自體骨髓干細(xì)胞移植治療足毀損傷伴重度皮膚缺損的臨床研究

劉儀紅，王普杰，田浩明，周毅，鄧勇（綿陽市解放軍第50醫(yī)院糖尿病防治中心,四川綿陽6000，四川大學(xué)華西醫(yī)院內(nèi)分泌代謝科，瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院泌尿外科）

自體骨髓干細(xì)胞移植治療足毀損傷伴重度皮膚缺損的臨床研究

劉儀紅，王普杰，田浩明1，周毅，鄧勇2
（綿陽市解放軍第520醫(yī)院糖尿病防治中心,四川綿陽621000，1四川大學(xué)華西醫(yī)院內(nèi)分泌代謝科，2瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院泌尿外科）

目的:評價自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymalstem cells,MSCs）移植治療對足毀損傷伴皮膚缺損臨床療效及觀察有無移植相關(guān)排異反應(yīng)和成瘤性。方法:確診的2型糖尿病患者車禍后右足毀損傷伴重度皮膚缺損患者1例,將自體MSCs混懸液注射移植到該患者的足部缺損傷口，術(shù)后實時跟蹤傷口恢復(fù)情況，并隨訪34個月觀察干細(xì)胞移植后致瘤性和修復(fù)后的皮膚組織學(xué)變化。結(jié)果：患者在采用外科常規(guī)治療及缺損創(chuàng)面進(jìn)行了兩次自體皮膚移植等治療64 d無效后，即給予足部皮膚缺損處先后兩次行自體MSCs移植術(shù)，術(shù)后第3 d開始，患者右足疼痛、冷感和麻木感開始好轉(zhuǎn),皮膚缺損處膿性分泌物開始減少，局部腫脹開始消退,傷口逐漸縮小，第二次術(shù)后第36 d傷口痊愈。未出現(xiàn)任何并發(fā)癥和不良反應(yīng)。34個月后隨訪發(fā)現(xiàn)，接受MSCs移植的足底局部情況穩(wěn)定,無移植相關(guān)的免疫排斥等并發(fā)癥的發(fā)生。同時手術(shù)切取已愈合傷口的局部皮膚組織，行病理切片檢查發(fā)現(xiàn)，與正常皮膚組織病理上無顯著差異，且無成瘤跡象。結(jié)論：采用自體MSCs移植治療糖尿病足毀損傷伴皮膚缺損的臨床療效顯著且相對安全，該療法對糖尿病術(shù)后及各種外傷所致皮膚缺損的治療提供現(xiàn)實依據(jù)和臨床參考。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞;自體移植;足毀損傷;皮膚缺損；成瘤性

近年來，隨著細(xì)胞組織工程學(xué)(tissueengineering，TE)的發(fā)展，利用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞MSCs的種種優(yōu)點，用于細(xì)胞治療、基因治療以及組織工程的細(xì)胞源已成為目前研究的熱點之一[1-2]。2002年，Inaba等[3]和TateishiYuyama等[4]在國際上率先報道了應(yīng)用骨髓造血干細(xì)胞移植治療周圍血管病。目前，動物實驗表明自體骨髓單個核細(xì)胞植入缺血的肢體可分化成血管內(nèi)皮細(xì)胞，而促使局部血管形成,均提示了干細(xì)胞移植可以用于治療糖尿病肢體缺血性疾病及皮膚嚴(yán)重缺損[5-7]。

我們于2011年1月25日起，先后兩次為糖尿病患者車禍后致右足毀損傷伴皮膚缺損實施了自體MSCs移植術(shù),術(shù)后對臨床療效、有無移植相關(guān)排異反應(yīng)及成瘤性等并發(fā)癥方面進(jìn)行全面的臨床觀察和研究?，F(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 患者基本情況

患者男，59歲，工人，因車禍致右足毀損傷3 h于2010年11月22日以“右足毀損傷”收入我院手足外科住院治療。10年前，在地方醫(yī)院確診為“糖尿病”，并長期服用降糖藥物，血糖控制不佳。體格檢查：生命體征平穩(wěn)。神志清楚，精神欠佳，急性痛苦病容，被動體位，查體欠合作。心肺腹部均未見異常。專科情況：右足可見皮膚挫傷創(chuàng)面約10.0 cm×15.0 cm（見圖1，A），右足背皮膚撕脫，可見大量斷裂的血管神經(jīng)肌腱，第一楔骨脫位外露，創(chuàng)面挫傷污染嚴(yán)重，足背動脈搏動消失，遠(yuǎn)端各趾皮色蒼白、無血運。初步診斷：右足血管神經(jīng)肌腱斷裂；右足背、足底皮膚大面積缺損；右足第一楔骨骨折并脫位；右下肢皮膚大面積挫傷；2型糖尿病。入院后立即急診在硬膜外麻醉下行“清創(chuàng)探查血管神經(jīng)肌腱修復(fù)術(shù)、骨折內(nèi)固定術(shù)”，并先后兩次行“自體皮膚移植術(shù)”，但術(shù)后出現(xiàn)移植皮膚壞死并伴大量膿性滲出物及腥臭味，創(chuàng)面肉芽組織生長緩慢。經(jīng)過全院專家會診后認(rèn)為，建議實施右足截肢術(shù)，但患者本人不同意而自愿選擇自體干細(xì)胞移植術(shù)。因此，在我院倫理委員會討論通過及患者簽訂知情同意書后，于2011年1月25日及2011年2月11日，先后2次為患者行自體干細(xì)胞移植術(shù)。術(shù)后第3 d開始，患者右足疼痛、冷感和麻木感開始好轉(zhuǎn),皮膚缺損處膿性分泌物開始減少，局部腫脹開始消退,傷口逐漸縮小，第2次術(shù)后第36 d傷口痊愈出院。移植術(shù)治療前后，患者血糖控制基本達(dá)標(biāo)（見表1）。

表1 自體骨髓干細(xì)胞移植治療前后糖尿病治療方案及血糖監(jiān)測表

1.2 試劑

淋巴細(xì)胞分離液購自上海前塵生物科技有限公司；二甲苯，蘇木精伊紅染液購自上海源葉生物科技有限公司；DMEM完全培養(yǎng)基購自Invitrogen公司；青鏈霉素購自南京凱基生物發(fā)展有限公司；胎牛血清購自Gibco公司。

1.3 自體骨髓采集

患者完成術(shù)前檢查后，在手術(shù)當(dāng)天晨禁食水,在手術(shù)室取俯臥位,常規(guī)消毒鋪巾,準(zhǔn)備好血袋和保養(yǎng)液,局麻下取兩側(cè)髂后上棘為采髓部位,沿髂骨上緣外側(cè)每隔1cm為一個皮膚進(jìn)針點進(jìn)行骨髓采集,每點每次抽吸骨髓10ml,共采集骨髓約50m l。

1.4 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離

在無菌超凈臺上將采集的骨髓用2倍量的生理鹽水稀釋,吸取稀釋液小心加在淋巴細(xì)胞分離液上(兩者比例為2∶1)。室溫下離心20min,離心速度為1800～2000 r/min。小心吸取離心管中白膜層,轉(zhuǎn)移至潔凈離心管中,離心速度為1500 r/min,離心時間10 min。分離出單個核細(xì)胞后在體外擴(kuò)增14 d后傳至第3代，沉淀物用30ml生理鹽水稀釋成適用濃度的干細(xì)胞懸液,取1μl稀釋后于顯微鏡下觀察形態(tài)和細(xì)胞計數(shù)為6×106/m l以備用。

1.5 自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植

在手術(shù)室嚴(yán)格無菌條件下操作,在硬膜外麻醉下，首先將患者右足底及足背皮膚缺損處常規(guī)清創(chuàng)后，將MSCs干細(xì)胞混懸液一次性注射在缺損創(chuàng)面,術(shù)后用無菌紗布及繃帶保護(hù)創(chuàng)面。

1.6 傷口恢復(fù)觀察

患者足部皮膚缺損部位的術(shù)前創(chuàng)面和術(shù)后恢復(fù)情況用數(shù)碼相機(jī)拍照記錄，同時觀察患者有無移植排異反應(yīng)和手部炎癥腫脹情況。

1.7 HE染色

移植術(shù)后30個月，手術(shù)取右足局部已痊愈的皮膚組織，大小約0.5 cm×0.2 cm，經(jīng)4%多聚甲醛固定過夜。乙醇梯度脫水后進(jìn)行石蠟包埋。切片后二甲苯脫蠟透明，并重新水化。切片由蘇木素伊紅順次染色。封片并顯微觀察皮膚病理變化。

2 結(jié)果

2.1 癥狀和體征

移植后第3 d天開始，患者即感覺右足疼痛、冷感和麻木感開始好轉(zhuǎn),局部膿性分泌物明顯減少，局部腫脹開始減輕，局部缺血狀況也逐漸改善，缺損面逐漸縮小。

2.2 感染傷口愈合情況

第一次移植術(shù)后第3 d觀察發(fā)現(xiàn)，右足底皮膚缺損傷口處膿性分泌物開始減少，腫脹有所減輕（見圖1，B），第9d后傷口大小由原來的10.0cm×15.0cm逐漸縮小成9.0 cm×13.0 cm，局部缺血狀況也逐漸改善；第二次移植術(shù)后第3 d觀察發(fā)現(xiàn)，局部傷口膿性分泌物明顯減少，腫脹減輕，傷口大小縮小成7.0 cm×11.0 cm（見圖1，C），第7 d局部傷口表面無膿性分泌物滲出，可見新生肉芽組織形成，傷口縮小成7.0 cm×10.0 cm（見圖1，D），第二次移植術(shù)后第36 d，傷口痊愈（見圖1，E）。

圖1 右足自體骨髓干細(xì)胞移植術(shù)前后傷口愈合情況

2.3 相關(guān)并發(fā)癥

患者骨髓干細(xì)胞移植后骨髓穿刺點傷口很快愈合，無異常癥狀或體征出現(xiàn);血、小便、大便三大常規(guī)及肝、腎功能等生化檢查均未見異常。

2.4 組織學(xué)觀察新生皮膚

該患者30個月后再次來我院門診隨訪復(fù)查發(fā)現(xiàn)，接受骨髓干細(xì)胞移植的右足局部情況穩(wěn)定,無移植相關(guān)的免疫排斥等并發(fā)癥的發(fā)生（見圖1，F(xiàn)）。同時手術(shù)切取了已愈合傷口的局部全層皮膚組織一塊，大小為0.5 cm×0.2 cm，并行病理切片HE染色檢查。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，表皮輕度增生伴角化過度，局灶區(qū)基底細(xì)胞色素增加，真皮淺層膠原纖維增生、變性和小血管周圍少量淋巴細(xì)胞浸潤。但與正常皮膚組織在病理上無顯著差異，且無腫瘤跡象（見圖2）。

圖2 右足干細(xì)胞移植術(shù)后痊愈皮膚局部病理切片（術(shù)后30個月）

3 討論

大量的動物實驗證實，利用MSCs作為種子細(xì)胞構(gòu)建組織工程皮膚對皮膚缺損具有顯著促愈作用,創(chuàng)面經(jīng)修復(fù)后具有全層皮膚結(jié)構(gòu)[8-10]。方利君等[11]通過動物實驗的研究，發(fā)現(xiàn)創(chuàng)面愈合過程中,MSCs與肉芽組織中小血管的形成密切相關(guān)。因此在創(chuàng)面微環(huán)境下,MSCs可分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞,并參與皮膚缺損創(chuàng)面的修復(fù)。研究表明,MSCs可分化成血管內(nèi)皮細(xì)胞并應(yīng)用于治療缺血性疾病[12-15]。Rathnavelpandian S等[16]等利用單個核細(xì)胞治療了6例糖尿病嚴(yán)重肢體缺血及皮膚缺損，臨床效果顯著，接受自體干細(xì)胞移植的患者全部避免了截肢。

本例系一例糖尿病患者車禍后右足毀損傷致傷口嚴(yán)重感染伴皮膚重度缺損，傷口局部出現(xiàn)明顯血運不良及頑固性傷口不愈合等，入院后經(jīng)常規(guī)胰島素泵強化治療、抗感染及傷口局部清創(chuàng)換藥等綜合治療64 d余，病情未見好轉(zhuǎn)，但采用自體MSCs移植治療72 h后患者即感覺右足疼痛、冷感和麻木感開始好轉(zhuǎn),局部腫脹也開始消退,感染傷口膿性分泌物明顯減少，傷口面積逐漸縮小，直至完全愈合，臨床療效較顯著，并且避免了截肢。但由于目前有不少學(xué)者質(zhì)疑[17-19]，MSCs移植到體內(nèi)會不會使得細(xì)胞產(chǎn)生多種形式的基因突變，會不會如腫瘤細(xì)胞一樣無限增殖和生長，甚至引發(fā)腫瘤的形成等安全性方面的擔(dān)憂。然而，據(jù)專家們預(yù)測人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（human induced pluripotentstem cells，IPSC）其潛在的致瘤性等于或高于胚胎干細(xì)胞。因此，基于以上種種對干細(xì)胞成瘤性的擔(dān)憂，我們針對該患者進(jìn)行了進(jìn)一步的隨訪觀察和臨床研究。在患者出院30個月后，再次聯(lián)系到我院門診隨訪復(fù)查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)接受自體MSCs移植的右足已痊愈的傷口局部情況穩(wěn)定（見圖1，F(xiàn)）,無移植常見的免疫排斥等并發(fā)癥的發(fā)生，同時取已愈合傷口的局部行全層皮膚組織病理切片檢查發(fā)現(xiàn)，與正常皮膚組織在病理上無明顯差異，且無腫瘤的形成（見圖2）。因此，在臨床采用自體MSCs體外擴(kuò)增移植療法可能成為一種簡便、有效的治療嚴(yán)重皮膚缺損的新手段、新策略,同時也可以解決創(chuàng)傷后皮膚重度缺損傷口的嚴(yán)重感染及局部血運不佳等問題，且無移植相關(guān)排斥反應(yīng)及腫瘤形成等,從而達(dá)到治療的目的。另外，本研究還可以為在臨床上應(yīng)用自體MSCs移植技術(shù)治療各種外傷所致皮膚缺損提供一條新的治療路徑。

我們認(rèn)為,今后在臨床上開展自體MSCs移植治療各種外傷所致皮膚缺損的臨床試驗的方法學(xué)還有待于提高，應(yīng)當(dāng)進(jìn)行高質(zhì)量的多中心、隨機(jī)、雙盲對照試驗，以進(jìn)一步證實這種新的治療方法的臨床療效。目前MSCs的分化機(jī)制和誘導(dǎo)條件及其治療皮膚缺損確切的機(jī)制方面尚不清楚，但推測其可能的機(jī)制[11]為，在創(chuàng)面微環(huán)境中MSCs可分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞而參與創(chuàng)面修復(fù),促進(jìn)新生血管的形成，此外，MSCs在移植局部被誘導(dǎo)分化為內(nèi)皮細(xì)胞,并在局部釋放多種細(xì)胞因子以及信號的傳導(dǎo)等相關(guān)問題，都還有待于我們通過動物實驗及基礎(chǔ)研究得到進(jìn)一步的證實。此外，對自體MSCs移植相關(guān)的免疫排異反應(yīng)、成瘤性及遠(yuǎn)期療效等方面做進(jìn)一步更加嚴(yán)密的科學(xué)觀察和臨床研究還是很有必要的。

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（2013-12-02收稿）

Bone-m arrow stem cellautotransp lantation treating one caseof footdestructive injuryw ith severeskin defect

Liu Yihong，Wang Pujie，Tian Haoming1，Zhou Yi,Deng Yong2
Diabetic Centre of Control and Prevention，the PLA 520 Hospital；1Department of Endocrinology and Metabolism,WestChina Hospitalof Sichuan University；2DepartmentofUrological Surgery，the Affiliated Hospitalof LuzhouMedicalCollege

Objective：Toevaluate thecurativeeffectof autotransplantation ofmesenchymalstem cells(MSCs)on foot destructive injury with infection and severe skin defectand to observe if there were rejection and tumorigenic change.Methods：A patientwith foot destructive injury，and a ten-year history of type 2 diabetes,after in effective routine therapy and twice skin grafting was treated with MSCs autotransplantation.MSCs were harvested from the patient'sbonemarrow.The autologousMSC suspensionwas twice injected into the skin defectof foot after theblood glucose levelbeing stabilized.The patientwas followed up.Results：36 daysafter the second autotransplantation,the skin defect healed.During 34 month postoperative follow-up,the patient showed immediate recovery with no transplant-related complications,or tumorigenic changes.Conclusion:The transplantation of autologous MSCs is effective in the clinical treatmentofskin defecteitherafter surgery ofdiabetic patientsor resulted from other various traumas.

Stem cells；Autotransplantation；Destructive injuryof foot；Skin defect；Tumorigenic change

R658

A

10.3969/j.issn.1000-2669.2014.02.017

劉儀紅(1970-)，女，主任醫(yī)師，E-mail:lyh9504@126.com