微生態(tài)制劑活菌的計(jì)數(shù)方法分析

蘇夢(mèng)緣，伍新葉，朱 曦，王茜瑛，邵 嫄，李克克，梁運(yùn)祥，李英俊

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，武漢 430070；2.河南金百合生物科技股份有限公司，河南 安陽(yáng) 455000）

微生態(tài)制劑能夠調(diào)節(jié)和維持微生物生態(tài)平衡，在畜禽水產(chǎn)養(yǎng)殖中得到較為普遍的應(yīng)用，可以改善環(huán)境、促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)、改善畜禽水產(chǎn)品品質(zhì)、提高飼料利用率，從而實(shí)現(xiàn)預(yù)防疾病、綠色健康養(yǎng)殖。活菌數(shù)為微生態(tài)制劑質(zhì)量與安全性的重要考察指標(biāo)，能夠直觀地展示微生態(tài)制劑質(zhì)量，較高的活菌數(shù)可以一定程度反應(yīng)微生態(tài)制劑的有效活性和保存的穩(wěn)定性。微生態(tài)制劑活菌數(shù)的技術(shù)方法復(fù)雜多樣，對(duì)各種計(jì)數(shù)方法進(jìn)行系統(tǒng)了解和對(duì)微生態(tài)制劑生產(chǎn)和應(yīng)用進(jìn)行分析均具有重要意義［1］。對(duì)平板培養(yǎng)法、直接染色觀察法、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)法、MTT 計(jì)數(shù)法、MPN-PCR 檢測(cè)法、實(shí)時(shí)熒光定量法、ATP 生物發(fā)光法、Bactec 9120 血培養(yǎng)儀法、高通量生長(zhǎng)曲線法、濾膜法（濃縮法）、顏色改變單位法（CCU）、LAMP 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法等12 種活菌計(jì)數(shù)法進(jìn)行了系統(tǒng)介紹和優(yōu)缺點(diǎn)分析與總結(jié)，為相關(guān)研究和應(yīng)用提供參考。

1 常見(jiàn)活菌計(jì)數(shù)方法及其原理

1.1 平板培養(yǎng)法

平板培養(yǎng)法包括稀釋涂布平板法和稀釋倒平板法，兩者的區(qū)別在于，前者是將稀釋過(guò)后的待測(cè)樣品涂布于培養(yǎng)基上，后者是將稀釋后的待測(cè)樣品與培養(yǎng)基混勻后進(jìn)行倒板。該方法計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性高，常作為其他計(jì)數(shù)方法的參照，在各個(gè)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，同時(shí)也在不斷被優(yōu)化和改良。例如，Takano 等［2］在強(qiáng)酸條件下使用瓊脂平板和結(jié)冷膠平板培養(yǎng)嗜酸性細(xì)菌，評(píng)估了兩種平板在酸性條件下細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)間和菌落分離平板培養(yǎng)方法的極限范圍。平板培養(yǎng)法也存在一定局限性，比如對(duì)厭氧微生物進(jìn)行計(jì)數(shù)就需要將平板置于嚴(yán)格的厭氧培養(yǎng)環(huán)境；同時(shí)，平板培養(yǎng)法依賴于微生物的生長(zhǎng)，需要較長(zhǎng)的培養(yǎng)時(shí)間，難以實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)。

1.2 直接染色觀察法

直接染色觀察法是通過(guò)細(xì)胞膜的完整性以及細(xì)胞代謝活性等來(lái)區(qū)分活菌和死菌。其原理為活菌細(xì)胞膜完整且代謝正常，不易與染料結(jié)合，呈現(xiàn)出無(wú)色；死菌細(xì)胞膜不完整且無(wú)代謝活性，易與染料結(jié)合，從而顯出顏色。細(xì)胞經(jīng)染色后，利用顯微鏡觀察計(jì)數(shù)，便可區(qū)分活菌和死菌。常用的染料有錐蟲(chóng)藍(lán)、臺(tái)盼藍(lán)、剛果紅、亞甲藍(lán)（美藍(lán)）等。其中，亞甲藍(lán)由于沒(méi)有毒性而被廣泛應(yīng)用。亞甲藍(lán)在氧化狀態(tài)時(shí)呈現(xiàn)出藍(lán)色，還原態(tài)時(shí)呈無(wú)色。在進(jìn)行活體染色時(shí)，亞甲藍(lán)染料可與活細(xì)胞代謝物中H+結(jié)合從而被還原，呈無(wú)色；死細(xì)胞因不進(jìn)行代謝活動(dòng)，脫氫酶失去活性，亞甲藍(lán)不能被還原，因此死細(xì)胞被染色且呈藍(lán)色或淡藍(lán)色。美藍(lán)染色法也存在一些不足，①細(xì)胞染色若較淺，會(huì)使判斷準(zhǔn)確度降低。②染色時(shí)間或計(jì)數(shù)時(shí)間的長(zhǎng)短會(huì)影響觀察染色效果，對(duì)結(jié)果的準(zhǔn)確性造成影響。③細(xì)胞形態(tài)的異常會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果造成影響。

直接染色觀察法操作簡(jiǎn)單，成本低，但需要使用顯微鏡觀察，計(jì)數(shù)工作量大、耗時(shí)長(zhǎng)，對(duì)操作者有一定的技術(shù)要求，檢測(cè)準(zhǔn)確度不穩(wěn)定，不適合大規(guī)模檢測(cè)應(yīng)用［3］。

1.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)法

流式細(xì)胞術(shù)（Flow cytometry，F(xiàn)CM）屬于定量分析技術(shù)，核心儀器為流式細(xì)胞儀，可以同時(shí)對(duì)單個(gè)細(xì)胞的多項(xiàng)參數(shù)進(jìn)行定量或定性分析。

利用FCM 對(duì)活菌進(jìn)行計(jì)數(shù)的原理是，用特異性熒光信號(hào)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，用流式細(xì)胞儀測(cè)定標(biāo)記細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)活菌個(gè)數(shù)。傳統(tǒng)的基于熒光信號(hào)的流式細(xì)胞術(shù)也存在局限，其檢測(cè)的目標(biāo)參數(shù)較為單一，數(shù)據(jù)處理過(guò)程較為復(fù)雜。在進(jìn)行多次技術(shù)改進(jìn)后，已開(kāi)發(fā)出了更多適用于細(xì)胞計(jì)數(shù)的流式細(xì)胞術(shù)，如定量流式細(xì)胞術(shù)、多色流式細(xì)胞術(shù)、磷酸化流式細(xì)胞術(shù)、流式微球分析技術(shù)、質(zhì)譜流式細(xì)胞術(shù)、成像流式細(xì)胞術(shù)和體內(nèi)流式細(xì)胞術(shù)等［4］。

該檢測(cè)法的優(yōu)點(diǎn)在于檢測(cè)參數(shù)多，無(wú)需細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程，檢測(cè)速度快，最高可達(dá)每秒上萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，檢測(cè)結(jié)果精度高，準(zhǔn)確性好等；缺點(diǎn)在于檢測(cè)儀器昂貴，檢測(cè)費(fèi)用高，不同待檢菌株在靈敏度上存在差異，對(duì)于復(fù)雜樣品，需要進(jìn)行預(yù)處理才能用于檢測(cè)。

FCM 在醫(yī)學(xué)診斷中具有較大的開(kāi)發(fā)價(jià)值，可用于檢驗(yàn)白血病患者的外周血白血病細(xì)胞［5］、研究外周血淋巴細(xì)胞DNA 受到鉛損傷的情況等［6］。

1.4 MTT 計(jì)數(shù)法

MTT 是一種噻唑鹽，化學(xué)名為3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽。MTT 計(jì)數(shù)法是Mosmann［7］提出的。MTT 水溶液為黃綠色，容易穿過(guò)細(xì)胞膜，與活細(xì)胞線粒體中的琥鉑酸脫氫酶進(jìn)行反應(yīng)，被還原成藍(lán)紫色不溶于水的甲瓚［8］。死細(xì)胞沒(méi)有代謝，脫氫酶無(wú)活性，沒(méi)有還原反應(yīng)，MTT 顏色不發(fā)生變化。測(cè)定溶液的吸光度（OD555nm）或利用有機(jī)溶劑如二甲基亞砜（DMSO）溶解甲瓚再測(cè)定吸光度，則可測(cè)出活細(xì)胞數(shù)［9］。

MTT 法有快速、準(zhǔn)確、工作量小、能區(qū)分活死細(xì)胞等優(yōu)點(diǎn)，使用范圍較廣，多用于動(dòng)物細(xì)胞活菌計(jì)數(shù)、細(xì)胞毒理試驗(yàn)、微生物活菌計(jì)數(shù)等。但當(dāng)活菌數(shù)較低或較高時(shí)，MTT 的反應(yīng)產(chǎn)物會(huì)過(guò)低或過(guò)高，導(dǎo)致所測(cè)吸光度超出檢測(cè)范圍。因此MTT 檢測(cè)法不適用于濃度太低或太高的細(xì)菌液［10］。

1.5 MPN-PCR 檢測(cè)法

MPN-PCR 檢測(cè)法又稱最大可能數(shù)法，與稀釋平板檢測(cè)法有一定的聯(lián)系，但卻是間接與泊松分布相關(guān)的一種計(jì)數(shù)方法［11］。該方法一般是將待測(cè)樣品進(jìn)行10 倍梯度稀釋，每個(gè)梯度設(shè)3 個(gè)平行，在適當(dāng)條件培養(yǎng)后使用PCR 擴(kuò)增計(jì)數(shù)進(jìn)行測(cè)定。若樣品中含有目標(biāo)菌，則依據(jù)觀察到的PCR 陽(yáng)性管數(shù)，檢索MPN 表，得出樣品中目標(biāo)菌的MPN 值，得出待測(cè)菌的數(shù)量，也叫九管法［12］。

1915 年Mc Crady 利用MPN 最大可能數(shù)法估算細(xì)菌濃度［13］。該方法適用于測(cè)定在混雜的微生物群中雖不占優(yōu)勢(shì)，卻具有特殊功能的類(lèi)群。例如檢測(cè)特殊的土壤微生物群、牛奶或食品中特殊微生物類(lèi)群（如大腸桿菌）數(shù)量，還可進(jìn)行污水檢測(cè)［14］。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量法

實(shí)時(shí)熒光定量法（Quantitative real-time PCR）的原理是基于標(biāo)準(zhǔn)PCR 技術(shù)，在擴(kuò)增反應(yīng)中加入熒光基團(tuán)，使用能夠進(jìn)行熱循環(huán)和熒光信號(hào)篩查的儀器，在每次循環(huán)后，對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)而得到靶核酸的含量，熒光信號(hào)和擴(kuò)增片段的數(shù)量成正比。該種方法具有特異性高、靈敏度高、檢測(cè)周期短、能夠檢測(cè)活的但不可培養(yǎng)（VBNC）狀態(tài)下的細(xì)胞、自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn)。缺點(diǎn)在于無(wú)法對(duì)死菌和活菌DNA 進(jìn)行區(qū)分。

在檢測(cè)嗜肺軍團(tuán)菌時(shí)，由于該菌能夠“隱藏”于變形蟲(chóng)體內(nèi)，且生長(zhǎng)速度緩慢，不適合使用傳統(tǒng)的培養(yǎng)計(jì)數(shù)法進(jìn)行計(jì)數(shù)，因此qPCR 檢測(cè)技術(shù)被認(rèn)為是一種嗜肺軍團(tuán)菌潛在風(fēng)險(xiǎn)量化方法［15，16］。此外，qPCR 技術(shù)還被用來(lái)度量不同紫外光照射后DNA 的損傷程度［17］。

疊氮溴化丙錠（PMA）是一種光敏性DNA 結(jié)合染料，自身熒光弱，具有高親和力，在結(jié)合核酸后，熒光信號(hào)會(huì)大幅度增強(qiáng)。在進(jìn)行DNA 提取前，將待測(cè)樣品與PMA 混勻，PMA 會(huì)有選擇性地與膜損傷細(xì)胞中的雙鏈DNA 作用，嵌入其中。在464 nm 的可見(jiàn)光的作用下，PMA 分子中的疊氮基團(tuán)分解，產(chǎn)生具有高活性的氮烯類(lèi)化合物，和DNA 分子共價(jià)交聯(lián)產(chǎn)生沉淀，抑制qPCR 過(guò)程中膜損傷細(xì)胞DNA 的擴(kuò)增。溶液中殘留的過(guò)量染料與水分子可在光照的條件下產(chǎn)生反應(yīng)，生成羥胺化合物，使過(guò)量染料失去交聯(lián)活性，對(duì)后繼活細(xì)胞DNA 的擴(kuò)增不存在影響。

PMA 的選擇滲透性和qPCR 的特異性相結(jié)合，能夠大幅度提高檢測(cè)速度和靈敏性［18］。龐貝妮等［19］依據(jù)PMA/EMA-qPCR 活菌檢測(cè)機(jī)理，對(duì)試驗(yàn)的曝光時(shí)間和染料濃度等因素進(jìn)行優(yōu)化，確認(rèn)EMA-qPCR檢測(cè)方法適合作為沙門(mén)氏菌活的一種初篩方法。在食品工業(yè)中，PMA/EMA-qPCR 和qPCR 等方法均有較廣泛的應(yīng)用，在確定最佳PMA 濃度的情況下，用PMA-qPCR 檢測(cè)保加利亞乳桿菌sp1.1［20］、乳品中酵母菌［21］、牛奶中的蠟樣芽孢桿菌［22］等，EMA-qPCR檢測(cè)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌［23］、丁香假單胞桿菌獼猴桃致病變種［24］、水樣中彎曲桿菌［25］等，能夠更好地對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行區(qū)分和計(jì)數(shù)。

影響PMA-qPCR 檢測(cè)效率的因素有微生物細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)差異、微生物待擴(kuò)基因的選擇、PMA 濃度、暗反應(yīng)時(shí)間和光反應(yīng)條件。

1.7 ATP 生物發(fā)光法

三磷酸腺苷（ATP）是所有生命活動(dòng)的能量載體，ATP 的含量在活菌中會(huì)保持在一定范圍內(nèi)，若細(xì)菌死亡，則ATP 會(huì)被胞內(nèi)酶在短時(shí)間內(nèi)快速分解，所以可用ATP 的含量反映樣品中的活菌數(shù)。

ATP 生物發(fā)光法的原理是熒光素酶在Mg2+催化下使熒光素與ATP 反應(yīng)形成熒光素-AMP 復(fù)合物，并產(chǎn)生焦磷酸（PPi）。當(dāng)復(fù)合物被O2氧化后，會(huì)形成激發(fā)態(tài)復(fù)合物，并產(chǎn)生CO2，當(dāng)激發(fā)態(tài)轉(zhuǎn)化成基態(tài)時(shí)會(huì)釋放能量而發(fā)光。在一定范圍內(nèi)，發(fā)光強(qiáng)度與ATP 濃度呈線性關(guān)系，從而檢測(cè)活菌的數(shù)量［26］。

ATP 生物發(fā)光法簡(jiǎn)便、快速、重現(xiàn)性好、可檢測(cè)出不可培養(yǎng)的微生物，但是要求樣品細(xì)菌濃度至少滿足1 000 CFU/mL，需要富集樣品菌落總數(shù)達(dá)到有效檢測(cè)范圍才能準(zhǔn)確檢測(cè)，檢測(cè)靈敏性有待加強(qiáng)［27-29］。傳統(tǒng)的ATP 生物發(fā)光法測(cè)定的是總ATP，對(duì)活菌數(shù)檢測(cè)會(huì)造成誤差，鹽濃度也會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果［30］。將ATP 生物發(fā)光法與免疫磁分離技術(shù)（IMS）相結(jié)合，可以濃縮分離樣品對(duì)微生物進(jìn)行特異性識(shí)別，提高檢測(cè)靈敏性。該方法由Lee 等［31］應(yīng)用到水中大腸桿菌含量的檢測(cè)。Cheng 等［32］研究了生物免疫納米磁微粒（BMNPs）技術(shù)與ATP 生物發(fā)光法的結(jié)合，該方法可檢測(cè)更多微生物，并降低檢測(cè)限。Hammes 等［33］對(duì)ATP 生物發(fā)光法進(jìn)行了優(yōu)化，大幅降低其檢測(cè)限（可達(dá)0.000 1 nmol/L），并將活菌ATP和胞外ATP 進(jìn)行了區(qū)分。

1.8 Bactec 9120 血培養(yǎng)儀法

Bactec 9120 血培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)的原理為，微生物細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中代謝產(chǎn)生的CO2會(huì)激活瓶底中的感應(yīng)物質(zhì)而產(chǎn)生熒光，熒光信號(hào)的強(qiáng)度和CO2的生成量成正比，將該熒光信號(hào)經(jīng)過(guò)一定的計(jì)算，就可以對(duì)微生物的數(shù)量和生長(zhǎng)情況進(jìn)行判斷。該方法在臨床活菌計(jì)數(shù)中具有較大應(yīng)用價(jià)值［34］。

1.9 高通量生長(zhǎng)曲線法

高通量生長(zhǎng)曲線法是在實(shí)時(shí)定量PCR 的擴(kuò)增曲線原理的基礎(chǔ)上，根據(jù)微生物的指數(shù)生長(zhǎng)曲線而建立的［35］。該方法在設(shè)置特定濁度后，根據(jù)細(xì)菌培養(yǎng)到達(dá)該濁度的時(shí)長(zhǎng)進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。使用微孔板進(jìn)行培養(yǎng)，設(shè)置多個(gè)平行，對(duì)微生物進(jìn)行高通量實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。高通量生長(zhǎng)曲線法也適用于輔助檢驗(yàn)消毒劑的殺菌抑菌作用，相比于MTT 比色法，高通量生長(zhǎng)曲線法計(jì)數(shù)更加準(zhǔn)確，并且其線性范圍更寬［36］。該方法無(wú)需特別試劑，不會(huì)被特殊試劑的缺乏所限制。缺點(diǎn)在于檢測(cè)過(guò)程較耗費(fèi)時(shí)間，需要測(cè)定吸光度。在具備自動(dòng)化儀器的情況下，操作會(huì)簡(jiǎn)化，且測(cè)量精度和范圍將進(jìn)一步優(yōu)化［37］。

1.10 濾膜法（濃縮法）

該方法主要是通過(guò)微孔薄膜將待測(cè)樣品進(jìn)行過(guò)濾富集，再把薄膜在培養(yǎng)基或浸有培養(yǎng)液的支持物表面上培養(yǎng)，通過(guò)菌落數(shù)計(jì)算樣品含菌數(shù)，適用于測(cè)定空氣、水等體積大而含菌低的樣品中的活菌數(shù)。

1.11 顏色改變單位法（CCU）

顏色改變單位法適用于用比濁法無(wú)法計(jì)數(shù)的微小微生物。以支原體為例，由于培養(yǎng)液完全澄清透明，無(wú)法用溶液濁度來(lái)進(jìn)行菌體計(jì)數(shù)，所以采用菌體代謝活力的數(shù)據(jù)變化進(jìn)行菌體計(jì)數(shù)。該方法主要步驟是把樣品進(jìn)行10 倍梯度稀釋，在適宜溫度下培養(yǎng)，把顏色改變的最末一管作為待測(cè)樣品的CCU［38］。該計(jì)數(shù)方法的結(jié)果會(huì)比實(shí)際偏低，可以通過(guò)減小稀釋梯度來(lái)改善，但會(huì)加大工作量。該方法在醫(yī)學(xué)研究方面廣泛應(yīng)用［39-41］，有待進(jìn)一步對(duì)各種支原體的計(jì)數(shù)梯度進(jìn)行研究，擴(kuò)展其適用范圍。

1.12 LAMP 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法

2000 年，Notomi 等［42］報(bào)道了環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法，該方法需要根據(jù)目的基因設(shè)計(jì)一對(duì)外引物和一對(duì)內(nèi)引物，有時(shí)也需要2 個(gè)環(huán)引物，總共需要4 或6條引物，在Bst DNA 聚合酶的作用下對(duì)目的基因進(jìn)行擴(kuò)增，環(huán)引物的增加可以提高檢測(cè)效率，但容易出現(xiàn)假陽(yáng)性，可以與其他技術(shù)聯(lián)用進(jìn)行改善。

LAMP 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法與PCR 相比，不需要熱循環(huán)設(shè)備，是一種高效、特異性高的計(jì)數(shù)方法，應(yīng)用范圍廣［43-45］，被應(yīng)用于食品安全檢測(cè)［46］、人類(lèi)疾病監(jiān) 測(cè)［47，48］、動(dòng) 植 物 疾 病 監(jiān) 測(cè)［49］等 方 面。傳 統(tǒng) 的LAMP 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增無(wú)法區(qū)分死菌和活菌，會(huì)造成假陽(yáng)性。該技術(shù)與DNA 熒光染料PMA 聯(lián)合使用［50］，也可利用RNA 的不穩(wěn)定性建立實(shí)時(shí)熒光RTLAMP 檢測(cè)方法［51］來(lái)區(qū)分死菌和活菌，避免假陽(yáng)性。該方法有成本低，特異性高等優(yōu)點(diǎn)，在實(shí)際中具有較大的應(yīng)用潛力。

2 12 種檢測(cè)方法的比較

12 種活菌檢測(cè)方法的比較見(jiàn)表1。

表1 12 種活菌檢測(cè)方法的比較

3 討論

活菌數(shù)作為微生態(tài)制劑的重要指標(biāo)，反映微生態(tài)制劑的質(zhì)量和穩(wěn)定性。隨著活菌計(jì)數(shù)方法和儀器的開(kāi)發(fā)與優(yōu)化，活菌計(jì)數(shù)越來(lái)越準(zhǔn)確、高效和快速。在活菌計(jì)數(shù)中，平板培養(yǎng)法的應(yīng)用較為廣泛，通常被用做其他計(jì)數(shù)方法的參照。但是，平板計(jì)數(shù)法耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)，在指導(dǎo)工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)的應(yīng)用中有所限制，而基于核酸檢測(cè)的PMA/EMA-qPCR 檢測(cè)法、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增等方法由于耗時(shí)短、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，具有較大的潛力，值得重點(diǎn)關(guān)注和研究。