遼藁本配方顆料標(biāo)準(zhǔn)湯劑UPLC特征圖譜研究

王曉彤 張志強(qiáng) 高 揚(yáng) 周永康 田聰慧

北京康仁堂藥業(yè)有限公司/北京市中藥配方顆粒工程技術(shù)研究中心，北京 101301

遼藁本為傘形科遼藁本LigusticumjeholenseNakai et Kitag.的干燥根莖和根，秋季莖葉枯萎或次春出苗時(shí)采挖，具有祛風(fēng)、散寒、除濕、止痛的功效；主治風(fēng)寒感冒、巔頂疼痛、風(fēng)濕痹痛[1]， 始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品。主要分布于山西、山東、河北、遼寧、吉林[2]等地。

目前針對于遼藁本的研究集中在化學(xué)成分、藥理作用及科學(xué)種植等方面，尚未發(fā)現(xiàn)有遼藁本標(biāo)準(zhǔn)湯劑的相關(guān)研究。有學(xué)者[3]指出遼藁本揮發(fā)油的主要成分是水芹烯、醋酸松柏酯、肉豆蔻醚等。藁本、遼藁本所獲得的HPLC指紋圖譜大致相似，僅少數(shù)峰峰面積存在一定差異。在分子鑒定領(lǐng)域，有學(xué)者通過不同產(chǎn)地川芎及藁本、遼藁本的ITS2序列的比較發(fā)現(xiàn)，藁本、遼藁本GC含量、變異位點(diǎn)及遺傳距離均提示二者親緣關(guān)系近，極有可能是同一物種的兩個(gè)變種或者其中之一為另一個(gè)的變種[4]。林偉雄等[5]建立了遼藁本藥材的UPLC特征圖譜，比較了藥材與藥渣之間的區(qū)別，為藥渣的二次利用提供了一定依據(jù)。

中藥標(biāo)準(zhǔn)湯劑是由單味中藥飲片經(jīng)水提、濃縮、干燥而成，被作為中藥配方顆粒的中間體，配方顆粒經(jīng)中醫(yī)臨床配方后，供患者即沖即服，具有方便攜帶、便于調(diào)配等優(yōu)點(diǎn)[6]。近年來，隨著市場份額的不斷擴(kuò)大，迫切的需要統(tǒng)一質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。但由于加工為中間體標(biāo)準(zhǔn)湯劑后，外在的性狀、顯微特征消失，無法通過傳統(tǒng)鑒別方法確定基原，從而影響對其質(zhì)量的全面控制。本研究采用UPLC法建立了遼藁本特征圖譜，不僅可以為遼藁本配方顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)，還可以用于不同基原藥材的鑒別，具有快速、準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)等特點(diǎn)。

1 材料

1.1 儀器 Waters ACQUITY UPLC?H-Class超高效液相色譜儀，PDA Detector檢測器，TUV Detector檢測器，Empower 3色譜工作站。ME104E電子天平(梅特勒·托利多)，JY20002電子天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)，KQ-500DB超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。微電腦陶瓷煎藥壺(永達(dá)基電器廠)； DZKW-4電子恒溫水浴鍋(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)；DHG-9245A電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；LGJ-10F冷凍干燥機(jī)(北京松源華興科技發(fā)展有限公司)；N-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、CCA-1112冷卻水循環(huán)裝置、MZ2cNT氣動(dòng)薄膜真空泵(日本東京理化器械株式會(huì)社)。

1.2 試藥 阿魏酸對照品(批號(hào)：110773-201614，純度99.0%，中國食品藥品檢定研究院)；藁本對照藥材(批號(hào)：121128-201202，中國食品藥品檢定研究院)；遼藁本對照藥材(批號(hào)：121129-201702，中國食品藥品檢定研究院)，乙腈(Merck)，磷酸(Fisher)，水(廣州屈臣氏)，其余試劑均為分析純。遼藁本藥材共15批，經(jīng)北京康仁堂藥業(yè)有限公司于立偉經(jīng)理鑒別為遼藁本LigusticumjeholenseNakai et Kitag.，研究人員自行加工為飲片，作為標(biāo)準(zhǔn)湯劑原料。藥材詳細(xì)信息見表1。

表1 遼藁本藥材樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備 以衛(wèi)生部、國家中醫(yī)藥管理局發(fā)布的《醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》[7]和國家藥典委員會(huì)發(fā)布的《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求(征求意見稿)》[8]為依據(jù)，考察遼藁本標(biāo)準(zhǔn)湯劑工藝條件，以制備 “遼藁本標(biāo)準(zhǔn)湯劑”， “遼藁本標(biāo)準(zhǔn)湯劑”的制法為：取遼藁本飲片，置于砂鍋中，浸泡30 min，一煎加入飲片量10倍水，武火煮沸后，文火煎煮30 min，趁熱過濾，迅速冷卻，備用；二煎加飲片量8倍水，武火煮沸后，文火煎煮20 min，趁熱過濾，迅速冷卻備用；合并濾液，濃縮(50 ℃)，濃縮至料液比約為1∶1(相對密度為1.05～1.10(50 ℃)，冷凍干燥，即得。以上述方法制備15批次遼藁本標(biāo)準(zhǔn)湯劑。

2.2 色譜條件 Waters ACQUITY UPLC?BEH Shield RP 18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；流動(dòng)相為乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)，梯度洗脫：0～7.5 min，5～23% A；7.5～12 min，23～100% A，記錄12 min色譜圖；檢測波長280 nm；柱溫30 ℃；流速0.4 mL/min；進(jìn)樣量2 μL。

2.3 供試品溶液的制備 取遼藁本標(biāo)準(zhǔn)湯劑粉末(過三號(hào)篩)約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，稱重，超聲處理20 min，放冷，用70%甲醇補(bǔ)足減失的重量，過濾，取續(xù)濾液，0.2 μm微孔濾膜過濾，作為供試品溶液。

2.4 對照藥材溶液的制備 取遼藁本對照藥材2.5 g，加入18倍水，煮沸50 min，按照標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備工藝制備，濾過，濾液減壓濃縮至干，置具塞錐形瓶中，加70%甲醇50mL，密塞，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)20 min，放冷，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，作為對照藥材溶液。

2.5 對照品溶液的制備 取阿魏酸對照品適量，精密稱定，加70%甲醇制成每1毫升含0.1 mg的溶液，即得。

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批遼藁本標(biāo)準(zhǔn)湯劑(批號(hào)：190116-113301-01)6份，按“2.2”項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，結(jié)果顯示各共有峰相對保留時(shí)間無明顯變化，RSD值為0.47%～1.00%，相對峰面積RSD值為1.70%～2.78%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.6.2 中間精密度實(shí)驗(yàn) 取同一批遼藁本標(biāo)準(zhǔn)湯劑(批號(hào)：190116-113301-01)6份，按“2.2”項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，使用另一臺(tái)waters UPLC H-Class儀器，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，結(jié)果顯示各共有峰相對保留時(shí)間無明顯變化，RSD值為0.06%～0.17%，相對峰面積RSD值為0.28%～1.35%，不同儀器間相對保留時(shí)間RSD值為0.32%～0.73%，相對峰面積RSD值為1.76%～8.02%，表明該方法中間精密度良好。

2.6.3 穩(wěn)定性 精密吸取同一供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，結(jié)果顯示各共有峰相對保留時(shí)間無明顯變化，RSD值為0.32%～1.25%，相對峰面積RSD值為1.12%～1.99%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 特征圖譜的建立與分析

2.7.1 特征峰指認(rèn) 分別取“2.3”項(xiàng)下供試品溶液與“2.4”項(xiàng)下對照品溶液，按照“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，如圖1所示。將供試品色譜峰與對照品色譜峰的保留時(shí)間進(jìn)行對比，確定供試品溶液中，3號(hào)峰為綠原酸，5號(hào)峰為阿魏酸。

圖1 特征峰指認(rèn)圖譜

2.7.2 特征圖譜的建立 分別取15批遼藁本標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品，按照“2.2”色譜條件獲得其液相圖譜，如圖2所示，使用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)》(2012版本)，以S1液相圖譜為參照圖譜，按中位數(shù)計(jì)算，得出遼藁本配方顆粒對照圖譜，選擇6個(gè)分離度較好的色譜峰為特征峰，并進(jìn)行特征峰的標(biāo)識(shí)。

圖2 15批遼藁本標(biāo)準(zhǔn)湯劑UPLC堆疊圖

圖3 遼藁本標(biāo)準(zhǔn)湯劑標(biāo)準(zhǔn)圖譜

2.7.3 共有峰相對保留時(shí)間、相對峰面積的測定 根據(jù)對照品的可獲得性及各特征峰所推斷的物質(zhì)在藥效方面的代表性，確定了阿魏酸為參照物，同時(shí)由于其保留時(shí)間及峰面積在特征圖譜中的情況，確定5號(hào)峰(阿魏酸)為參照峰，計(jì)算各特征峰與5號(hào)峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積，對15批遼藁本標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉特征圖譜進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。其結(jié)果見表2和表3。

2.7.4 不同批次標(biāo)準(zhǔn)湯劑特征圖譜相似度分析 使用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)》(2012版本)，計(jì)算15批遼藁本標(biāo)準(zhǔn)湯劑特征圖譜與對照特征圖譜的相似度，其結(jié)果如下。15批遼藁本標(biāo)準(zhǔn)湯劑特征圖譜與對照特征圖譜的相似度為0.984～1.000，均高于0.98，表明圖譜的差異較小。見表4。

表2 15批遼藁本標(biāo)準(zhǔn)湯劑相對保留時(shí)間表

表3 15批遼藁本標(biāo)準(zhǔn)湯劑相對峰面積

表4 相似度計(jì)算結(jié)果

續(xù)表4 表4 相似度計(jì)算結(jié)果

2.7.5 對照藥材圖譜 取遼藁本對照藥材溶液，在相同的色譜條件下進(jìn)行測定，結(jié)果如圖4所示。由結(jié)果可知，樣品色譜圖與對照藥材對應(yīng)良好。

圖4 對照藥材圖譜

3 討論

比較了不同波長(254 nm、280 nm、320 nm)，不同柱溫(25 ℃、30 ℃、35 ℃)，不同流速(0.38 mL/min、0.4 mL/min、0.42 mL/min)，不同流動(dòng)相(乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.1%甲酸)的分離效果，結(jié)果以波長280 nm，柱溫30 ℃，流速0.4 mL/min，流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸時(shí)，分離效果較好。

比較了不同提取溶劑(乙醇、70%乙醇、50%乙醇、30%乙醇、甲醇、70%甲醇、50%甲醇、30%甲醇)，不同提取方式(超聲、回流)，不同提取時(shí)間(20 min、30 min、40 min)，最終確定以70%甲醇超聲提取20 min效果最好。

本研究獲得了15批遼藁本標(biāo)準(zhǔn)湯劑的特征圖譜，并進(jìn)行了相似度計(jì)算，相似度結(jié)果均大于0.98，結(jié)果表明，不同產(chǎn)地的遼藁本藥材差異較小，整體一致，有較高的相似性，可以提供全面的質(zhì)量信息。

遼藁本藥材一直以來都以野生、半野生為主，但由于早期中藥材的生產(chǎn)處于粗放型狀態(tài)，過度挖掘，對其生境的嚴(yán)重破壞，使大的自然居群越來越少。筆者通過走訪各大型藥材市場發(fā)現(xiàn)，目前市場上的藥材以遼藁本栽培品為主，質(zhì)量以東北產(chǎn)為佳。遼藁本中的主要成分為苯肽類、揮發(fā)油類及酚酸類成分，作為標(biāo)準(zhǔn)湯劑使用時(shí)，由于經(jīng)過高溫水煮，揮發(fā)油成分損失較大，此時(shí)以阿魏酸為主的酚酸類成分則為遼藁本中的主要成分。本法所使用的對照圖譜為對照藥材模擬標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備后得到的特征圖譜，與標(biāo)準(zhǔn)湯劑保持高度一致性，對比分析更準(zhǔn)確，專屬性更強(qiáng),這對于遼藁本標(biāo)準(zhǔn)湯劑質(zhì)量的有效控制及合理應(yīng)用都具有一定的意義。