蔡冬冬,李建崗,范 毅,羅 毅,崔鵬博,胡曉亮,田志革*
(1.四川省動物疫病預(yù)防控制中心,四川 成都 610041;2.四川省成都市動物疫病預(yù)防控制中心,四川 成都 610041;3.宜賓學(xué)院農(nóng)林與食品工程學(xué)部,動物多樣性與生態(tài)保育宜賓市重點實驗室,四川 宜賓 644000;4.成都海關(guān),四川 成都 610041)
1.1 病料來源 一只35日齡博美犬患有嚴(yán)重的腸炎,臨床癥狀表現(xiàn)為食欲減退,嘔吐,發(fā)熱,腹瀉,利用膠體金試紙條檢測糞便,結(jié)果為犬冠狀病毒陽性,犬瘟熱病毒陰性,犬細(xì)小病毒陰性和犬腺病毒陰性。
按照DNA/RNA 提取試劑盒說明書,提取病犬糞便的DNA/RNA,進一步加入M-MLV將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,備用。
1.2 主要試劑 病毒總RNA/DNA 提取試劑盒,膠回收試劑盒,反轉(zhuǎn)錄試劑盒,Ex Taq 酶、MLV、RRI。
1.3 引物設(shè)計 利用犬冠狀病毒鑒定引物R-F:5′-CCTTAAGAACTAAACTTATGA-3′;R-R:5′-ATGCCGACACAAGTCTTAAAG-3′對糞便進行PCR鑒定,根據(jù)測序結(jié)果以HLJ-071 和CB/05 基因序列(登錄號為KY063616.1 和KP981644.1)設(shè)計測序引物(表1)。
表1 引物信息
1.4 PCR 擴增及測序 PCR 反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸2 min,共進行30 個循環(huán);72 ℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物在10 g/L 瓊脂糖凝膠中電泳,切膠并回收目的片段,由長春庫美生物科技有限公司測序。將序列拼接后提交NCBI,命名為BM35,登錄號為MT919267。
1.5 基因序列的比較分析和重組分析 利用DNAStar 軟件對BM35 的3′端基因組序列進行同源性比較,用MEGA6.0 構(gòu)建遺傳進化樹分析BM35 的3′端序列,分析比較BM35 與參考毒株的遺傳進化關(guān)系,序列信息見表2。利用Simplot 軟件進行BM35 的重組分析。
表2 CCoV毒株信息
2.1 犬冠狀病毒的鑒定 犬冠狀病毒特異性引物PCR 擴增的片段大小為409 bp,與預(yù)期片段大小一致(見圖1),測序結(jié)果經(jīng)比對確定為犬冠狀病毒,將該毒株命名為BM35。對5對測序引物進行特異性擴增、測序,拼接得到BM35 的3′端序列,片段長度為8 870 bp。
圖1 犬冠狀病毒的鑒定
2.2 基因序列的比較分析 BM35與參考序列之間的同源性最高的為B639/ZJ/2019(95.9%),與國內(nèi)分離株HLJ-071 的同源性為91.5%,與經(jīng)典CCoV IIa 分離株1-71 和K378 的同源性分別為90.8%和91.1%,與日本分離株FC1 的同源性為92.4%。
2.3 BM35 的遺傳進化分析 使用MEGA6.0 軟件將BM35 與國內(nèi)外犬冠狀病毒核酸序列進行比對,構(gòu)建進化樹。結(jié)果顯示:基于3′端序列比對,BM35與浙江株B639/ZJ/2019、臺灣株NTU336、日本株FC1 和越南株HCM47 處于同一分支,該分支獨立成為一簇,區(qū)別于CCoV I型和II 型分支(見圖2A);基于S 基因建立的進化樹顯示BM35 與浙江株B639/ZJ/2019、臺灣株NTU336、日本株FC1 和越南株HCM47 處于同一獨立分支(見圖2B)。
圖2 3′端和S基因的遺傳進化樹
2.4 BM35的重組分析 由于BM35與臺灣株和國外株的遺傳關(guān)系密切,因此推測BM35 可能會發(fā)生重組。重組分析結(jié)果顯示:BM35在S基因大約1 000 bp 處與臺灣株NTU156 和越南株HCM47發(fā)生了重組。
3.1 CCoV 的流行病學(xué) CCoV 是引起犬急性胃腸炎的重要病原,1971 年由德國首次報道后,相繼在亞洲、南美洲、北美洲等多個國家和地區(qū)流行,給經(jīng)濟動物產(chǎn)業(yè)帶來極大的危害。2005年以來,我國學(xué)者在黑龍江、江蘇、遼寧、云南和吉林省進行了CCoV 流行病學(xué)調(diào)查,結(jié)果發(fā)現(xiàn)其血清陽性率為28.36%~87.2%,說明CCoV 在我國呈廣泛性分布[1-2]。由于CCoV本身容易與自身及其他冠狀病毒發(fā)生基因重組,而犬作為人類最主要的伴侶動物,與人有著最密切的接觸,使得人們開始重新評估CCoV 對人類的潛在危害性,具有一定的公共衛(wèi)生意義。
本研究從患病犬中鑒定出一株CCoV(BM35),遺傳進化樹分析顯示其3′端和S基因序列與浙江株B639/ZJ/2019、臺灣株NTU336、日本株FC1 和越南株HCM47的遺傳關(guān)系較近,處于同一獨立分支,而與CCoV IIa 型毒株1-71 和K378,CCoV IIb型毒株450/07,國內(nèi)分離株HLJ-071 等毒株的遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)。
3.2 CCoV 的同源重組與進化 同源重組和點突變是冠狀病毒遺傳進化的主要動力之一[3-4]。盡管多數(shù)犬感染CCoV 后呈現(xiàn)腸道的病理變化,但近年來國外研究報道顯示CCoV能夠由僅引起腸道變化轉(zhuǎn)變?yōu)槿斫M織產(chǎn)生明顯病變,甚至導(dǎo)致犬死亡。BGF株能夠產(chǎn)生明顯的臨床癥狀,基因組序列分析發(fā)現(xiàn)在M 蛋白的末端具有高度可變區(qū)[5]。2009 年,在引起犬急性腸炎的流行病學(xué)監(jiān)測中分離到4株CCoV II型毒株,致病性分析發(fā)現(xiàn)其能夠?qū)е氯劳?,這4 株病毒的典型特征是在S 基因的N 端存在TGEV 重組的跡象[6]。2019年,陳思等[7]分離到一株CCoV HLJ-073,其S、E和M 基因與FCoV WSU79-1683 和CCoV 的A76發(fā)生過重組,并且HLJ-073 有ORF3abc 缺失,導(dǎo)致其能夠在犬單核巨噬細(xì)胞和人巨噬細(xì)胞THP-1 中復(fù)制。2021 年,田志革等[8]分離到的一株CCoV HLJ-071,能夠在犬單核巨噬細(xì)胞中復(fù)制,說明CCoV在國內(nèi)經(jīng)歷了快速進化。
本研究鑒定了一株CCoV(BM35),遺傳分析發(fā)現(xiàn)其與多株國外毒株的遺傳關(guān)系較近,并且與臺灣株NTU156和越南株HCM47發(fā)生過重組,這有助于了解國內(nèi)CCoV 的流行病學(xué)特征,為后續(xù)診斷試劑和疫苗的開發(fā)提供依據(jù)。