云南哈尼族地方水稻‘月亮谷’對褐飛虱取食危害的生理反應(yīng)

黃 鈺，陳 斌，肖關(guān)麗

（1云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，昆明 650201；2云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院，昆明 650201）

0 引言

水稻(Oryza sativaL.)是全球極其重要的糧食作物[1]。然而，害蟲是嚴重影響水稻產(chǎn)量和質(zhì)量的重要因素，其中對水稻種植影響較大的屬稻飛虱中的褐飛虱。褐飛虱(Nilaparvata lugensSt?l)是許多亞洲國家和中國水稻種植中最為首要的遷飛性害蟲，其發(fā)生范圍不斷擴大，危害嚴重[2]，蟲量大時可對水稻稻株造成嚴重傷害，使水稻大面積減產(chǎn)甚至顆粒無收[3-4]。此外，褐飛虱還會傳播水稻鋸齒葉矮縮病(Ragged stunt virus，RSV)和草狀矮縮病(Grassy stunt virus，GSV)等病毒病[5]。其中水稻抗性品種的嚴重缺乏是中國稻飛虱危害加重的重要原因之一[6]?！铝凉取?‘Acuce’)是云南省元陽哈尼梯田長期種植保留下來的優(yōu)良地方水稻品種，種植歷史悠久，有良好的病蟲害抗性[7]。研究‘月亮谷’對褐飛虱取食的主要防御反應(yīng)，探明其抗蟲機理，深入挖掘該品種優(yōu)良特性，為更好利用該地方品種提供理論依據(jù)。植物在與昆蟲長期的協(xié)同進化過程中，進化形成了減輕昆蟲取食對其傷害多種防御機制，如植株營養(yǎng)狀況的變化、產(chǎn)生次生代謝有毒物質(zhì)或防御蛋白等[8-9]。稻飛虱取食危害后水稻稻株內(nèi)的可溶性糖含量下降[10-12]，丙二醛(MDA)和過氧化氫(H2O2)含量上升[13-14]、多酚氧化酶(PPO)活性表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢變化[15]，過氧化物酶(POD)活性在為害后顯著升高[11]。然而，不同水稻品種對不同種類稻飛虱取食危害后的生理響應(yīng)不盡一致[10,16-17]。稻飛虱對化學(xué)農(nóng)藥的抗藥性的出現(xiàn)是制約稻飛虱有效防控的重要因素[18]，因此，利用水稻抗性品種控制稻飛虱已成為稻飛虱持續(xù)控制的重要措施，而開展水稻對稻飛虱取食危害的生理反應(yīng)格外重要。云南地處云貴高原，擁有十分豐富的地方稻種資源及抗性資源[19][20]。其水稻地方品種中蘊藏著新的抗性基因，具有豐富的遺傳多樣性，在改良水稻品種抗蟲性方面具有極高的利用價值[21]?！铝凉取窃颇显柟崽萏锓N植面積最大的主栽地方品種，有上百年的種植歷史，具有較強的抗病蟲害特性和豐富的遺傳多樣性，是研究水稻遺傳育種的理想材料[22-24]。研究褐飛虱取食脅迫對‘月亮谷’中可溶性糖、丙二醛(MDA)、過氧化氫(H2O2)含量，以及過氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)主要防御酶活性的影響，探明地方品種‘月亮谷’對褐飛虱取食脅迫的生理響應(yīng)。利用抗性品種控制稻飛虱的為害是最為經(jīng)濟有效的防治措施，探究水稻抗褐飛虱的機制是篩選和培育抗蟲品種的基礎(chǔ)工作。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

水稻品種為云南元陽哈尼族傳統(tǒng)水稻品種‘月亮谷’，由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物資源利用與保護國家重點實驗室提供。

抗、感褐飛虱水稻品種‘Rathu Heenati’(‘RHT’)和‘Taichung Native 1’(‘TN1’)均由中國水稻研究所提供。

褐飛虱在感蟲水稻品種‘TN1’上，飼養(yǎng)于云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院昆蟲實驗室的培養(yǎng)箱(28 ～30℃)內(nèi)。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗處理 播種前浸種催芽，水稻種子露白后在育苗盤中分別種植‘月亮谷’及抗感對照‘TN1’與‘RHT’3個水稻品種，待水稻幼苗長至2葉1心期，挑選各品種健康壯苗5株，移栽至準(zhǔn)備好的透明塑料杯(口徑90 mm、高度175 mm、容量700 mL)，雌雄比例1:1，每杯接入5對褐飛虱成蟲，然后用紗布對塑料杯封口，并置于恒溫培養(yǎng)箱中于16L:8D光周期，28 ～30℃，相對濕度70%±5%條件下飼養(yǎng)。試驗設(shè)3次重復(fù)，以不接褐飛虱的水稻苗作為空白對照。分別取對照和接蟲后3、6、12、24、48、72和96 h時水稻苗全部莖葉，分別裝入自封袋(100 mm×70 mm)并置于液氮速凍1 min，取出放入-80℃冰箱保存待測。

1.2.2 稻株可溶性糖含量測定 稱取樣品0.1 g，采用可溶性糖試劑盒，由蘇州格銳思生物科技有限公司生產(chǎn)（下同），分光光度計測定620 nm處的吸光值。利用測定數(shù)值計算可溶性糖含量。

1.2.3 稻株次生代謝產(chǎn)物含量測定

（1）稻株內(nèi)MDA含量測定 稱取樣品0.1 g，采用MDA試劑盒，分光光度計分別測定532 nm和600 nm處吸光值。利用測定數(shù)值計算MDA含量

（2）稻株H2O2含量測定稱取樣品0.1 g，采用H2O2試劑盒，分光光度計測定415 nm處的吸光值。利用測定數(shù)值計算H2O2含量。

1.2.4 稻株保護酶活性測定

（1）稻株P(guān)PO活性測定 稱取樣品0.1 g，采用PPO試劑盒，利用分光光度計測定420 nm時的吸光值。利用測定數(shù)值計算PPO含量。

（2）稻株P(guān)OD活性測定 稱取樣品0.1 g，采用POD試劑盒，分光光度計測定470 nm處的吸光值。利用測定數(shù)值計算POD含量。

1.3 統(tǒng)計分析

采用軟件Excel 2010整理試驗數(shù)據(jù)，利用單因素多重比較Duncan's新復(fù)極差法分析比較各測定數(shù)據(jù)間的差異顯著性，所有數(shù)據(jù)分析均在DPS 2005軟件中完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 褐飛虱為害后水稻可溶性糖含量變化

結(jié)果表明（圖1），褐飛虱取食3 h后，‘月亮谷’植株內(nèi)可溶性糖的含量顯著下降(P＜0.05)，降至谷值2.00 mg/gFW。而在取食脅迫6 h后，可溶性糖的含量又呈現(xiàn)上升，到48 h時達峰值8.98 mg/gFW，之后又緩慢下降；對于‘TN1’，褐飛虱取食3 h后，其體內(nèi)可溶性糖含量達谷值5.06 mg/gFW，取食12 h后，其可溶性糖含量達峰值13.67 mg/gFW，取食72 h時達第二個峰值12.90 mg/gFW，取食96 h后與對照相近；褐飛虱取食3 h后，‘RHT’的可溶性糖含量顯著下降，且在取食3 ～24 h后無顯著變化，取食48 ～72 h后又顯著增加，取食96 h后，‘RHT’可溶性糖含量又顯著下降。褐飛虱取食脅迫后，‘月亮谷’可溶性糖含量的變化趨勢與RHT可溶性糖含量的變化趨勢相近。

圖1 褐飛虱取食脅迫后水稻植株可溶性糖含量

從褐飛虱取食危害后供試水稻植株內(nèi)可溶性糖含量增加率來看（表1），褐飛虱取食3 ～96 h后，‘月亮谷’、‘TN1’和‘RHT’可溶性糖含量相較于對照平均增加了-42.85%、-21.78%和-39.46%，‘月亮谷’植株體內(nèi)可溶性糖含量增加率顯著低于‘TN1’，而與‘RHT’間無顯著差異。由此表明，褐飛虱取食危害后，‘月亮谷’和抗蟲品種‘RHT’較感蟲品種‘TN1’可溶性糖含量下降更為明顯。

表1 褐飛虱為害后水稻體內(nèi)可溶性糖、過氧化氫和丙二醛含量較對照的增降率%

續(xù)表1

2.2 褐飛虱為害后水稻過氧化氫含量的變化

由圖2可看出，褐飛虱取食脅迫3 h后，‘月亮谷’植株內(nèi)H2O2含量降低，取食6 h后，H2O2含量上升，取食12 h后，‘月亮谷’H2O2含量顯著下降，取食24 ～96 h后上升至高于對照水平，取食96 h達峰值10.29 U/gFW；褐飛虱取食3 h后，‘TN1’的H2O2含量略下降，取食6 ～48 h上升，取食48 ～96 h后H2O2含量基本不變并高于對照水平，取食96 h為峰值10.04 U/gFW；褐飛虱取食脅迫6 h后，‘RHT’的H2O2含量顯著下降，在取食12 h后顯著上升且接近對照水平，取食24 h后顯著下降，取食脅迫48 h后顯著上升，至取食72 ～96 h后H2O2含量緩慢下降，取食6 h為峰值8.15 U/gFW，且與對照無顯著差異。

圖2 褐飛虱取食脅迫后水稻體內(nèi)過氧化氫含量

從褐飛虱取食危害后供試水稻植株內(nèi)H2O2含量增加率來看（表1），取食3 ～96 h后，‘月亮谷’、‘TN1’和‘RHT’體內(nèi)H2O2含量相較于對照分別增加9.39%、42.25%和-19.74%，由此看出‘月亮谷’體內(nèi)的H2O2平均含量增加率高于抗蟲品種‘RHT’，但顯著低于感蟲品種‘TN1’。

2.3 褐飛虱為害后水稻丙二醛含量的變化

由圖3可知，褐飛虱取食脅迫3 h后，‘月亮谷’植株內(nèi)MDA含量下降，在取食6 ～24 h后上升并保持相近水平，取食48 h后顯著下降至最低值2.91 nmol/gFW，取食72h后上升并于取食96h上升至峰值6.34nmol/gFW；褐飛虱取食6 h后，‘TN1’的MDA含量顯著下降至最低值0.89 nmol/gFW，取食12 ～72 h后上升至峰值5.90 nmol/gFW，取食96 h時下降；褐飛虱取食3 ～6 h后，‘RHT’的MDA含量迅速增加，取食24 h后，‘RHT’的MDA含量顯著下降至最低值4.26 nmol/gFW，在取食48 h后上升，且取食脅迫72 ～96 h基本不變。

圖3 褐飛虱取食脅迫后水稻體內(nèi)丙二醛含量

從被褐飛虱取食脅迫后水稻植株內(nèi)MDA含量的增降率來看（表1），被取食脅迫3 ～96 h后，‘月亮谷’、‘TN1’和‘RHT’植株內(nèi)的MDA含量相較于對照分別增加了10.77%、87.81%和32.31%，‘月亮谷’植株體內(nèi)MDA含量平均增加率顯著低于‘TN1’和‘RHT’。由此表明，褐飛虱取食脅迫后，‘月亮谷’稻株內(nèi)MDA含量較感蟲品種‘TN1’和抗蟲品種‘RHT’的更低，且抗蟲品種‘RHT’的MDA含量平均增加率顯著低于感蟲品種‘TN1’。

2.4 褐飛虱為害后水稻多酚氧化酶活性的變化

由圖4可知，褐飛虱取食脅迫3 ～12 h后，‘月亮谷’植株內(nèi)PPO活性緩慢上升，取食24 h后時上升至第一峰值7.91 U/gFW，而在取食48 h后顯著下降，取食72 h顯著上升達峰值8.89 U/gFW后又下降；褐飛虱取食脅迫3 h后，‘TN1’的PPO活性迅速增加，并于取食6 h上升至峰值19.47 U/gFW，取食12 h后顯著低于對照，取食12 ～48 h后上升達峰值19.47 U/gFW，取食72 h下降后又上升；褐飛虱取食脅迫3 h后，‘RHT’的PPO活性顯著下降，在取食6 h后迅速降至接近對照水平，取食24 h后下降至最低值2.67 U/gFW，取食48 h后增加至峰值14.49 U/gFW，取食72 ～96 h后緩慢下降。

圖4 褐飛虱取食脅迫后水稻多酚氧化酶活性

由表2可知，褐飛虱取食脅迫3 ～96 h后，‘月亮谷’、‘TN1’和‘RHT’的PPO活性相較于對照的平均增加率分別為49.96%、241.87%和0.89%，表明‘月亮谷’體內(nèi)PPO活性平均增加率顯著低于感蟲品種‘TN1’，而與抗蟲品種‘RHT’間無顯著差異。

表2 褐飛虱為害后水稻體內(nèi)PPO和POD活性較對照的增降率 %

2.5 褐飛虱為害后水稻過氧化物酶活性的變化

由圖5可知，褐飛虱取食脅迫3 h后，‘月亮谷’POD活性顯著下降，在取食6 h后又顯著上升至峰值475.28 U/gFW，取食24 h后下降至最低值62.93 U/gFW，之后波動上升至高于對照水平；褐飛虱取食脅迫3 h后，‘TN1’的POD活性顯著下降，在取食6 h后又顯著上升至除對照外最高值220.80 U/gFW，取食12 h后下降，取食48 h下降至最低值23.70 U/gFW，取食72 ～96 h上升；褐飛虱取食脅迫3 h后，‘RHT’的POD活性顯著下降，在取食6 h后又顯著上升至峰值293.98 U/gFW，取食12 h后下降至最低值118.37 U/gFW，之后波動上升至高于對照水平。

圖5 褐飛虱取食脅迫后水稻過氧化物酶活性

由表2可知，褐飛虱取食3 ～96 h后，‘月亮谷’、‘TN1’和‘RHT’的POD活性相較于對照的平均增加率分別為-14.75%、-45.01%和1.75%，表明‘月亮谷’體內(nèi)POD活性平均增加率顯著低于抗蟲品種‘RHT’，高于感蟲品種‘TN1’。

3 討論

植食性昆蟲從植物中獲取生長的必要物質(zhì)，昆蟲的生長代謝直接受植物的營養(yǎng)物質(zhì)含量影響，因此，植物通過降低營養(yǎng)物質(zhì)含量，來達到抗蟲目的[25]。段燦星等[26]研究報道，抗感水稻品種的可溶性糖含量在灰飛虱為害后均下降，且感蟲品種下降幅度顯著大于抗蟲品種，而本研究中水稻被褐飛虱取食脅迫后，供試‘月亮谷’及抗蟲和感蟲品種稻株內(nèi)可溶性糖含量均降低，但抗蟲品種體內(nèi)可溶性糖含量下降幅度顯著大于感蟲品種。蟲害誘導(dǎo)后，植物中的可溶性糖轉(zhuǎn)化為次生物質(zhì)，降低了植物的適口性，植物內(nèi)營養(yǎng)成分缺少，阻礙昆蟲取食。本研究發(fā)現(xiàn)，褐飛虱取食后，水稻‘月亮谷’的可溶性糖含量較對照顯著下降，且在取食為害后的多數(shù)時期可溶性糖含量低于對照，表明水稻植株通過減少稻株內(nèi)的可溶性糖含量以響應(yīng)稻飛虱的取食脅迫。此外，褐飛虱為害后，‘月亮谷’稻株內(nèi)可溶性糖含量的下降趨勢與抗蟲品種‘RHT’相近，由此推測，‘月亮谷’與抗蟲品種‘RHT’能通過降低可溶性糖含量來表現(xiàn)對褐飛虱的抗性。

害蟲的取食危害脅迫能影響植物體內(nèi)活性氧代謝系統(tǒng)的平衡，破壞膜結(jié)構(gòu)[13]。MDA含量高低能夠指示植物細胞膜發(fā)生細胞膜脂過氧化程度[27]，也可用來表示植物抗逆境反應(yīng)的強弱[28]。而H2O2是植物體內(nèi)主要的活性氧，植物體內(nèi)H2O2含量可作為昆蟲對植物傷害強弱的生理指標(biāo)[29]。本研究發(fā)現(xiàn)，褐飛虱取食脅迫后，‘月亮谷’植株內(nèi)H2O2含量明顯上升，顯著高于抗蟲品種‘RHT’體內(nèi)H2O2含量，但卻顯著低于感蟲品種‘TN1’。表明褐飛虱為害后，會誘導(dǎo)H2O2在水稻‘月亮谷’體內(nèi)積累，增加至一定程度時引起水稻‘月亮谷’的防御反應(yīng)；同時，水稻稻株內(nèi)過量積累的H2O2使水稻過氧化而造成損傷，因此，感蟲品種‘TN1’的MDA含量顯著增加。

昆蟲為害植物后，植物體內(nèi)的防御酶就會被誘導(dǎo)或抑制，從而保護植物達到防御目的[30-31]。PPO是一類催化酚類化合物氧化為醌的酶，能夠阻礙昆蟲營養(yǎng)的利用，PPO的過量表達，一定程度上在植物蟲害脅迫中起著重要的作用[33-34]。不同水稻品種的PPO活性均上升，且‘月亮谷’PPO活性增加率與抗蟲品種‘RHT’無顯著差異，表現(xiàn)出相似的防御反應(yīng)。

過氧化物酶(POD)是一種在植物中廣泛存在清除過量活性氧的氧化還原酶，同時也是植物抗逆反應(yīng)過程中的關(guān)鍵酶之一，在一定程度上使植物抵御逆境脅迫傷害[32]。本研究中，云南哈尼族地方傳統(tǒng)水稻‘月亮谷’和感蟲品種‘TN1’受褐飛虱為害后，其稻株內(nèi)防御酶POD活性反而下降，而抗蟲品種‘RHT’的POD活性略增加，這與前人結(jié)果相反[16]。受褐飛虱取食為害后，不同水稻品種的不同防御酶協(xié)同作用，不同試驗處理及試驗方法對試驗結(jié)果會產(chǎn)生較大的影響，產(chǎn)生不同甚至相反的結(jié)果，需要進一步的研究。

本研究中的云南地方品種‘月亮谷’僅在云南地區(qū)進行種植和試驗，適用范圍較窄，對全國范圍內(nèi)不同氣候的適應(yīng)性不明確，需要進行更大范圍的試驗點種植及完善的試驗。而且本研究中僅僅進行了3個水稻品種的三葉期褐飛虱成蟲取食脅迫試驗，未進行大量水稻品種、不同水稻生長時期與褐飛虱不同時期蟲態(tài)之間的取食試驗；試驗的水稻株數(shù)與單株水稻上的取食褐飛虱數(shù)量均較少，其試驗結(jié)果存在偶然性，在今后應(yīng)進行更加系統(tǒng)的試驗。水稻‘月亮谷’對褐飛虱的抗性機制有待深層次的挖掘研究。

4 結(jié)論

本探究發(fā)現(xiàn)褐飛虱取食脅迫后，‘月亮谷’稻株內(nèi)可溶性糖含量下降42.85%，與抗蟲品種‘RHT’(-39.46%)無明顯差異，而顯著小于感蟲品種‘TN1’(-21.78%)；H2O2含量增加9.39%，低于感蟲品種‘TN1’42.25%)而顯著高于抗蟲品種RHT(-19.74%)；MDA平均含量增加10.77%，增加率顯著低于‘TN1’(87.81%)和‘RHT’(32.31%)；多酚氧化酶(PPO)平均活性增加49.96%，過氧化物酶(POD)活性下降，其中PPO平均活性增加率(49.96%)與‘RHT’(0.89%)無明顯差異，而顯著低于‘TN1’(241.87%)；POD平均活性下降增加率(-14.75%)均顯著低于‘RHT’(1.75%)但高于‘TN1’(-45.01%)。云南哈尼族地方水稻品種‘月亮谷’通過試驗測定的各項生理指標(biāo)均與抗蟲品種‘RHT’反應(yīng)較相似，具有良好的防御系統(tǒng)應(yīng)對褐飛虱的取食為害，云南地方水稻品種‘月亮谷’可作為良好的抗褐飛虱育種材料應(yīng)用于水稻生產(chǎn)。