肉羊屠宰場沙門菌的分離鑒定及其生物膜形成能力測定

馮雷喜，彭 斌，曹婉怡，姚 剛

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052）

沙門菌是一種重要的人畜共患病病原菌，可通過屠畜的糞便、皮毛等污染胴體和加工環(huán)境，并能夠在肉品接觸表面形成生物膜，引起交叉污染。調(diào)查羊屠宰場沙門菌的流行及測定分離株成膜能力，可為沙門菌防控提供參考。王晶晶等［1］對肉牛屠宰場76 株沙門菌的成膜能力進(jìn)行測定，結(jié)果顯示全部菌株25 ℃和37 ℃下均能形成生物膜，沙門菌生物膜的安全風(fēng)險較高。羊源沙門菌成膜能力的研究報道鮮見報道。本研究對新疆某肉羊屠宰場的沙門菌進(jìn)行分離鑒定，并用結(jié)晶紫定量法對分離株生物膜能力進(jìn)行測定，分析培養(yǎng)時間、溫度對羊源沙門菌成膜能力的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

2019 年3—10 月在新疆烏魯木齊市及其周邊羊屠宰場采集各類樣品共計1 389 份。用無菌生理鹽水浸潤的無菌棉簽旋入羊肛門并刮取內(nèi)容物，在羊胴體表面刮取以及于羊腸道內(nèi)容物取樣，將棉拭子插入含有5 mL 甘油肉湯的離心管中并標(biāo)記，置于備有冰袋的泡沫盒中，12 h 內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。

四硫磺酸鈉煌綠增菌液基礎(chǔ)（TTB）、亞砷酸鹽胱氨酸增菌液（SC）、亞硫酸鉍瓊脂（BS）、木糖賴氨酸脫氧膽鹽瓊脂（XLD）、緩沖蛋白胨水（BPW）等均購于青島日水生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 沙門菌分離鑒定 沙門菌檢驗(yàn)按照國家標(biāo)準(zhǔn)方法（GB 4789.4—2016）挑取可疑菌落。

1.2.2 inv-A 鑒定 挑取平板上可疑單菌落于50 μL TE Buffer 的八連管內(nèi)，置于PCR 儀95 ℃變性15 min，取出冰浴10 min，即DNA 模板，-20 ℃保存?zhèn)溆谩＠肞CR 技術(shù)對沙門菌DNA 片段進(jìn)行擴(kuò)增（保守基因inv-A）。將5 μL PCR 產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴(kuò)增片段由上海生工生物工程有限公司測序。

1.2.3 沙門菌生物膜形成能力測定方法 將凍存菌株接種于BHI（pH=7.0）培養(yǎng)液中，于37 ℃培養(yǎng)18 h進(jìn)行活化，2 次活化后在37 ℃培養(yǎng)液中隨時間的推移對生物膜的形成進(jìn)行測定。

生物膜的制備。用96 孔板結(jié)晶紫染色法，以陰性組均值加上其3 倍標(biāo)準(zhǔn)差為成膜標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行測定，OD＜OD 標(biāo)準(zhǔn)，為不成膜株；OD 標(biāo)準(zhǔn)＜OD＜2 OD標(biāo)準(zhǔn)，為弱成膜株；2 OD 標(biāo)準(zhǔn)＜OD＜3 OD 標(biāo)準(zhǔn)，為強(qiáng)成膜株。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計

將沙門菌分離株在37 ℃條件下分別培養(yǎng)24、48、72 h 與4 、25、37 ℃溫度下培養(yǎng)72 h 后對其成膜能力進(jìn)行測定，分析培養(yǎng)時間和培養(yǎng)溫度對成膜能力的影響。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用酶標(biāo)儀測定樣品OD，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，采用統(tǒng)計分析軟件GraphPad Prism 8.0.1進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離鑒定結(jié)果

2.1.1 培養(yǎng)基分離結(jié)果 在XLD 培養(yǎng)基上形成黑色有金屬光澤的菌落（圖1），BS 瓊脂上形成有金屬光澤的黑色菌落（圖2），為疑似沙門菌。

圖1 沙門菌菌落形態(tài)（XLD）

圖2 沙門菌菌落形態(tài)（BS）

2.1.2invA鑒定結(jié)果 對疑似沙門菌分離株進(jìn)行invA基因PCR 鑒定，結(jié)果顯示54 株擴(kuò)增得到約284 bp 的片段，與預(yù)期大小一致（圖3）。

圖3 部分樣品invA 基因擴(kuò)增鑒定結(jié)果

本研究從1 389 份樣品中分離出54 株沙門菌，總分離率為3.89%。

2.2 沙門菌成膜鑒定結(jié)果

2.2.1 沙門菌37 ℃不同培養(yǎng)時間OD測定結(jié)果 54株試驗(yàn)沙門菌在37 ℃、72 h 培養(yǎng)下，其強(qiáng)成膜株、弱成膜株和不成膜菌株占比分別為55.56%、40.74%、3.70%；培 養(yǎng)48 h 占 比 分 別 為46.30%、50.00%、3.70%。培養(yǎng)24 h 占比分別為44.44%、44.44%、11.11%（表1）。沙門菌在37 ℃條件下經(jīng)72 h 培養(yǎng)后OD最高，其成膜能力極顯著高于48（P＜0.001）、24 h（P＜0.001）；其中48 h 成膜能力顯著高于24 h（P＜0.01）（圖4）。37 ℃培養(yǎng)條件下，沙門菌成膜能力受時間的影響較大，且隨時間增加成膜能力逐漸增強(qiáng)。

表1 37 ℃不同培養(yǎng)時間沙門菌成膜能力

圖4 37 ℃培養(yǎng)不同時間生物膜形成能力

2.2.2 沙門菌72 h 下不同培養(yǎng)溫度OD測定結(jié)果54 株試驗(yàn)沙門菌在4 ℃培養(yǎng)下，強(qiáng)成膜株、弱成膜株、不成膜菌株占比分別為29.63%、20.37%、50.00%；25 ℃培養(yǎng)下占比分別為62.96%、37.04%、0%。在37 ℃培養(yǎng)下占比分別為55.56%、40.74%、3.70%（表2）。 經(jīng)72 h 培養(yǎng)，25 ℃培養(yǎng)條件下OD值最高，沙門菌分離株成膜能力極顯著高于37（P＜0.001）、4℃（P＜0.001）；37 ℃和4 ℃條件下成膜能力差異不顯著（P＞0.05）。

表2 72 h 下不同溫度沙門菌成膜能力

圖5 72 h 培養(yǎng)不同溫度生物膜形成能力

3 討論

3.1 沙門菌污染率調(diào)查分析

王晶晶等［1］研究發(fā)現(xiàn)，在四川部分地區(qū)山羊沙門菌檢出率為54.59%；新疆石河子某羊場沙門菌檢出率為51.5%［2］；儲倩等［3］研究發(fā)現(xiàn)，某屠宰場沙門菌攜帶率為50%。吳美云［4］進(jìn)行沙門菌的分離鑒定，檢出率為10.9%；匡秀華［5］研究發(fā)現(xiàn)，分離率為25.12%。本研究發(fā)現(xiàn)，新疆部分屠宰場羊肉污染率為3.89%（54/1389），與國內(nèi)報道食源性沙門菌結(jié)果差異較明顯。中國不同地域、品種沙門菌均有分布，本研究雖檢出率較低，但仍需加強(qiáng)對沙門菌的監(jiān)測與預(yù)防。

3.2 37 ℃條件下不同培養(yǎng)時間沙門菌與生物膜形成能力的關(guān)系

本研究發(fā)現(xiàn)，在37 ℃培養(yǎng)條件下，不同培養(yǎng)時間沙門菌生物膜形成能力差異顯著，且生物膜的形成能力會隨著培養(yǎng)時間的增加而顯著增強(qiáng)。這可能是由于細(xì)菌胞體表面的物理、化學(xué)特性，導(dǎo)致細(xì)菌與黏附表面的相互作用從而影響沙門菌的黏附和生物膜的形成［6］。

3.3 72 h 培養(yǎng)條件下不同溫度沙門菌與生物膜形成能力的關(guān)系

本研究發(fā)現(xiàn)，25 ℃是沙門菌形成生物膜的最佳溫度，生物膜形成能力最強(qiáng)，該結(jié)果對肉制品產(chǎn)業(yè)鏈以及檢測機(jī)構(gòu)有重要意義。結(jié)合生物膜測定結(jié)果，培養(yǎng)時間顯著影響其成膜能力，與尹彬茹［7］研究結(jié)果一致。由于生物膜極易引起二次污染［8］，研究生物膜形成能力具有重要指導(dǎo)意義。有利條件可促使沙門菌的多細(xì)胞形態(tài)生成，在28 ℃下能夠產(chǎn)生細(xì)聚合菌毛促進(jìn)生物膜形成［9-11］。研究發(fā)現(xiàn)，沙門菌在37 ℃條件下生物膜形成能力一般［12］，本研究發(fā)現(xiàn)37 ℃條件下沙門菌形成生物膜的能力隨時間增加逐漸增強(qiáng)。

4 小結(jié)

本研究中羊肉屠宰場中沙門菌檢出率為3.89%（54/1389），存在一定程度的污染，需要加強(qiáng)對沙門菌的監(jiān)測與預(yù)防。在中性（pH=7.0）環(huán)境中，沙門菌分離株經(jīng)37 ℃培養(yǎng)隨培養(yǎng)時間延長生物膜形成能力逐漸增強(qiáng)；經(jīng)72 h培養(yǎng)條件下25 ℃時成膜能力最強(qiáng)。