三種常綠莢蒾的花粉活力及柱頭可授性研究

田偉莉，樓嘯林，肖 健，駱 芳

（1.杭州市園林綠化股份有限公司，杭州 310020；2.杭州畫(huà)境種業(yè)有限公司，杭州 311116）

莢蒾屬（Viburnum Linn.）植物屬忍冬科（Caprifoliaceae），分布于溫帶和亞熱帶，主產(chǎn)東亞和北美，全球約200 種，中國(guó)有74 種，浙江有18 種3 亞種、6 變種及1 變型［1，2］。莢蒾屬植物觀賞價(jià)值較高，多為灌木，有落葉和常綠種；有白色、粉色花，某些種類的花序具有白色而繁茂的小型兩性花和大型不孕花；果色有紅、藍(lán)、黑色等，鮮艷奪目。

雜交是新品種培育最基本、使用最廣泛的手段?；ǚ凼请s交育種最基本的材料，花粉活力大小對(duì)育種效果影響顯著，柱頭可授性的高低及可授期的長(zhǎng)短很大程度上影響授粉成功率［3］。花粉活力測(cè)定的方法有很多，如醋酸洋紅染色法、TCC 染色法、I2-KI染色法、FDA-PI 熒光染色法、萌發(fā)法等。廖美蘭等［4］對(duì)3 種山茶的花粉活力研究發(fā)現(xiàn)，采用醋酸洋紅染色法進(jìn)行測(cè)定時(shí)花粉活力最高；劉成琴等［5］對(duì)5種通關(guān)藤花粉活力測(cè)定方法比較發(fā)現(xiàn)，TTC 染色法、醋酸洋紅染色法和過(guò)氧化物酶染色法測(cè)得的花粉活力差異不顯著；杜文文等［6］采用TTC 染色、12-KI 染色、孢粉染色法以及離體萌發(fā)培養(yǎng)方法檢測(cè)秋海棠花粉活力，孢粉染色法較其他3 種方法測(cè)定效果更好；付強(qiáng)等［7］研究了思茅松花粉活力測(cè)定方法，發(fā)現(xiàn)以I2-KI 染色法效果最好，其染色速度快，染色率與萌發(fā)法檢測(cè)的花粉活力數(shù)據(jù)較為接近。柱頭可授性應(yīng)用最多且最廣泛的方法就是聯(lián)苯胺-過(guò)氧化氫法，如芝麻、野豌豆、鐵線蓮等均應(yīng)用該法研究柱頭可授性［8-10］。國(guó)內(nèi)外對(duì)莢蒾屬植物的研究和報(bào)道較多，內(nèi)容涉及資源、栽培繁殖、化學(xué)和藥理等方面［11］。國(guó)外在育種方面起步較早，通過(guò)雜交培育出很多莢蒾品種，部分品種在國(guó)外已經(jīng)有廣泛應(yīng)用［12，13］。而國(guó)內(nèi)對(duì)莢蒾屬的育種研究起步較晚，采用液體培養(yǎng)基進(jìn)行花粉萌發(fā)法試驗(yàn)少有報(bào)道，國(guó)內(nèi)莢蒾屬育種領(lǐng)域花粉活力和柱頭可授性的相關(guān)研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

通過(guò)對(duì)莢蒾屬琉球莢蒾（Viburnum suspensumLindl.）、臺(tái)東莢蒾（Viburnum taitoenseHayata）和日本莢蒾（Viburnum japonicum（Thunb.）Spreng.）花粉活力和柱頭可授性研究，確定采集花粉活力和柱頭可授性最強(qiáng)的最佳時(shí)期，為莢蒾屬植物的育種研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

浙江省杭州市臨安區(qū)青山鎮(zhèn)青山湖基地培育的生長(zhǎng)健壯的3 年生琉球莢蒾、臺(tái)東莢蒾和日本莢蒾扦插苗，3 種苗的開(kāi)花結(jié)果均能達(dá)到正常水平。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 花粉活力 2019—2021 年，篩選3 種適于莢蒾屬植物花粉離體培養(yǎng)的液體培養(yǎng)基，在浙江省杭州市臨安區(qū)青山鎮(zhèn)青山湖基地對(duì)琉球莢蒾、臺(tái)東莢蒾和日本莢蒾的花粉進(jìn)行花粉活力測(cè)定。對(duì)不同植物的花粉測(cè)定常用的有染色法和萌發(fā)法［14-19］，萌發(fā)法測(cè)定結(jié)果相比染色法更加接近花粉實(shí)際萌發(fā)情況［20，21］，故本試驗(yàn)選擇萌發(fā)法測(cè)定花粉活力，并根據(jù)實(shí)際情況選用液體培養(yǎng)基。本試驗(yàn)選擇了3 種液體培養(yǎng)基，①5 g/L 蔗糖+90 mg/L 硼酸+50 mg/L 氯化鈣；②15 g/L 蔗糖+80 mg/L 硼酸；③10 g/L 蔗糖+70 mg/L 硼酸+150 mg/L 氯化鈣。

2021 年對(duì)莢蒾3 種不同采取時(shí)間的花粉進(jìn)行活力測(cè)定，開(kāi)裂前1 d，根據(jù)花朵開(kāi)放進(jìn)程，在花朵開(kāi)放的前1 d 的9：00 將花苞取下，取出花藥置于干燥器采取花粉；開(kāi)裂當(dāng)天9：00 花藥剛裂開(kāi)時(shí)采取花粉；開(kāi)裂第二天，提前1 天9：00 將剛開(kāi)花的花朵進(jìn)行標(biāo)記，于第二天9：00 采取花粉。具體處理見(jiàn)表1。

表1 不同采取時(shí)間的花粉活力測(cè)定處理

花粉測(cè)定方法為，將供試花粉均勻分散地撒在滴有3 種培養(yǎng)基的凹形載玻片上，置于培養(yǎng)皿中保濕，放于25 ℃的人工氣候箱中培養(yǎng)4 h 后在顯微鏡下統(tǒng)計(jì)花粉萌發(fā)的數(shù)量，花粉管長(zhǎng)度大于花粉直徑視為萌發(fā)。每個(gè)處理統(tǒng)計(jì)10 個(gè)視野，每個(gè)視野的花粉粒數(shù)量不少于50 個(gè)。

1.2.2 柱頭可授性 采用聯(lián)苯胺-過(guò)氧化氫法。9：00采集新鮮的柱頭，將其浸入裝有聯(lián)苯胺-過(guò)氧化氫反應(yīng)液（1%聯(lián)苯胺溶液、3%過(guò)氧化氫溶液、水的體積比為4∶11∶22 的混合液）的凹面載玻片的凹陷處。10～20 min 后在顯微鏡下觀測(cè)柱頭染色且周圍出現(xiàn)大量氣泡來(lái)確定其具有可授性，若沒(méi)有染色且沒(méi)有大量氣泡則認(rèn)為柱頭沒(méi)有可授性。計(jì)算具有可授性的柱頭數(shù)量占共檢小花柱頭總數(shù)的百分率。

2 結(jié)果與分析

2.1 花粉活力

2.1.1 低溫對(duì)莢蒾花粉活力的影響 從溫度來(lái)看，2021 年1 月，試驗(yàn)地溫度達(dá)到-8 ℃，較往年低5 ℃左右，2019 年和2020 年最低溫基本維持在-2 ℃左右。試驗(yàn)結(jié)果表明，除日本莢蒾外，2021 年琉球莢蒾和臺(tái)東莢蒾的花粉活力均高于2020 年和2019 年，各處理均高出25%以上，且均以③號(hào)培養(yǎng)基處理最佳，與2020 年和2019 年相比，分別高出36.55、34.84 和63.65、59.16 個(gè)百分點(diǎn)。這說(shuō)明低溫可能對(duì)提高臺(tái)東莢蒾和琉球莢蒾的花粉活力具有明顯的促進(jìn)作用，1 月琉球莢蒾和臺(tái)東莢蒾花序已經(jīng)顯現(xiàn)，部分花苞已分離并伸長(zhǎng)，此時(shí)低溫可能對(duì)雄蕊生長(zhǎng)產(chǎn)生了一定的刺激作用，并有效促進(jìn)了花粉發(fā)育，導(dǎo)致花粉活力提高，為當(dāng)年的坐果提供了良好的基礎(chǔ)。2021年日本莢蒾花粉活力中除①號(hào)培養(yǎng)基處理外，其余2 個(gè)培養(yǎng)基處理均低于2020 年和2019 年。這說(shuō)明日本莢蒾的花藥發(fā)育對(duì)溫度可能比較敏感，溫度和培養(yǎng)基的不同組合均能影響花粉活力。

從培養(yǎng)基看，2019—2021 年琉球莢蒾和臺(tái)東莢蒾的花粉活力均以③號(hào)培養(yǎng)基處理最高，除2021 年的臺(tái)東莢蒾以②號(hào)培養(yǎng)基處理最低之外，其余均以①號(hào)培養(yǎng)基處理最低，③號(hào)培養(yǎng)基最適合用于琉球莢蒾和臺(tái)東莢蒾的花粉活力測(cè)定。日本莢蒾2020年和2019 年以③號(hào)培養(yǎng)基處理最佳，②號(hào)培養(yǎng)基最差，2021 年以①號(hào)培養(yǎng)基處理最佳，③號(hào)培養(yǎng)基最差，說(shuō)明在不同溫度下，不同培養(yǎng)基對(duì)日本莢蒾花粉活力的影響較大（表2）。

表2 3 種莢蒾不同年份的花粉活力比較

2.1.2 不同采取時(shí)間對(duì)花粉活力的影響 由表3 可知，琉球莢蒾和臺(tái)東莢蒾的花粉活力均以處理6 最高，分別為52.38%和74.63%，即開(kāi)裂當(dāng)天采取的花粉在③號(hào)培養(yǎng)基處理下活力最強(qiáng)。處理2 最低，分別為29.44%和16.09%，即花藥開(kāi)裂前1 d 采取、在②號(hào)培養(yǎng)基處理下活力最差。日本莢蒾的花粉活力處理4 最高，為25.58%，即當(dāng)天采取并在①號(hào)培養(yǎng)基處理下活力最佳，處理3 最低，為8.79%，即花藥開(kāi)裂前1 d 采取并在③號(hào)培養(yǎng)基處理下活力最差。結(jié)果表明，3 種莢蒾的花粉活力均以當(dāng)天采取的活力最強(qiáng)，花藥開(kāi)裂前1 d 采取的活力最差。這可能是因?yàn)橐环矫婊ㄋ庨_(kāi)裂前1 d 采取的花粉活力在生理上還未達(dá)到最佳水平，另一方面可能在干燥的條件下使其失去水分導(dǎo)致活力下降。

表3 3 種莢蒾不同采集時(shí)間的花粉活力比較

2.2 柱頭可授性

柱頭可授性的高低及可授期的長(zhǎng)短很大程度上影響授粉成功率，通過(guò)對(duì)琉球莢蒾、臺(tái)東莢蒾和日本莢蒾花不同開(kāi)放期的柱頭用聯(lián)苯胺-過(guò)氧化氫法測(cè)定柱頭可授性。由表4 可知，琉球莢蒾、臺(tái)東莢蒾和日本莢蒾的柱頭均在花苞開(kāi)裂當(dāng)天可授性最高，分別為66.67%、88.89%和68.89%，均為花苞開(kāi)裂第二天可授性最低?；ò_(kāi)裂前1 d 和后1 d 的柱頭均具有可授性，但可授性均明顯下降。說(shuō)明其在開(kāi)花當(dāng)天授粉結(jié)實(shí)的可能性最大，在花苞開(kāi)裂前1 d 及開(kāi)裂后1 d 授粉結(jié)實(shí)可能性相較開(kāi)花當(dāng)天有較大程度降低。在實(shí)際操作中可根據(jù)研究結(jié)果選擇在花苞開(kāi)裂前1 d 和開(kāi)裂當(dāng)天進(jìn)行雜交試驗(yàn)，以提高育種試驗(yàn)的成功率。

表4 3 種莢蒾不同開(kāi)花進(jìn)程的柱頭可授性比較

3 小結(jié)與討論

花粉的活力關(guān)系到授粉的質(zhì)量和授粉的成功率，柱頭可授期是花朵成熟過(guò)程重要的時(shí)期，象征著成熟柱頭對(duì)花粉接受能力的持續(xù)時(shí)間，關(guān)系到人工授粉后結(jié)實(shí)率的高低［22］。因此，研究花粉的活力和柱頭可授性是完成人工授粉前必不可少的基礎(chǔ)性工作［23，24］。本試驗(yàn)結(jié)果表明，琉球莢蒾和臺(tái)東莢蒾的花粉活力均以③號(hào)培養(yǎng)基最佳，2021 年的琉球莢蒾和臺(tái)東莢蒾的花粉活力均高于2020 年和2019 年，且均高出25%以上，說(shuō)明低溫可能對(duì)提高臺(tái)東莢蒾和琉球莢蒾的花粉活力具有明顯的促進(jìn)作用，在雄蕊生長(zhǎng)的某階段，低溫具有一定的正向刺激作用，能有效促進(jìn)花粉的發(fā)育，提高花粉活力。日本莢蒾中除①號(hào)培養(yǎng)基處理2021 年的花粉活力比2020 年和2019 年高之外，其余2 個(gè)培養(yǎng)基處理均低于2020 年和2019 年。說(shuō)明日本莢蒾的花藥發(fā)育對(duì)溫度比較敏感，溫度和培養(yǎng)基的不同組合均能影響花粉活力，影響機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

柱頭可授性的高低及可授期的長(zhǎng)短很大程度上影響授粉成功率。本試驗(yàn)結(jié)果表明，琉球莢蒾、臺(tái)東莢蒾和日本莢蒾的柱頭在開(kāi)花當(dāng)天可授性最高，說(shuō)明其在開(kāi)花當(dāng)天授粉結(jié)實(shí)的可能性最大?；ò_(kāi)裂前1 d 和后1 d 柱頭均具有可授性，但較開(kāi)花當(dāng)天相比有較大程度的降低，對(duì)于花粉活力低的組合，可以采取隔天多次授粉的方式解決。該結(jié)果可為莢蒾屬的人工授粉奠定技術(shù)基礎(chǔ)，為莢蒾屬植物人工育種的父母本選擇提供依據(jù)。