼養(yǎng)期間，室溫：24～26℃，濕度：40%～60%，明暗交替各周期為12 h，分籠飼養(yǎng)，隨機(jī)分組，普通飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)食飲水。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)。動物實(shí)驗(yàn)通過天津中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號TCMLAEC2019066）。

1.2 實(shí)驗(yàn)器材 Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer（New England Biolabs公司），Biorad T100梯度 PCR儀，GeneJET膠回收試劑盒（Thermo Scientific公司），TruSeq DNA PCR-Free Library Preparation Kit建庫試劑盒（Illumina公司），Magnetic Soil And Stool DNA Kit（版本號為DP180427），Miseq測序儀（美國Illumina公司）等。

1.3 實(shí)驗(yàn)藥物與制備 將黃連、肉桂以10∶1的比例，取黃連400 g，肉桂40 g，制成20目粗粉。黃連加水回流提取3次，加水量依次為10、8、8倍，提取時間分別為 170、80、40 min，過濾，2 000 r/min 離心20 min，合并上清液，制干粉備用；肉桂與交泰丸分別加水用雙提法提取3次，加水量依次為10、8、8倍，提取分別為 170、80、40 min，過濾，2 000 r/min 離心20 min，合并上清液，制干粉備用；交泰丸加水用雙提法提取3次，加水量依次為10、8、8倍，提取分別為 170、80、40 min，過濾，2000 r/min 離心 20 min，合并上清液，將先前分別提取的黃連、肉桂上清液混合，水浴濃縮，制干粉備用。

黃連、肉桂、交泰丸提取液分別進(jìn)行水浴濃縮，60℃烘干，粉碎成干粉，計(jì)算出膏率（干粉質(zhì)量÷飲片質(zhì)量×100%），4℃冰箱保存?zhèn)溆?，使用時按所得出膏率用超純水溶解稀釋至溶液或混懸液。

1.4 動物模型的制備及取材 將大鼠隨機(jī)分為9組，分別為空白對照組（C）、模型組（M）、交泰丸高劑量組（3.00 g生藥/kg，JTW.H）、交泰丸低劑量組（1.50 g生藥/kg，JTW.L）、黃連高劑量組（2.73 g生藥/kg，CR.H）、黃連低劑量組（1.36 g生藥/kg，CR.L）、肉桂高劑量組（0.27 g生藥/kg，CC.H）、肉桂低劑量組（0.14 g生藥/kg，CC.L）和氟西汀組（7.5 mg/kg，F(xiàn)LX），每組15只，分籠飼養(yǎng)。

實(shí)驗(yàn)前正常供給飼料及飲水，并且進(jìn)行糖水偏愛實(shí)驗(yàn)。模型組與給藥組均接受應(yīng)激刺激，大鼠在刺激21天后按1.0 mL/100 g體質(zhì)量灌胃給藥（空白組和模型組則給予等量的蒸餾水），連續(xù)14 d，給藥同時繼續(xù)進(jìn)行相應(yīng)刺激。

空白組大鼠正常供給飼料及飲水（蔗糖偏愛實(shí)驗(yàn)前禁水24 h除外），不接受任何刺激。CUMS模型主要包括6種刺激因子：冰水游泳、晝夜顛倒、夾尾、振蕩、禁食和禁水。每組動物每日隨機(jī)給予1種應(yīng)激，保證同一刺激不連續(xù)出現(xiàn)，持續(xù)35 d。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，模型組大鼠體質(zhì)量增長速度緩慢、糖水偏愛率以及曠場實(shí)驗(yàn)中水平行走距離與直立次數(shù)均明顯降低，說明CUMS抑郁大鼠食欲減退、快感缺失、活動量減少、運(yùn)動遲緩、對對外界的好奇性降低，證明抑郁模型建立成功[12]。在第36天將大鼠麻醉取材，處死大鼠，解剖大鼠直腸，收集新鮮糞便，置微型離心管中，樣品于液氮中速凍，保存于-80℃冰箱備用待測。

1.5 16 S rDNA V3～V4區(qū)高通量測序 采用CTAB或SDS方法對糞便樣本的基因組DNA進(jìn)行提取，用磁珠法檢測DNA濃度及純度。取適量的樣品于離心管中，使用無菌水稀釋樣品至1 ng/μL。以稀釋后的基因組DNA為模板，使用帶Barcode的16S rDNA（V3-V4）區(qū)域引物：338 F（ACTCCTACGGGAG GCAGCAG）和 806R（GGACTACNNGGGTWTCTAAT）。使用New England Biolabs公司的Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer的酶進(jìn)行PCR，確保擴(kuò)增效率和準(zhǔn)確性。根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進(jìn)行等濃度混樣，充分混勻后使用1×TAE濃度2%的瓊脂糖膠電泳純化PCR產(chǎn)物，選擇主帶大小在400～450 bp之間的序列，割膠回收目標(biāo)條帶。使用Illumina公司TruSeq DNA PCR-Free Library Preparation Kit建庫試劑盒進(jìn)行文庫的構(gòu)建，構(gòu)建完成的文庫經(jīng)過Qubit定量和文庫檢測，合格后，使用NovaSeq 6000進(jìn)行上機(jī)測序。

1.6 生物學(xué)信息分析 利用Uparse軟件[13]對所有樣本有效序列進(jìn)行聚類后，選取OTUs（Operational Taxonomic Units）的代表性序列。使用Mothur方法與SILVA132[14]的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫[15]對物種進(jìn)行門綱目科屬的注釋。使用Qiime軟件（Version 1.9.1）計(jì)算Chao1，Simpson，Goods-coverage指數(shù)，使用R軟件（Version 2.15.3）繪制稀釋曲線，Rank abundance曲線，物種累積曲線。使用R軟件進(jìn)行Alpha多樣性指數(shù)組間差異分析；Alpha多樣性指數(shù)組間差異分析選用的是Tukey檢驗(yàn)。使用R軟件的vegan軟件包（Version 2.15.3）繪制NMDS圖。使用R軟件進(jìn)行β多樣性指數(shù)組間差異分析，選用的是Tukey檢驗(yàn)。LEfSe分析使用LEfSe軟件，默認(rèn)設(shè)置LDA Score的篩選值為4。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，若實(shí)驗(yàn)結(jié)果呈正態(tài)性分布且方差齊，采用單因素方差分析；若實(shí)驗(yàn)結(jié)果呈非正態(tài)分布，則采用非參數(shù)檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 菌群α多樣性分析 α多樣性常用于衡量群落生態(tài)學(xué)中物種豐富度和均勻度。為了測試腸道菌群測序的充分性，根據(jù)不同測序深度的OTU數(shù)構(gòu)建稀疏曲線、等級聚類曲線和物種累積箱型圖（見圖1a、b和c）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，測序數(shù)據(jù)足以反映樣品中微生物種類的大部分信息，各組的豐富度和均勻度較高。

圖1 各組抑郁癥大鼠的物種多樣性與豐富性曲線圖（n=8）

為了觀察空白組、模型組、交泰丸高低劑量組、黃連高低劑量組、肉桂高低劑量組的腸道菌群多樣性的差異，采用Simpson指數(shù)來評估物種多樣性，采用Chao1指數(shù)和observed species來評估物種豐富度。Simpson指數(shù)值越大，則表明菌群多樣性越低。Observed species、chao1指數(shù)越高，說明菌群的豐富度越高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組Simpson值略低于交泰丸高、低劑量組和黃連高、低劑量組，表明模型組腸道菌群多樣性高于交泰丸高、低劑量組和黃連高、低劑量組，且組間比較有顯著性差異（P＜0.05）。由Chao1指數(shù)和observed species圖可知，模型組指數(shù)高于交泰丸高低劑量組、黃連高低劑量組，這說明模型組的物種豐富度高于交泰丸高低劑量組、黃連高低劑量組，且組間差異有顯著性（P＜0.05）。以上結(jié)果表明，給予交泰丸、黃連會使大鼠腸道菌群的α多樣性發(fā)生明顯改變。見圖2。

圖2 各組抑郁癥大鼠腸道菌群Alpha多樣性分析圖（n=8）

2.2 菌群β多樣性分析 β多樣性是對不同樣本的微生物群落構(gòu)成進(jìn)行比較分析，評估微生物群落差異。無度量多維標(biāo)定法（NMDS）結(jié)果如圖所示，交泰丸高劑量組、交泰丸低劑量組、黃連高劑量組、黃連低劑量組、肉桂高劑量組、肉桂低劑量組偏離模型組。表明交泰丸高劑量組、交泰丸低劑量組、黃連高劑量組、黃連低劑量組、肉桂高劑量組、肉桂低劑量組可在一定程度上改變CUMS大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)。見圖3。

圖3 各組抑郁癥大鼠腸道微生物群落差異的NMDS分析圖（n=8）

2.3 科及屬水平菌群組成 在科水平中，與空白組相比，模型組的毛螺菌科（Lachnospiraceae）相對豐度下降；與模型組相比，交泰丸低劑量組的毛螺菌科（Lachnospiraceae）相對豐度上升（P＜0.05）。與空白組相比，模型組的瘤胃菌科（Ruminococcaceae）相對豐度上升；與模型組相比，交泰丸高低劑量組、黃連高劑量組的瘤胃菌科（Ruminococcaceae）相對豐度降低（P＜0.05）。在屬水平中，與空白組相比，模型組的擬桿菌屬（Bacteroides）、布勞特氏菌屬（Blautia）相對豐度豐度降低；與模型組相比，交泰丸低劑量組的擬桿菌屬（Bacteroides）、阿克曼氏菌（Akkermansia）、交泰丸高低劑量組的布勞特氏菌屬（Blautia）相對豐度上升（P＜0.05），這說明表明交泰丸可顯著調(diào)節(jié)抑郁大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)及菌落豐度。見圖4和圖5。

圖4 各組大鼠腸道菌群在科水平的組成（n=8）

圖5 各組大鼠腸道菌群在屬水平的組成（n=8）

2.4 菌群LEfSe分析 通過LEfSe分析篩選各組的優(yōu)勢菌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)空白組的差異菌群為厚壁菌門（Firmicutes）、消化鏈球菌科（Peptostreptococcaceae）和羅姆布茨菌屬（Romboutsia）。模型組的差異菌群為芽孢桿菌（Bacillus）、乳桿菌目（Lactobacillales）、乳桿菌科（Lactobacillaceae）、乳桿菌屬（Lactobacillus）。FLX組的差異菌群為Dubosiella。JTW.H組的差異菌群為變形菌門（Proteobacteria）、克雷伯氏菌（Klebsiella）、檸檬酸桿菌（Citrobacter）、丹毒絲菌綱（Erysipelotrichia）、Clostridioides等。JTW.L組的差異菌群為梭菌綱（Clostridia）、疣微菌綱（Verrucomicrobiae）、毛螺菌科和阿克曼氏菌綱（Akkermansiaceae）等。CR.H組的差異菌群為擬桿菌和Muribaculaceae。CR.L組的差異菌群為布勞特氏菌屬、Lachnoclostridium 和糞芽孢菌屬（Coprobacillus）。CC.H組的差異菌群為Allobaculum。CC.L組的差異菌群為瘤胃菌科（Ruminococcaceae）。見圖6。

圖6 各組菌群LEfSe分析（n=8）

3 討論

腸道菌群包含上千種細(xì)菌，300多萬個基因，是人體基因組的150倍，被稱為“人體第二基因組”[16]。過去人們大多關(guān)注腸道菌群與功能性胃腸疾病、代謝性疾病的關(guān)系，如肥胖，糖尿病，高血壓等[17]。近年來，人們開始把焦點(diǎn)轉(zhuǎn)移到神經(jīng)系統(tǒng)疾病，發(fā)現(xiàn)腸道菌群可以與大腦相互作用，影響精神性疾病的發(fā)生發(fā)展，如焦慮、抑郁、精神分裂及神經(jīng)退行性疾病等[18-19]。研究表明，腸道菌群能通過“微生物-腸-腦軸”影響大腦神經(jīng)生化，進(jìn)而影響人們的情緒和行為[20]。

自從發(fā)現(xiàn)了腸道菌群和抑郁癥的密切關(guān)系后，越來越多的研究者開始尋求通過調(diào)節(jié)腸道菌群來治療抑郁癥的方法。Haghighat等[21]研究發(fā)現(xiàn)益生菌可以增加抑郁癥患者腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）的水平，改善患者的抑郁癥狀。Sun等[22]研究表明益生菌可以通過菌腸腦軸來改善CUMS大鼠的5-羥色胺（5-HT）與BNDF水平來達(dá)到抗抑郁的目的。本研究通過分析腸道菌群的多樣性與豐富性，揭示CUMS大鼠與給藥組大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的變化，借助相關(guān)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法篩選各分類水平中相對豐度發(fā)生改變的差異菌群，發(fā)現(xiàn)交泰丸對于抑郁癥大鼠腸道菌群的影響。

擬桿菌的一些菌株長期以來一直被視為益生菌。擬桿菌在調(diào)節(jié)腸道菌群動態(tài)平衡，增加宿主免疫力等方面具有重要作用[23-24]。Cheng等[25]通過微生物相關(guān)基因集富集分析發(fā)現(xiàn)擬桿菌與抑郁相關(guān)。擬桿菌屬物種可能通過腸腦代謝信號差異調(diào)節(jié)抑郁樣行為[26]。在本研究中，交泰丸增加CUMS大鼠的擬桿菌豐度，這與之前的研究一致[27]。交泰丸可能通過增加擬桿菌的含量促進(jìn)腸道菌群動態(tài)平衡的恢復(fù)，進(jìn)而改善大鼠的類似抑郁癥狀。然而，擬桿菌與抑郁癥的機(jī)制研究尚不明確，需要進(jìn)一步的研究證明其與抑郁癥的關(guān)系。

阿克曼氏菌廣泛存在于健康人群的腸道中，具有保護(hù)腸道屏障和減輕腸道炎癥反應(yīng)的作用[28-29]。通過將差異豐富的腸道菌群與抑郁指標(biāo)和代謝物水平聯(lián)系起來，發(fā)現(xiàn)阿克曼氏菌豐度的改變與抑郁癥狀和炎癥細(xì)胞因子密切相關(guān)[30]。研究發(fā)現(xiàn)阿克曼氏菌與5-HT存在正相關(guān)的關(guān)系，而5-HT的水平與抑郁癥的發(fā)展密切相關(guān)[31-32]。陳拓[33]研究發(fā)現(xiàn)阿克曼氏菌可以緩解小鼠的抑郁樣行為。這些結(jié)果表明，阿克曼氏菌可能是治療抑郁癥的潛在新靶點(diǎn)。

醋酸、丙酸、丁酸等短鏈脂肪酸（SCFAs）與腸道微生物群密切相關(guān)。在抑郁癥小鼠中，菌群分類、短鏈脂肪酸和神經(jīng)遞質(zhì)之間存在一些顯著的相關(guān)性，如阿克曼氏菌與乙酸水平呈顯著的正相關(guān)[31]，毛螺菌科是腸道中短鏈脂肪酸的生產(chǎn)者[34]，多酚通過影響腸道微生物群中的擬桿菌門來促進(jìn)SCFAs的產(chǎn)生[35]。在本研究中，交泰丸增加CUMS大鼠的擬桿菌，阿克曼氏菌，毛螺菌科的豐度。因此，交泰丸可能通過調(diào)節(jié)腸道微生物的豐度來影響SCFAs的合成，從而產(chǎn)生一些抗抑郁作用。但是，腸道菌群和SCFAs關(guān)系在交泰丸治療抑郁癥的作用有待進(jìn)一步研究。

毛螺菌科和布勞特氏菌屬的豐度變化與抑郁癥的發(fā)展存在一定的相關(guān)性[23，36]。研究發(fā)現(xiàn)，抑郁癥患者的毛螺菌科和布勞特氏菌屬減少，但治療后增加[37-39]，這與本研究的結(jié)果一致。還觀察到瘤胃菌科豐度的下降。研究發(fā)現(xiàn)，瘤胃菌科是對照組和抑郁小鼠之間差異最豐富的分類單元[31]。另一項(xiàng)研究表明氯胺酮顯著降低抑郁大鼠瘤胃球菌科豐度[40]。交泰丸的抗抑郁作用可能與毛螺菌科、布勞特氏菌屬和瘤胃菌科的變化有關(guān)，但還需要更多的研究來更好地證明抑郁癥與腸道菌群變化之間的關(guān)系。

綜上所述，交泰丸可能通過調(diào)節(jié)腸道菌群的菌落豐度變化來發(fā)揮抗抑郁作用。交泰丸改善抑郁癥大鼠模型中主要腸道細(xì)菌豐度的新結(jié)果可能有助于闡明體內(nèi)抗抑郁藥的機(jī)制，對交泰丸用于臨床治療抑郁癥提供參考依據(jù)。然而，交泰丸干預(yù)腸道菌群從而影響抑郁癥的機(jī)制仍需要更進(jìn)一步的研究。