一株野生硫磺菌的分類鑒定及其菌絲培養(yǎng)條件優(yōu)化

李艷婷 郭 尚* 郎慧芳 郭霄飛 陳 楠

一株野生硫磺菌的分類鑒定及其菌絲培養(yǎng)條件優(yōu)化

李艷婷1郭 尚1*郎慧芳2郭霄飛1陳 楠1

（1. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)山西功能食品研究院，山西 太原 030031；2. 五臺山風(fēng)景區(qū)農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)服務(wù)中心，山西 忻州 034000）

經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，明確采自山西的一株野生大型真菌為硫磺菌，對其進(jìn)行分類鑒定，并采取單因素試驗研究碳源、氮源、碳氮比、培養(yǎng)溫度、pH對該菌菌絲體生長的影響。結(jié)果表明：該菌菌絲體生長的最佳碳源為葡萄糖，最佳氮源為酵母膏；通過響應(yīng)面優(yōu)化得到菌絲體最佳培養(yǎng)條件為碳氮比40∶1，培養(yǎng)溫度26.5 ℃，pH 5，在此條件下菌絲生長速率為5.608 mm/d。

硫磺菌；鑒定；菌絲；培養(yǎng)條件優(yōu)化

硫磺菌[(Fr). Murrill]又名硫色多孔菌、硫磺多孔菌，是一種藥食兼用的大型真菌，屬多孔菌目（Polyporales）、多孔菌科（Polyporaceae）、硫磺菌屬（），廣泛分布于世界各地，從寒溫帶到熱帶區(qū)域都有報道，我國主要集中在河北、山西、云南、遼寧、陜西、吉林、廣西等地[1,2]。硫磺菌富含多不飽和脂肪酸、草酸和布里酸等營養(yǎng)成分，具有重要的食用價值，在我國和日本的部分地區(qū)都有其食用記錄。也有報道稱硫磺菌中存在大量抗氧化、抗菌、抗腫瘤的多糖及活性蛋白成分，具有巨大的藥用價值[3-5]。

對野生硫磺菌的人工馴化栽培雖已成功，但尚未實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)[6]。本研究對采自山西廣靈的一株野生大型真菌（圖1）進(jìn)行鑒定，結(jié)果確定是硫磺菌。對其子實體進(jìn)行組織分離，得到純化菌絲體。探討碳源、氮源、碳氮比、培養(yǎng)溫度、pH對該菌菌絲生長的影響，進(jìn)而以菌絲生長速率為指標(biāo)，采用響應(yīng)面法研究溫度、碳氮比、pH對其生長的影響，以期得到菌絲體最佳培養(yǎng)條件，為規(guī)?；斯ぴ耘嗵峁┮欢ㄉ飳W(xué)特性理論依據(jù)。

圖1 供試菌株子實體形態(tài)

1 材料與方法

1.1 供試菌株

野生菌子實體釆自山西省廣靈縣的一棵榆樹枯樹干的基部。該地區(qū)位于北緯39°76.15′、東經(jīng)114°29.65′處，海拔965 m。供試菌株由子實體組織分離獲得，標(biāo)本與菌種均保藏于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)山西功能食品研究院。

1.2 試驗方法

（1）分離純化。新鮮硫磺菌子實體，去除表面雜質(zhì)并用75%酒精清洗，采用組織分離法將子實體組織塊接入PDA培養(yǎng)基中，25 ℃黑暗培養(yǎng)。

（2）形態(tài)鑒定與分子生物學(xué)鑒定。形態(tài)學(xué)觀察：肉眼觀察子實體的外觀顏色、形狀、質(zhì)地等，用標(biāo)尺測量子實體長度、寬度和厚度。分子生物學(xué)鑒定：提取菌絲純培養(yǎng)物的DNA，進(jìn)行rDNA ITS區(qū)間序列測定，測序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，與待測菌種序列相似性最大的菌種，即為鑒定結(jié)果[7,8]。

（3）基礎(chǔ)培養(yǎng)基配制。PDA培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，馬鈴薯200 g，瓊脂20 g，加水至1000 mL，pH自然[9]。121 ℃滅菌25 min。

（4）菌種活化。將低溫保藏的試管菌種接種至PDA平板培養(yǎng)基，室溫避光培養(yǎng)，待菌絲長滿后，用打孔器在菌落同一直徑處取直徑 1 cm的菌餅，保持生長一致[10]。

（5）氮源試驗。以5 g豆粕粉、蛋白胨、酵母粉、酒石酸銨、麩皮、硫酸銨、磷酸氫二銨分別代替PDA培養(yǎng)基中的馬鈴薯（200 g），其他成分不變，作為試驗培養(yǎng)基，以不加氮源的PDA培養(yǎng)基為對照，25 ℃培養(yǎng)，每個處理3次重復(fù)。觀察記錄菌絲長度、長勢等，并計算菌絲生長速率[11]。

（6）碳源試驗。以5 g蛋白胨代替PDA培養(yǎng)基中的馬鈴薯（200 g），分別以20 g的葡萄糖、可溶性淀粉、麥芽糖、蔗糖、海藻糖、玉米粉、果糖為碳源，其他成分不變，作為試驗培養(yǎng)基，以不加碳源的PDA培養(yǎng)基為對照，每個處理3次重復(fù)，培養(yǎng)與觀察記錄方法同1.2（5）。

（7）最適pH篩選。按照基礎(chǔ)PDA培養(yǎng)基配方，分別配制4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0等7個pH梯度培養(yǎng)基，每個處理3次重復(fù)，培養(yǎng)與觀察記錄方法同1.2（5）。

（8）最適溫度篩選。按照基礎(chǔ)PDA培養(yǎng)基配方，設(shè)置20 ℃、22 ℃、24 ℃、26 ℃、28 ℃ 5個培養(yǎng)溫度，每個處理3次重復(fù)，觀察記錄方法同1.2（5）。

（9）適宜碳氮比篩選。分別以葡萄糖和硫酸銨為唯一碳源和氮源，配制10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1、80∶1、90∶1和100∶1等10個不同碳氮比培養(yǎng)基[15]，培養(yǎng)與觀察記錄方法同1.2（5）。

（10）培養(yǎng)條件優(yōu)化試驗。利用響應(yīng)面法優(yōu)化硫磺菌菌絲生長條件，采用 Box-Behnken 方法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及回歸分析，以菌絲生長速率作為響應(yīng)值，對菌絲培養(yǎng)過程中的溫度、pH和碳氮比3個影響因素進(jìn)行優(yōu)化[16]。

（11）菌絲生長速率計算。菌絲生長速率（mm/d）=菌落半徑（mm）/培養(yǎng)時間（d）[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 野生硫磺菌的分類鑒定

（1）形態(tài)特征（圖1）。子實體簇生，菌蓋寬15～35 cm，厚1.5～2 cm，呈覆瓦狀排列，肉質(zhì)多汁，干后質(zhì)量輕，質(zhì)地脆；表面呈淡黃色至硫黃色，有細(xì)絨和縱皺紋，無環(huán)帶；邊緣薄而銳、易破碎，波浪狀至瓣狀。菌肉呈乳白色，管孔呈硫黃色，干后褪色；孔口呈多角形，平均每平方毫米分布3～4個。無菌柄。

（2）分子鑒定。將測序獲得的ITS序列在NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast比對分析，得到確定種名的近源種，建立系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖2）。

形態(tài)學(xué)鑒定表明，本試驗采集到的野生菌株的宏觀形態(tài)特征與硫磺菌（）的形態(tài)特征吻合；分子鑒定結(jié)果顯示，所測序列與硫磺菌的ITS序列（GenBank ID：KR187106.1）的重復(fù)率（query cover）達(dá)到90%，相似度達(dá)100%。據(jù)此，鑒定該野生菌株為硫磺菌（。

2.2 硫磺菌菌絲在不同氮源培養(yǎng)基上的生長情況

由表1可知，試驗所選的氮源都可被硫磺菌菌絲利用，在以磷酸氫二銨為氮源和無氮源培養(yǎng)基中，菌絲未長滿且長勢很弱；在酵母粉培養(yǎng)基中菌絲生長速率最快，為5.396 mm/d，且長勢濃密，呈橙黃色；在酒石酸銨培養(yǎng)基中菌絲生長速率慢，僅2.298 mm/d，且長勢一般，顏色微黃。

圖2 基于ITS構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

表1 不同氮源培養(yǎng)基上的硫磺菌菌絲生長表現(xiàn)

注：+++為濃密、長勢強(qiáng)，++為長勢一般，+為長勢弱、稀疏；同列數(shù)據(jù)后小寫字母不同表示差異顯著（<0.05），大寫字母不同表示差異極顯著（<0.01）。下表同。

在所選6種氮源中，菌絲生長速率由慢到快的順序為：磷酸氫二銨、酒石酸銨、硫酸銨、麩皮、蛋白胨、豆粕粉、酵母粉。綜合考慮各培養(yǎng)基中的菌絲長勢、顏色和菌落形態(tài)等，選擇最適氮源為酵母粉。

2.3 硫磺菌菌絲在不同碳源培養(yǎng)基上的生長情況

由表2可知，8個配方培養(yǎng)基都可供硫磺菌菌絲生長，但長勢與生長速度存在差異。無碳源的培養(yǎng)基上菌絲生長緩慢、稀疏、長勢弱，原因可能是瓊脂提供了微量碳源；在4號（麥芽糖）和2號（葡萄糖）培養(yǎng)基上，菌絲生長速率快，分別為4.741mm/d和4.400 mm/d，菌絲生長良好，但麥芽糖培養(yǎng)基長勢不及葡萄糖培養(yǎng)基；6號（海藻糖）培養(yǎng)基菌絲長速最慢。7種不同碳源培養(yǎng)基菌絲生長速率由快到慢的順序為：麥芽糖、葡萄糖、玉米粉、可溶性淀粉、果糖、蔗糖、海藻糖。綜合考慮各培養(yǎng)基的菌絲長勢、顏色和菌落形態(tài)等，選擇以葡萄糖為最適碳源。

表2 不同碳源培養(yǎng)基上的硫磺菌菌絲生長表現(xiàn)

2.4 硫磺菌菌絲在不同pH培養(yǎng)基上的生長情況

由表3可知，7個不同pH條件下，硫磺菌菌絲均能生長。菌絲生長速率由快到慢的順序為：pH 5、pH 4、pH 6、pH 7、pH 8、pH 9、pH 10。以培養(yǎng)基pH為5.0，菌絲生長速率最快，達(dá)到5.458 mm/d，且表現(xiàn)濃密、生長勢強(qiáng)，呈橙黃色。

2.5 硫磺菌菌絲在不同培養(yǎng)溫度下的生長情況

由表4可知，硫磺菌菌絲在試驗的5檔培養(yǎng)溫度下均能生長，但生長速率差異顯著，從快到慢的順序為：26 ℃、22 ℃、28 ℃、24 ℃和20 ℃。培養(yǎng)溫度為26 ℃的菌絲生長速率為5.558 mm/d，顯著快于其他4檔溫度，且表現(xiàn)色澤橙黃、菌絲濃密，可見是最佳培養(yǎng)溫度。

2.6 硫磺菌菌絲在不同碳氮比培養(yǎng)基中生長情況

由表5可知，培養(yǎng)基中的碳氮比不同，硫磺菌菌絲生長速率存在差異。當(dāng)碳氮比為30∶1時，菌絲生長速率最快，為5.438 mm/d，且表現(xiàn)濃密、生長勢強(qiáng)；而當(dāng)碳氮比升高或降低時，菌絲生長速率減慢?？梢?，碳氮比對硫磺菌菌絲生長具有顯著影響。綜合菌絲長勢和生長速度，最適碳氮比為30∶1。

表3 不同pH培養(yǎng)基上的硫磺菌菌絲生長表現(xiàn)

表4 不同培養(yǎng)溫度下的硫磺菌菌絲生長表現(xiàn)

表5 不同碳氮比培養(yǎng)基中的硫磺菌菌絲生長表現(xiàn)

2.7 硫磺菌菌絲培養(yǎng)條件的響應(yīng)面法優(yōu)化

以單因素試驗所得培養(yǎng)條件的結(jié)果為基礎(chǔ)，選擇培養(yǎng)溫度（A）、碳氮比（B）和pH（C）3個因素，將菌絲生長速率作為響應(yīng)值，進(jìn)行菌絲培養(yǎng)條件的響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計[18]，試驗結(jié)果如表6所示。

以培養(yǎng)溫度（A）、培養(yǎng)基碳氮比（B）和培養(yǎng)基pH（C）為參數(shù)，得到回歸方程：菌絲生長速率= 5.68 ? 0.011+ 0.017+ 0.016+ 0.044?0.028? 0.020? 0.302? 0.0222? 0.132

表6 響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果

采用方差分析驗證回歸模型的有效性[19]，結(jié)果如表7所示，該回歸模型的值是18.75，值為0.0004（<0.05），表明模型具有顯著性。對硫磺菌菌絲生長速率影響非常顯著的是C2（<0.01），差異極顯著的是A2（<0.001）；回歸模型的失擬項值為4.26，結(jié)果顯示該回歸模型與實際情況擬合度較高，可以用于預(yù)測該菌菌絲的最佳培養(yǎng)條件。在所選的3個因素中，影響力從大到小排序為A（培養(yǎng)溫度）>C（pH）>B（碳氮比）。

表7 方差分析表

注： *表示在5%水平上差異顯著；**表示在1%水平上差異非常顯著；***表示在1‰水平上差異極顯著。

2.8 菌絲培養(yǎng)條件的響應(yīng)面優(yōu)化分析

如圖3所示，培養(yǎng)溫度與培養(yǎng)基碳氮比，培養(yǎng)溫度與培養(yǎng)基pH的交互作用明顯，培養(yǎng)基碳氮比與培養(yǎng)基pH的交互作用不顯著，其中培養(yǎng)溫度是最大的影響因素。當(dāng)培養(yǎng)溫度固定時，隨著碳氮比的升高，菌絲生長速率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，即碳氮比達(dá)到最大值39.58∶1后，菌絲生長速率開始降低。當(dāng)培養(yǎng)基pH保持固定時，隨著培養(yǎng)溫度的升高，菌絲生長速率呈逐漸增大趨勢，當(dāng)溫度達(dá)到最大值26.54 ℃時，菌絲生長速率略微降低。碳氮比對硫磺菌菌絲生長速率的影響較小。

圖3 培養(yǎng)溫度、pH與碳氮比的響應(yīng)面曲線

采用回歸模型對硫磺菌的最佳培養(yǎng)條件進(jìn)行預(yù)測優(yōu)化的結(jié)果，最適培養(yǎng)溫度為26.54 ℃，最適培養(yǎng)基pH是4.93，最佳碳氮比為39.58∶1。在最優(yōu)培養(yǎng)條件下，硫磺菌菌絲生長速率的理論最大值是5.6079 mm/d。按照實際進(jìn)行微調(diào)后的優(yōu)化培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度26.5 ℃，培養(yǎng)基碳氮比40∶1 ，培養(yǎng)基pH為5。

3 結(jié) 論

本研究對采集到的一株野生菌進(jìn)行分類鑒定，通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，證明該菌為硫磺菌。通過單因素試驗確定其菌絲生長的最適碳源、氮源及最佳碳氮比、培養(yǎng)溫度、pH分別是葡萄糖、酵母膏、30∶1、26 ℃和5。

選擇硫磺菌培養(yǎng)基碳氮比、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)基pH 3個因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計，獲得菌絲最佳培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度26.5 ℃，培養(yǎng)基碳氮比40∶1，pH為5。本試驗結(jié)果與其他學(xué)者報道的硫磺菌培養(yǎng)最適溫度、適宜pH的研究結(jié)果[20,21]一致，但在本試驗得到的最佳培養(yǎng)條件下，硫磺菌菌絲生長速率顯著高于盧東升等[21]、閆梅霞等[22]報道的生長速率。表明本試驗的菌絲培養(yǎng)條件優(yōu)化結(jié)果對山西硫磺菌菌株及其他硫磺菌菌株的人工馴化培養(yǎng)具有重要借鑒意義。

[1] 卯曉嵐. 中國大型真菌[M]. 鄭州: 河南科學(xué)技術(shù)出版社, 2000-10: 2.

[2] 宋杰. 硫磺菌屬的分類與系統(tǒng)發(fā)育及生物地理學(xué)研究[D]. 北京: 北京林業(yè)大學(xué), 2017.

[3] KovácsD, Vetter J. Chemical composition of the mushroom(Bull.) murill[J]. Acta Alimentaria, 2015, 44(1): 104-110.

[4] Petrovi?J, Stojkovi?D, Filipa S R, et al. Study on chemical, bioactive and food preserving properties of(Bull.: Fr.) Murr[J]. Food and Function, 2014, 5(7): 1441-1451.

[5] Martine M, Torrez A S, Campi M G, et al. Ergosterol from the mushroomsp., isolation and structural characterization[J]. Revista Boliviana, 2015, 32(4): 90-94.

[6] 李金平, 何美靜, 李夢雪, 等.淺談硫磺多孔菌的研究[J]. 生物化工, 2019, 5(6): 129-130, 134.

[7] 郭麗宏. 一些冬蟲夏草定殖真菌分類及其次級代謝產(chǎn)物的初步研究[D]. 太原: 山西大學(xué), 2015.

[8] 張永杰, 郭麗宏, 張姝, 等. 適于蛹蟲草遺傳多樣性研究的線粒體分子標(biāo)記的篩選[J]. 微生物學(xué)報, 2015, 55(7): 826-833.

[9] 張晶. 稻花香釀酒大曲微生物區(qū)系解析[D]. 武漢: 湖北工業(yè)大學(xué), 2011.

[10] 劉曉明, 馮俊濤, 易曉華, 等. 大花金挖耳內(nèi)生真菌H-18菌株的鑒定及其抑菌活性研究[J]. 西北植物學(xué)報, 2008(7): 1371-1376.

[11] 李青, 韓鵬遠(yuǎn), 柴美清, 等. 不同碳源對3種羊肚菌菌絲生長的影響[J]. 農(nóng)學(xué)學(xué)報, 2018, 8(7): 42-45.

[12] 張園園, 張百忍. 不同碳、氮源對朱紅硫磺菌菌絲生長的影響[J]. 食用菌學(xué)報, 2014, 21(4): 20-22.

[13] 江微, 杜雙田, 常昕, 等. 不同碳源及氮源對釘子菇菌絲生長的影響[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 2011, 39(5): 203-207.

[14] 孟玲, 王麗華, 黃芳, 等. 花臉香蘑菌絲體培養(yǎng)特性的研究[J]. 食用菌學(xué)報, 2010, 17(3): 41-45.

[15] 董潔, 夏敏敏, 王成忠, 等. 金絲小棗棗泥酵素發(fā)酵工藝的研究[J]. 食品工業(yè)技, 2014, 35(2): 197-200, 205.

[16] 林海晶. 麥麩水溶性膳食纖維的制備及改性研究[D]. 哈爾濱: 東北農(nóng)業(yè)大學(xué), 2017.

[17] 鮑蕊, 杜雙田, 張晶, 等. 溫度對大球蓋菇生長發(fā)育的影響[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 2016, 44(10): 193-198.

[18] 王海丹, 成亞斌, 宋賢良, 等. 鹽雞鹵汁酶解工藝優(yōu)化及氨基酸組成分析[J]. 食品工業(yè)科技, 2018, 39(9): 295-300, 305.

[19] 伊莉, 吳鎖柱, 孟瓊宇, 等. 響應(yīng)面優(yōu)化胡麻粕蛋白提取工藝及其功能性質(zhì)研究[J]. 食品研究與開發(fā), 2019, 40(18): 52-57.

[20] 謝兵, 龔永新, 王紹柏. 硫磺菌的椴木馴化栽培研究初報[J]. 食用菌, 2012, 34(6): 13-15.

[21] 蘭玉菲, 安秀榮, 唐麗娜, 等. 泰山硫磺菌硫磺原變種的生物學(xué)特性研究[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué), 2012, 44(8): 46-48.

[22] 閆梅霞, 胡清秀. 硫磺菌的固體和液體培養(yǎng)研究[J]. 食用菌學(xué)報, 2007(4): 55-58.

Identification and optimization of mycelium culture condition of a wildstain

Li Yanting1Guo Shang1*Lang Huifang2Guo Xiaofei1Chen Nan1

(1. Shanxi Agricultural University, Shanxi Institute for Functional Food, Taiyuan, Shanxi 030031, China；2. Agriculture and Animal Husbandry Service Center of Mount Wutai Scenic Area , Xinzhou, Shanxi 034000, China)

A wildcollected from Shanxi was classified and identified. The effects of carbon source, nitrogen source, carbon nitrogen ratio, culture temperature and pH on the mycelial growth of the fungus were analyzed by single factor test, and the mycelial culture conditions were optimized by response surface test. The results indicated that the best carbon source for mycelium growth was glucose and the best nitrogen source was yeast extract. Through response surface optimization, the optimum culture conditions of mycelium were C/N ratio was 40∶1, culture temperature was 26.5 ℃, pH 5. Under these conditions, the mycelium growth rate ofwas 5.608 mm/d.

; identification;mycelium; optimization of culture condition

S646, S567.3

A

2095-0934（2022）02-138-06

山西省科技成果轉(zhuǎn)化引導(dǎo)專項項目（201904D131042）；山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科研創(chuàng)新團(tuán)隊專項（YGC2019TD03）；山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新研究課題（YCX2020SJ04）

李艷婷（1986—），女，碩士，助研，主要研究方向為野生食藥用菌馴化及功能性成分開發(fā)利用。E-mail：527305917@qq.com。

，E-mail：GS0351@sohu.com。