縣級實驗室應用結核分枝桿菌手工液體培養(yǎng)技術檢測結果分析

邱勇 李蒙 屈榕 田發(fā)君

結核病是結核分枝桿菌感染引起的慢性傳染病，診斷結核病最直接有效的方法就是從痰液中檢測到結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)[1-2]。目前，國內(nèi)檢測痰樣本中MTB的方法以抗酸染色涂片和分枝桿菌培養(yǎng)法為主?？顾崛旧科ê唵畏奖?，但陽性檢出率低[3-4]。在培養(yǎng)法中，固體羅氏(L-J)培養(yǎng)法是目前國內(nèi)最常用的方法，其陽性率較涂片高，但培養(yǎng)時間長，需要4～8周。雖然自動化液體培養(yǎng)報告陽性時間短于固體培養(yǎng)[5]，但其設備昂貴，通量高，不適合樣本量較少的縣級結核病實驗室使用。手工液體培養(yǎng)法成本顯著低于自動液體培養(yǎng)。本研究旨在采用分枝桿菌液體培養(yǎng)法(mycobacterium fast liquid medium，MFLM)進行手工液體培養(yǎng)與中和離心固體培養(yǎng)法進行比較，以評估手工液體培養(yǎng)法在結核病診斷中的應用價值。

資料和方法

一、材料

1. 標本來源：收集2018年7月1日至2020年12月31日在四川省武勝縣疾病預防控制中心(簡稱“疾控中心”)結核病防治門診就診的疑似肺結核患者首次就診時的痰標本。

2. 儀器與試劑：N-乙酰-L半胱氨酸NaOH(NaOH-NALC)前處理液、中性固體羅氏培養(yǎng)基、分枝桿菌液體培養(yǎng)管、分枝桿菌熒光檢測儀(Myco Fast Ⅰ)均購自珠海貝索生物技術有限公司，離心機為Eppendorf Centrifuge 5810，儀器與試劑均由復旦大學基礎醫(yī)學院醫(yī)學分子病毒學重點實驗室提供。

二、研究方法

同時采用手工液體培養(yǎng)法和中和離心固體培養(yǎng)法對疑似患者的痰標本進行培養(yǎng)。具體步驟如下。

1. 標本留?。洪T診就診的疑似肺結核患者將即時痰、夜痰和晨痰送至疾控中心，工作人員在痰盒上標注患者信息，然后立即送至實驗室進行檢測。

2. 標本前處理和分離培養(yǎng)：將3份痰標本混合后取2～5 ml于50 ml帶蓋的尖底離心管中，先用2倍體積NaOH-NALC前處理液消化20 min，加入pH值為6.8的磷酸鹽緩沖液(PBS)至50 ml，3000×g離心15 min，再棄上清液，沉淀用1 ml的pH值為6.8 PBS制備成約1.5 ml懸濁液；取1支MFLM培養(yǎng)管接種10滴(0.5 ml)懸濁液，取2支中性L-J培養(yǎng)管分別接種2滴(0.1 ml)懸濁液。2種培養(yǎng)管均置于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

3. 結果判定：按照《中國結核病防治工作技術指南》[6]和珠海貝索生物技術有限公司建議記錄了每個樣本的報告陽性時間。手工液體培養(yǎng)用分枝桿菌熒光檢測儀進行判讀，接種后第2、3、7天判讀1次，以后每周判讀2次，6周末仍為陰性，則表示培養(yǎng)結果為陰性[7]。固體培養(yǎng)用肉眼觀察，接種后第3、7天觀察1次，此后每周觀察1次，8周末仍未見菌落生長為陰性[7]。對培養(yǎng)陽性標本進行抗酸染色，抗酸染色陽性則為陽性，接著用對硝基苯甲酸(PNB)生長試驗進行菌種鑒定，抗酸染色陰性則判斷為污染。對污染的液體培養(yǎng)物進行去污染處理(加入2倍NaOH-NALC消化20 min)后進行再培養(yǎng)，操作同上，若菌種鑒定結果為結核分枝桿菌或非結核分枝桿菌即統(tǒng)計為最終培養(yǎng)陽性，否則記錄為污染。

4. 菌種鑒定：使用PNB進行菌種鑒定。具體操作如下：(1)使用無菌吸管吸取生理鹽水加1滴至磨菌瓶中，用接種環(huán)刮取菌落至磨菌瓶中，仔細研磨均勻；(2)向磨菌瓶中加入生理鹽水，并通過加生理鹽水與麥氏1號標準比濁度進行比較，調(diào)節(jié)濁度，直至與標準麥氏比濁管一致，即為1 mg/ml的菌液；(3)用標準接種環(huán)取2滿環(huán)1 mg/ml的菌液，移至2 ml 準備的前處理管生理鹽水中，即稀釋成2～10 mg/ml菌液；(4)用標準接種環(huán)取1滿環(huán)2～10 mg/ml菌液，用劃線法均勻接種至鑒定培養(yǎng)基表面；(5)接種后培養(yǎng)基直立放于培養(yǎng)箱內(nèi)，36 ℃培養(yǎng)；培養(yǎng)4周后報告結果。

5. 質量控制：陰性管不可重復使用；培養(yǎng)基、消化液等實驗材料使用前檢查是否在有效期內(nèi)；實驗室用水為儀器制備的UP等級水，經(jīng)過高壓蒸汽滅菌60 min，有效期為3 d。

三、統(tǒng)計學處理

采用Excel 2007和SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)資料的統(tǒng)計學分析。培養(yǎng)報告陽性時間等非正態(tài)分布的資料均以“M(Q1，Q3)”描述，運用χ2檢驗進行組間率的比較，通過一致性檢驗的Kappa系數(shù)來評價兩種培養(yǎng)方法結果的一致性，培養(yǎng)報告陽性時間的比較采用Mann-WhitneyU檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、兩種培養(yǎng)方法的陽性率比較

本研究共納入疑似肺結核患者1370例，對疑似患者的痰標本進行集菌法處理后分別進行中和離心固體培養(yǎng)和手工液體培養(yǎng)。結果顯示中和離心固體培養(yǎng)法報告陽性標本274例，陽性率為20.0%(274/1370)。手工液體培養(yǎng)法報告陽性標本353例，陽性率為25.8%(353/1370)。手工液體培養(yǎng)法的陽性率高于中和離心固體培養(yǎng)法的陽性率，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=12.907，P<0.001)，陽性率提高了28.8%。對兩種培養(yǎng)方法的陽性和陰性結果進行一致性檢驗，Kappa系數(shù)為0.833(P<0.001)。兩種培養(yǎng)方法的結果見表1。分別統(tǒng)計兩種培養(yǎng)方法的污染情況。手工液體培養(yǎng)法共報告污染標本153例，其中11例經(jīng)過去污染處理后再培養(yǎng)陽性，污染率為10.4%(142/1370)。中和離心固體培養(yǎng)報告污染標本144例，污染率為10.5%(144/1370)。

二、 兩種培養(yǎng)方法非結核分枝桿菌檢出率的比較

利用PNB對培養(yǎng)陽性的菌株進行菌種鑒定，兩種培養(yǎng)方法共檢出41例(non-tuberculous mycobacterium，NTM)，其中手工液體培養(yǎng)法檢出38例，中和離心固體培養(yǎng)法只檢出13例，前者比后者多檢出25例，手工液體培養(yǎng)法檢出NTM的能力顯著高于中和離心固體培養(yǎng)法，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=32.416，P<0.001)。

三、 兩種培養(yǎng)方法報告陽性時間的比較

手工液體培養(yǎng)法的中位報告陽性時間為2(2，3)周，2周及以內(nèi)報告陽性率為62.6%，4周及以內(nèi)報告陽性率為94.9%，手工液體培養(yǎng)法在第2周報告陽性率最高，為38.8%(137/353)。中和離心固體培養(yǎng)法的中位報告陽性時間為3(2，4)周，3周及以內(nèi)報告陽性率為66.1%，6周及以內(nèi)報告陽性率為95.3%，中和離心固體培養(yǎng)法第3周報告陽性率最高，為38.7%(106/274)(表2)。手工液體培養(yǎng)法的報告陽性時間顯著短于中和離心固體培養(yǎng)，差異有統(tǒng)計學意義(Z=-9.491，P<0.001)。

表2 兩種培養(yǎng)方法報告陽性時間

討 論

為了評估手工液體培養(yǎng)法在基層(縣級)結核病實驗室應用效果，筆者共納入本單位收治的1370例疑似肺結核患者，對其痰標本分別進行手工液體培養(yǎng)法和中和離心固體培養(yǎng)法，結果顯示手工液體培養(yǎng)法的陽性率更高，報告陽性時間更短，適合在基層實驗室用于結核病的診斷。

手工液體培養(yǎng)法可以顯著提高MTB的陽性檢出率。在南非開展的一項研究通過收集疑似結核病患者的痰液進行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)液體分枝桿菌培養(yǎng)管(mycobacterium growth indicator tube，MGIT)培養(yǎng)法相較于中和離心固體培養(yǎng)陽性率提高了30.3%(29.7%比22.8%)[8]。另一項在埃塞俄比亞進行的研究也發(fā)現(xiàn)，液體MGIT培養(yǎng)法的陽性率提高了30%(26%比20%)[9]。國內(nèi)學者也開展了類似的研究，吳學兵等[10]在上海市松江區(qū)開展的研究發(fā)現(xiàn)，對疑似新發(fā)肺結核患者，液體MGIT培養(yǎng)法的陽性率為32.0%，中和離心固體培養(yǎng)法的陽性率為17.9%；王曉艷等[11]對確診肺結核患者的研究發(fā)現(xiàn)，液體MGIT培養(yǎng)法的陽性率比簡單固體培養(yǎng)高23.5%(57.2%比46.3%)。本研究結果與上述國內(nèi)外研究一致，發(fā)現(xiàn)手工液體培養(yǎng)法的陽性率比中和離心固體培養(yǎng)法高28.8%。培養(yǎng)陽性率提高可以得到更多的臨床菌株，可以對更多的結核病患者進行耐藥檢測，同時，也能發(fā)現(xiàn)更多的NTM患者，從而為臨床診斷和治療提供更準確的指導。

手工液體培養(yǎng)法可以顯著縮短報告陽性時間。國內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)疑似患者的手工MGIT培養(yǎng)法的平均報告陽性時間為13.63 d，而中和離心固體培養(yǎng)法為28.67 d[10]。王曉艷等[11]報道的自動化液體MGIT培養(yǎng)法涂陽標本的平均報告陽性時間僅為8.75 d，涂陰標本為16.04 d。國外研究的結果與國內(nèi)相似，發(fā)現(xiàn)MGIT培養(yǎng)法的平均報告陽性時間在2至 3周內(nèi)[8-9]。本研究的手工液體培養(yǎng)法中位報告陽性時間為2周，近95%的陽性結果報告陽性時間在4周內(nèi)，均顯著短于中和離心固體培養(yǎng)法。此外，由于本研究中每周僅對手工液體培養(yǎng)管觀察2次，對中和離心固體培養(yǎng)管觀察1次，因此，實際報告陽性時間很可能短于本研究報告的報告陽性時間。

本研究中，手工液體培養(yǎng)法的污染率為10.4%，高于國內(nèi)研究報道的手工MGIT培養(yǎng)法的5.8%和儀器MGIT培養(yǎng)法的6.2%[12]，也高于國外研究報道的手工MGIT培養(yǎng)法的1.4%[13]。但是，早些年以及近些年也有研究報道MGIT培養(yǎng)法的污染率在15%左右[9,14]。本研究中和離心固體培養(yǎng)法的污染率為10.5%，明顯高于國內(nèi)學者報道的4.0%[10]，也高于國外的9.3%[9]?？傊?，本研究手工液體培養(yǎng)法的污染率略高于正常值，但中和離心固體培養(yǎng)法的污染率是正常值的兩倍。目前對導致污染率高的具體原因還不清楚。盡管在實驗過程中我們盡量嚴格按照標準操作流程，但由于我們使用的是商品化的培養(yǎng)基和消化液等耗材，未對其不同批次產(chǎn)品進行質量控制。同時，我們盡管在保質期內(nèi)使用這些耗材，但存儲時間長是否會影響污染率也不清楚，這些都有待今后的工作中予以解決。

目前我國縣級結核病實驗室大多未開展痰培養(yǎng)，在開展的地區(qū)也主要是采用固體培養(yǎng)方法，本研究證明手工液體培養(yǎng)法相比于中和離心固體培養(yǎng)法，不僅顯著提高了陽性率，而且明顯縮短了報告陽性的時間。手工液體培養(yǎng)法的操作并不復雜，試劑和儀器經(jīng)濟可及。手工液體培養(yǎng)法僅需要1支培養(yǎng)管(中和離心固體培養(yǎng)法需要2支，簡單固體培養(yǎng)法需要4支)，其成本與固體培養(yǎng)法相當。此外，手工MFLM培養(yǎng)法能多檢出30%菌陽肺結核患者，更利于藥物敏感試驗的開展，可以發(fā)現(xiàn)更多耐藥患者，為診斷和治療提供指導，從而降低結核病的疫情。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻邱勇：醞釀和設計實驗、實施研究、采集數(shù)據(jù)、起草文章；李蒙：分析/解釋數(shù)據(jù)、起草文章、對文章的知識性內(nèi)容作批評性審閱、統(tǒng)計分析；屈榕：實施研究、采集數(shù)據(jù)；田發(fā)君：實施研究、采集數(shù)據(jù)