PCR技術(shù)在食品微生物檢測中的運(yùn)用

王忠桂

摘 要：當(dāng)今食品安全問題成為人們關(guān)注的重點(diǎn)問題，食品行業(yè)機(jī)構(gòu)和相關(guān)部門一直致力于探尋低成本、高效率、方便快捷的微生物檢測方法，為食品生產(chǎn)加工過程中的質(zhì)量監(jiān)督提供可行方案。本文對PCR技術(shù)的種類、特點(diǎn)與優(yōu)勢、應(yīng)用范圍、所面臨的問題以及在食品微生物檢測中的運(yùn)用和發(fā)展情況進(jìn)行研究，為食品行業(yè)和相關(guān)部門提供參考和借鑒依據(jù)。

關(guān)鍵詞：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)（PCR）;食品;微生物

Application of PCR Technology in the Detection of Food Microorganisms

WANG Zhonggui

（Hebei Lvnong Testing Technology Service Co.， Ltd.， Langfang 065400， China）

Abstract： Food safety issues in today’s society have become the focus of people’s attention. Food industry organizations and related departments have been committed to exploring low-cost， high-efficiency， convenient and quick microbial detection methods to provide feasible solutions for quality supervision in food production and processing. This paper studies the types， characteristics and advantages， application scope， problems faced and application and development of PCR technology in food microbial detection， and provides a reference for the food industry and related departments.

Keywords： Polymerase Chain Reaction（PCR）; food; microorganism

我國現(xiàn)階段的食品工業(yè)發(fā)展已進(jìn)入關(guān)鍵轉(zhuǎn)型升級期，由高速增長階段邁向高質(zhì)量發(fā)展階段。食品的質(zhì)量安全作為人們生活中的首要問題，與人們的生活健康息息相關(guān)，逐漸成為社會關(guān)注的熱點(diǎn)。食品安全是食品行業(yè)保持健康發(fā)展的基石[1]。食品生產(chǎn)過程中一旦發(fā)生微生物污染，將會對人體的健康產(chǎn)生危害。因此，需要加強(qiáng)食品中的微生物檢測來提升食品質(zhì)量安全[2]。PCR技術(shù)是一種較先進(jìn)的檢測技術(shù)，在多個領(lǐng)域均有較廣泛應(yīng)用，在食品微生物檢測領(lǐng)域，PCR技術(shù)具有準(zhǔn)確性高、操作便捷的特點(diǎn)，可有效檢測食品中的微生物含量。因此，食品微生物檢測中需摒棄操作復(fù)雜且準(zhǔn)確率差的檢測方法，發(fā)揮PCR技術(shù)的特點(diǎn)和優(yōu)勢，提高食品微生物檢測的時效性和準(zhǔn)確性[3]。

1 PCR技術(shù)概述

1983年MILLUS博士發(fā)明了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）技術(shù)，該技術(shù)是一種能對生物體DNA進(jìn)行復(fù)制、擴(kuò)增的技術(shù)，可對特定生物體的特定DNA的序列進(jìn)行復(fù)制擴(kuò)增。PCR技術(shù)的DNA擴(kuò)增過程分為3個階段，即變性階段、退火階段、延伸階段。變性階段中將DNA雙鏈打開;在退火階段中將特性異物與打開的DNA單鏈進(jìn)行結(jié)合;在延伸階段中，使用DNA聚合酶以DNA單鏈為模板進(jìn)行DNA的合成，實現(xiàn)DNA分子的大量擴(kuò)增，從而獲得大量的DNA分子并進(jìn)行檢測分析[4]。PCR技術(shù)的特殊性在食品微生物檢測中得到廣泛應(yīng)用，通過PCR技術(shù)對食品中所含有的微生物的DNA進(jìn)行檢測，以確定食品中含有的微生物的含量和種類。PCR技術(shù)可以提高食品微生物的檢出率、時效性以及準(zhǔn)確性，及時排除食品微生物污染對人們健康的威脅，提高食物安全屏障。

2 PCR技術(shù)的應(yīng)用類型

2.1 普通PCR技術(shù)

通過PCR技術(shù)可以特異性地擴(kuò)充待檢微生物的基因片段，以實現(xiàn)快速獲得檢驗結(jié)果的目的，與傳統(tǒng)檢測方法相比，PCR技術(shù)具有操作便捷、靈敏度高的特點(diǎn)，檢測人員一般只要幾個小時即可完成食品微生物的測定工作。其缺點(diǎn)是在目前的實際應(yīng)用中，尚無法對待檢測樣品中的活體細(xì)胞和死亡細(xì)胞進(jìn)行鑒別，只能對已知微生物的核酸序列進(jìn)行測定。因此，還需要對食品中微生物對PCR技術(shù)的特異性反應(yīng)進(jìn)行更深入的研究。

2.2 多重PCR技術(shù)

多重PCR技術(shù)（Multiplex Polymerase Chain Reaction，mPCR）的工作原理是在同一PCR擴(kuò)增過程中加上兩對以上的引物，實現(xiàn)一次性完成多個核酸片段擴(kuò)增的目的，使檢測過程更加方便、快捷。例如，大腸桿菌、致病性弧菌和沙門氏菌等細(xì)菌就可以進(jìn)行同步檢測。與傳統(tǒng)檢測方法需大量生化實驗相比，多重PCR技術(shù)可通過一次性擴(kuò)增來進(jìn)行批量檢測，實用性和應(yīng)用性較強(qiáng)。在食品微生物檢測工作中，結(jié)合國家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，多重PCR技術(shù)可大量減少檢驗工作量，縮短檢測時間，進(jìn)行快速初篩，在大幅提升工作效率的同時還可以降低檢測成本[5]。多重PCR技術(shù)的缺點(diǎn)是存在假陰性的情況。因此，需提升樣品質(zhì)量，排出干擾因子的影響，改進(jìn)樣品處理工作。

2.3 實時熒光定量PCR技術(shù)

熒光定量PCR技術(shù)（Quantitative Real-time PCR）屬于分子生物學(xué)范疇，因此該技術(shù)可以結(jié)合先進(jìn)生物技術(shù)進(jìn)行應(yīng)用，是在普通PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上利用熒光特性的不同進(jìn)行核酸定量測定，具有敏感度高、檢測范圍寬、穩(wěn)定性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，且該方法無需進(jìn)行PCR后續(xù)處理，可有效避免交叉感染，保障檢查結(jié)果的精準(zhǔn)性，目前在國內(nèi)外食品微生物快速檢測領(lǐng)域已廣泛應(yīng)用到熒光定量PCR技術(shù)[6]。但熒光定量PCR技術(shù)依然存在假陽性結(jié)果的缺點(diǎn)，且儀器設(shè)備昂貴，使用成本較高。

2.4 RT-PCR檢測技術(shù)

逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）是一種更先進(jìn)的檢測技術(shù)，食品中所含有的大部分微生物種類均能使用該技術(shù)進(jìn)行檢測，且檢測準(zhǔn)確度高、靈敏性強(qiáng)，還可用于檢測食品中含有的不同微生物種類，對不同微生物的特征進(jìn)行區(qū)分。

3 PCR技術(shù)的特點(diǎn)和優(yōu)勢

傳統(tǒng)食品微生物檢測一般采用顯微鏡直接觀察法和平板計數(shù)法，傳統(tǒng)檢測方法的工作原理是對活菌的總數(shù)進(jìn)行人工測定，以上兩種檢測方法具有設(shè)備簡易、操作簡單且成本低廉的優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用較為廣泛。但這兩種方法也存在明顯的缺點(diǎn)，其操作過程和結(jié)果較依賴于檢測人員的操作技術(shù)和鑒別能力，具有一定的主觀性，且整個檢測過程工作較煩瑣，試驗周期較長。因此，這兩種檢測方法難以保證其結(jié)果的客觀性、準(zhǔn)確性和時效性，特別是在進(jìn)行大批量檢測工作時，所需人力、物力較大且時效性非常差[7-8]，而使用PCR技術(shù)進(jìn)行食品微生物檢測，可快速得到檢測結(jié)果，時效性高且準(zhǔn)確率能得到保障。

3.1 操作流程便捷

傳統(tǒng)食品微生物檢測工作周期長、時效性差、檢查結(jié)果具有主觀性、欠缺準(zhǔn)確度和整體工作效率較低。而應(yīng)用PCR技術(shù)只需一名工作人員即可進(jìn)行檢測工作，時效性和準(zhǔn)確率高。

3.2 準(zhǔn)確率高

食品中含有的微生物數(shù)量和種類較多，不同種類的微生物具有不同特征，造成檢測方法差異較大，傳統(tǒng)檢測方法難以對微生物種類進(jìn)行鑒別區(qū)別。PCR技術(shù)可依據(jù)其技術(shù)特點(diǎn)對微生物種類進(jìn)行有效鑒別與區(qū)分，是保障食品安全的重要技術(shù)。

3.3 時效性高

傳統(tǒng)食品微生物檢測技術(shù)對一般菌種的檢測需花費(fèi)2 d以上的時間才能得到檢測結(jié)果，時效性較差，對于突發(fā)性食品安全事件無法及時采取有效應(yīng)對措施，滯后的檢測結(jié)果會導(dǎo)致受微生物污染的食品流入市場，對消費(fèi)者的健康造成較大危害。PCR技術(shù)的檢測過程在1 d內(nèi)即可完成，可快速、及時地得到檢測結(jié)果，對指導(dǎo)食品安全生產(chǎn)以及保障消費(fèi)者的健康安全具有重要意義[9]。

4 PCR技術(shù)在食品微生物檢測中應(yīng)用

4.1 致病菌的檢測

在食品微生物檢測工作中，致病菌是一項重要檢測項目，傳統(tǒng)檢測方法操作過程較煩瑣，需進(jìn)行菌種培養(yǎng)、收集分離以及檢測等環(huán)節(jié)，檢測周期一般在5 d以上，限制了食品監(jiān)督部門的工作效率，而PCR技術(shù)可有效縮減致病菌檢測周期，提高食品監(jiān)督部門的工作效率。致病菌的檢測流程如下。①富集細(xì)菌，通過離心過濾等方式進(jìn)行細(xì)菌分離;②裂變過程，將獲得的DNA進(jìn)行檢測;③使用特異性核酸探針和電泳來完成檢測DNA序列的工作，最終確定病菌的數(shù)量和種類。PCR技術(shù)在致病菌檢測上始于沙門氏菌，目前對該病菌的檢測方案已較為成熟[10]。隨著技術(shù)發(fā)展，PCR技術(shù)也在不斷拓寬技術(shù)應(yīng)用范圍，不僅可以對沙門氏菌進(jìn)行有效檢測，還能應(yīng)用于金黃色葡萄球菌的檢測。

4.2 非致病菌的檢測

PCR技術(shù)可有效檢測食品中的非致病菌，但對于非致病菌的檢測范圍存在局限性，對食品中乳酸菌的檢測應(yīng)用較多。乳酸菌是一種分布廣泛的非致病菌，具有較高的生物學(xué)價值。研究表明，大部分乳酸菌有益于人體健康，少部分乳酸菌對消費(fèi)者健康存在危害。乳酸菌對各種生長環(huán)境的適應(yīng)性較強(qiáng)，即使真空中乳酸菌也能生存。在食品生產(chǎn)中，乳酸菌應(yīng)用較廣，常作為添加劑來使用。部分乳酸菌可作為防腐劑，能顯著抑制食物腐敗過程，延長食品保質(zhì)期。使用PCR技術(shù)對乳酸菌進(jìn)行檢測時，需充分了解乳酸菌的知識背景和生產(chǎn)規(guī)律，能夠快速得到乳酸菌的菌落資料，然后進(jìn)行引物設(shè)計，檢測其發(fā)酵過程，監(jiān)測食品在此過程中的腐敗程度，確定保質(zhì)期的有效性[11]。另外，PCR技術(shù)也可應(yīng)用于酸奶中的乳酸菌檢測且準(zhǔn)確度較高。

5 PCR技術(shù)應(yīng)用于食品微生物檢測所面臨的問題

食品生產(chǎn)過程中的微生物污染途徑較多，影響范圍也較大，是食品安全的關(guān)鍵問題。隨著社會發(fā)展，食品生產(chǎn)規(guī)模不斷擴(kuò)大，同時危害來源也不斷增多，微生物污染范圍廣且檢測范圍增大。在現(xiàn)有的技術(shù)水平和生產(chǎn)規(guī)模下，食品微生物的檢測工作也隨之增加，而檢測技術(shù)的欠缺，導(dǎo)致食品污染事件發(fā)生概率增大。

6 在食品微生物檢測中如何加強(qiáng)運(yùn)用PCR技術(shù)

食品檢測部門廣泛存在工作人員綜合能力素養(yǎng)水平不高的現(xiàn)象，因此應(yīng)注意人才引進(jìn)工作，尤其是針對PCR技術(shù)的培訓(xùn)工作需加強(qiáng)，才能提升檢測部門的工作效果和工作效率。加大檢測人員的培養(yǎng)和支持力度，完善PCR檢測技術(shù)的人才培養(yǎng)機(jī)制，重視檢測人員的專業(yè)技能培訓(xùn)，制定具體有效的培訓(xùn)方案，提升PCR技術(shù)工作人員的知識水平和技術(shù)能力，幫助檢測人員樹立正確的工作態(tài)度和理念，提升職業(yè)道德素養(yǎng)，更好地保障食品生產(chǎn)的安全。

7 結(jié)語

食品生產(chǎn)質(zhì)量安全工作與食品微生物檢測技術(shù)具有密切聯(lián)系，為了不斷提升食品微生物檢測的準(zhǔn)確性和時效性，更好地滿足人們對食品質(zhì)量安全的要求。我國正處于產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)型時期，PCR技術(shù)的應(yīng)用仍處于發(fā)展階段，相關(guān)部門和企業(yè)應(yīng)注重提升食品檢測人員的綜合能力以及素養(yǎng)水平，提升對PCR技術(shù)的認(rèn)知，拓展對PCR技術(shù)的實踐、應(yīng)用能力，提高檢測工作的準(zhǔn)確性和有效性，使PCR技術(shù)發(fā)揮保障食品安全，維護(hù)良好的食品市場環(huán)境的作用。

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