植物精油和胰酶對肉雞生長性能、消化酶活性及腸道健康的影響

■孫憲法 周 東 孫憲秋 王 聰 蔡青和*

(1.山東民和牧業(yè)股份有限公司，山東 蓬萊 265600；2.上海歐耐施生物技術(shù)有限公司，上海 201606)

恩拉霉素對家禽腸道內(nèi)有害梭狀芽孢桿菌有很強(qiáng)的抑制作用，從而提高飼料中營養(yǎng)成分的利用率，促進(jìn)增重和飼料轉(zhuǎn)化率[1-2]。恩拉霉素在肉雞中的應(yīng)用效果已被業(yè)界研究所證實(shí)，但從2020 年7 月1 日起，我國禁止使用除中藥外的所有促生長藥物飼料添加劑，抗生素的禁用導(dǎo)致家禽腸道疾病高發(fā)，因此尋找抗生素的替代品刻不容緩。

植物精油（Essential oil，EO）是一類源于植物的花、葉、莖、根或果實(shí)的次生代謝產(chǎn)物，分子量小，在動物體內(nèi)吸收代謝快、無毒無殘留，具有促進(jìn)動物生長、消炎殺菌及抗氧化的功效[3]。植物精油種類豐富，含有多種活性成分，對于家禽的腸道發(fā)育、消化生理、腸道免疫和微生物區(qū)系調(diào)節(jié)方面都具有良好的改善作用，是一種潛力巨大的抗生素替代品，國內(nèi)外關(guān)于植物精油的研究成果快速增長，將植物精油應(yīng)用在動物生產(chǎn)上做了很多工作，獲得了很多成果[4]。酶是有活性的蛋白質(zhì)，在農(nóng)牧、食品、醫(yī)藥、生物燃料等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。家禽的腸道短，食糜停留時(shí)間短，內(nèi)源酶作用有限，養(yǎng)分消化吸收不充分；家禽結(jié)腸退化，盲腸很小，盲腸微生物對非淀粉多糖（NSP）的降解能力有限，加入酶制劑可增強(qiáng)腸道黏膜屏障功能，改善腸道健康；鈍化日糧中抗?fàn)I養(yǎng)因子，提高養(yǎng)分消化率，從而減輕產(chǎn)氣莢膜梭菌感染對肉仔雞生長的不利。胰酶是從動物胰腺中提取的一種酶的混合物，含有胰蛋白酶、糜蛋白酶、多種肽酶、脂肪酶和淀粉酶等。劉干[5]研究表明酶制劑可以提高肉雞生長性能，改善腸道健康。孫秋娟等[6]報(bào)道，酶制劑和植物精油組合添加可提高產(chǎn)氣莢膜梭菌感染肉雞的生長性狀，并可降低回腸有害菌的定植，保護(hù)腸道屏障功能及組織形態(tài)結(jié)構(gòu)免受產(chǎn)氣莢膜梭菌感染的侵害，從而維持腸道健康。相關(guān)試驗(yàn)研究表明植物精油和胰酶均可以提高肉雞生長性能，但植物精油和胰酶二者組合在肉雞生產(chǎn)試驗(yàn)中未見報(bào)道。因此本試驗(yàn)以AA肉公雞為研究對象，在日糧中添加不同水平的植物精油和胰酶，并進(jìn)行攻毒，觀察其對肉雞生長性能、消化酶活性和腸道健康的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)使用的恩拉霉素為市購產(chǎn)品（純度8%，DSM）；植物精油由某公司提供；胰酶（含胰蛋白酶500 U/g、胰淀粉酶2 400 U/g、胰脂肪酶3 500 U/g）由上海某生物技術(shù)有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將504只AA肉公雞分為7個(gè)處理組，每個(gè)處理分6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)12只。試驗(yàn)分兩個(gè)階段，第一階段1～21 d，第二階段22～42 d。具體試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

攻毒方案：于第14 d，用產(chǎn)氣莢膜梭菌（CP）毒株（CVCC2030）對試驗(yàn)中的CP 菌感染組雞只經(jīng)口接種1 mL 菌液[（2～3）×108CFU/mL]，持續(xù)攻毒至第20 d。操作流程：將產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株在含有牛肉粒的滅菌皰肉培養(yǎng)液中37 ℃恒溫過夜厭氧培養(yǎng)（12～14 h），用胰-亞硫酸鹽-環(huán)絲氨酸（tryptose-sulfite-cycloserine，TSC）瓊脂（北京陸橋技術(shù)股份有限公司）進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，攻毒組每天每只雞口服新鮮菌液1 mL[（2～3）×108CFU/mL]，不攻毒組肉雞口服等量的無菌皰肉培養(yǎng)液。灌服用注射器或移液槍。

1.3 基礎(chǔ)日糧

基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平見表2。

表2 基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.4 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)于2019 年6 月在中國農(nóng)業(yè)大學(xué)涿州試驗(yàn)基地進(jìn)行。試驗(yàn)采用封閉式雞舍單層籠養(yǎng)。按照AA肉雞常規(guī)飼養(yǎng)管理程序進(jìn)行管理，自由采食和飲水，按常規(guī)免疫程序進(jìn)行免疫。

1.5 樣品采集與制備

試驗(yàn)第42 d，從每個(gè)重復(fù)中隨機(jī)取2只肉仔雞宰殺，取十二指腸食糜并準(zhǔn)確稱取待測十二指腸食糜的重量，按重量（g）∶體積（mL）=1∶4的比例加入4倍體積的生理鹽水，冰水浴條件下機(jī)械勻漿。將勻漿液4 ℃下2 500 r/min離心10 min，取上清液于-20 ℃保存?zhèn)錅y消化酶活性。采集第42 d肉雞空腸中段的1 cm腸道樣品在冰磷酸鹽緩沖液中清洗食糜，進(jìn)行腸道炎癥評分。

1.6 指標(biāo)測定

1.6.1 生長性能試驗(yàn)的第1、21 d 和42 d 稱重、結(jié)料用于計(jì)算平均體重、平均日增重（average daily gain, ADG）、平均日采食量（average daily feed intake, ADFI）和飼料轉(zhuǎn)化率（feed conversion ratio, FCR）。

1.6.2 十二指腸消化酶活性

采用南京建成生物工程研究所試劑盒方法，測定42 d 肉雞十二指腸食糜中淀粉酶（DIS）、胰蛋白酶（Tps）、糜蛋白酶（Chy）和脂肪酶（LP）活性。

1.6.3 腸道炎癥評分

觀察42 d肉雞空腸腸道炎癥情況并做評分，計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)：0=無肉眼可見的損傷；1=腸壁薄或易碎（充血）；2=小的局灶壞死或潰瘍；3=局灶性壞死或潰瘍。

1.6.4 腸黏膜組織炎性因子mRNA表達(dá)量

刮取42 d肉雞空腸、回腸組織腸黏膜，液氮保存，實(shí)時(shí)熒光定量PCR 測定白介素-1β（Interleukin-1β，IL-1β）、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、Toll 樣受體-4（Toll-like receptor4，TLR-4）、腫瘤壞死因子-α（TNFα）的mRNA相對表達(dá)量。總RNA提取按照賽默飛公司提取步驟進(jìn)行，隨后用核酸蛋白測定儀測定總RNA的純度和濃度。cDNA合成采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKa-Ra，大連）。采用SYBR Green Ⅱ染料法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，采用美國ABI 7500 熒光定量PCR 儀進(jìn)行測定，引物序列見表3。

表3 PCR引物序列

1.7 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPASS 17.0 軟件中單因素方差分析（one-way ANOVA）程序進(jìn)行分析，采用Duncan’s法進(jìn)行多重比較，P＜0.05 為差異顯著，P＞0.05 為差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物精油和胰酶對肉雞生長性能的影響（見表4～表6）

表4 植物精油和胰酶對肉雞生長性能的影響(1～21 d)

表6 植物精油和胰酶對肉雞生長性能的影響(1～42 d)

由表4 可知，試驗(yàn)前期（1～21 d），B 組和A 組相比，ADFI、ADG和21 d體重均下降，但差異不顯著（P＞0.05），F(xiàn)CR 均為1.72。C 組和A 組相比，ADG、21 d體重和FCR 均有改善，但差異不顯著（P＞0.05）。D～F 組與B 組、D～F 組與G 組相比，差異不顯著（P＞0.05）。G 組與B 組相比，21 d 體重和FCR 有改善，但差異不顯著（P＞0.05）。

由表5 可知，試驗(yàn)后期（22～42 d），B 組和A 組相比，ADG和42 d體重均下降，但差異不顯著（P＞0.05）；FCR升高，但差異不顯著（P＞0.05）。C組和A組相比，ADFI、ADG 和42 d 體重均有改善，但差異不顯著（P＞0.05）；FCR 均為1.73。D～F 組與B 組相比，各項(xiàng)指標(biāo)均有改善，且隨著植物精油添加量的增加，F(xiàn)CR 有逐漸降低的趨勢。G 組與B 組相比，各項(xiàng)指標(biāo)均有改善。F組與G組差異不顯著（P＞0.05）。

表5 植物精油和胰酶對肉雞生長性能的影響(22～42 d)

由表6可知，整個(gè)試驗(yàn)期（1～42 d），B組和A組相比，ADFI、ADG和42 d體重均下降，但差異不顯著（P＞0.05）；FCR 升高，但差異不顯著（P＞0.05）。C 組和A組相比，各項(xiàng)指標(biāo)均有改善，但差異不顯著（P＞0.05）。D～F 組與B 組相比，ADFI、ADG、FCR 指標(biāo)均有改善，且隨著植物精油添加量的增加，F(xiàn)CR 有降低的趨勢。G 組與B 組相比，各項(xiàng)指標(biāo)均有改善。F 組與G 組相比，各項(xiàng)指標(biāo)差異不顯著（P＞0.05）。

2.2 植物精油和胰酶對肉雞十二指腸消化酶活性影響（見表7）

表7 植物精油和胰酶對42 d肉雞十二指腸消化酶活性影響(U/mg prot.)

由表7可知，42 d時(shí)B組Chy、LP、DIS活性低于A組，但差異不顯著（P＞0.05），Tps高于A組差異不顯著（P＞0.05）。C組Tps、Chy、LP活性高于A組，但差異不顯著（P＞0.05）；C組DIS活性較A組顯著提高了44.77%（P＜0.05）。隨著植物精油添加量的增加，各項(xiàng)指標(biāo)有逐漸提高的趨勢，其中F 組酶活性最高。F 組中Chy、LP、DIS 活性顯著高于B 組（P＜0.05），F(xiàn) 組中Tps 活性高于B 組，但差異不顯著（P＞0.05）。E 組、F 組與G 組各項(xiàng)指標(biāo)差異不顯著（P＞0.05）。G組中各項(xiàng)酶活性顯著高于B組（P＜0.05）。

2.3 植物精油和胰酶對肉雞腸道炎癥的影響（見表8）

表8 植物精油和胰酶對42 d肉雞腸道炎癥評分

由表8 可知，C 組和A 組相比、D～F 組與B 組相比，腸道炎癥評分值降低，但差異不顯著（P＞0.05）。且隨著植物精油添加量的增加，腸道炎癥有降低的趨勢。D～F 組與G 組相比，評分值相當(dāng)，差異不顯著（P＞0.05）。

2.4 植物精油和胰酶對肉雞腸黏膜組織炎性因子表達(dá)量的影響（見表9、表10）

表9 42 d肉雞回腸黏膜組織炎性因子表達(dá)量

表10 42 d肉雞空腸黏膜組織炎性因子表達(dá)量

由表9可知，整個(gè)試驗(yàn)期（第1～42 d），B組回腸黏膜組織炎性因子表達(dá)量高于A 組，但差異不顯著（P＞0.05）。C組低于A組，但差異不顯著（P＞0.05）。隨著植物精油添加量的增加，炎性因子表達(dá)量有降低的趨勢，其中F組最低。G組血清中IL-1β、IL-6表達(dá)量顯著低于B組（P＜0.05），IL-4、IL-10表達(dá)量低于B組，但差異不顯著（P＞0.05）。F組與G組各項(xiàng)指標(biāo)差異不顯著（P＞0.05）。

由表10 可知，整個(gè)試驗(yàn)期（第1～42 d），B 組空腸黏膜IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10 高于A 組，但差異不顯著（P＞0.05）；B組空腸黏膜IL-2、IL-8、TLR-4、TNF-α顯著高于A 組（P＜0.05）。C 組空腸黏膜IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10低于A組，但差異不顯著（P＞0.05）；C組空腸黏膜IL-2、IL-8、TLR4、TNF-α顯著低于A 組（P＜0.05）。隨著植物精油添加量的增加，白細(xì)胞介素有逐漸降低的趨勢，其中F 組白細(xì)胞介素最低。G 組空腸黏膜IL-1β、IL-6 低于B 組，但差異不顯著（P＞0.05），G組空腸黏膜IL-2、IL-4、IL-8、IL-10、TLR-4和TNF-α顯著低于B組（P＜0.05）。F組空腸黏膜IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10與G組差異不顯著（P＜0.05）。

3 討論

3.1 植物精油和胰酶對肉雞生長性能的影響

本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，無論肉雞是否感染產(chǎn)氣莢膜梭菌，日糧中添加植物精油和胰酶均可以在一定程度上提高肉雞生長性能。這說明植物精油和胰酶組合添加能讓肉雞更大程度利用飼糧中的營養(yǎng)成分，可以在一定程度上緩解蛋白飼料原料短缺現(xiàn)象。王蘭等[7]研究表明，肉雞日糧中添加植物精油對其生長性能無顯著影響，但各試驗(yàn)組ADG、ADFI均不同程度提高、FCR降低，這說明植物精油對肉雞有一定的促生長作用。日糧中添加酶制劑可以提高家禽生長性能[8-9]。在家禽飼糧中添加胰酶可以提高飼料轉(zhuǎn)化率[10-11]。本試驗(yàn)結(jié)果與上述學(xué)者研究的結(jié)論相一致。Tiihonen等[12]研究表明日糧中添加植物精油可以有效改善肉雞生長性能。顯著性差異的原因可能與精油的添加劑量、組分、試驗(yàn)動物有關(guān)。在本試驗(yàn)中，在攻毒狀態(tài)下，隨著精油添加劑量的增大，肉雞的日增重也逐漸提高，呈現(xiàn)劑量效應(yīng)。

3.2 植物精油和胰酶對肉雞十二指腸消化酶活性影響

本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，日糧中添加植物精油和胰酶可以提高肉雞十二指腸消化酶的活性。這是因?yàn)槿占Z中的豆粕含有大量的胰蛋白酶抑制因子，而胰蛋白酶抑制因子可顯著降低小腸胰蛋白酶活性，添加胰酶和植物精油，可以提高十二指腸消化酶活性。

劉倩[10]研究結(jié)果表明，正常蛋白水平日糧，添加胰酶可以提高肉雞十二指腸消化酶活性。王恩玲等[9]報(bào)道，飼糧中添加復(fù)合酶可以提高肉雞消化酶活性。本試驗(yàn)研究的結(jié)論與上述學(xué)者研究的結(jié)論相一致。

3.3 植物精油和胰酶對肉雞腸道炎癥的影響

本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，日糧中添加植物精油和胰酶可以在一定程度上緩解肉雞腸道炎癥。趙琛等[13]研究報(bào)道，日糧中添加植物精油可以減少單胃動物腸道炎癥的發(fā)生。劉干[5]研究表明，復(fù)合酶制劑可以調(diào)控肉雞腸道健康。這與本試驗(yàn)研究的結(jié)論相類似。

3.4 植物精油和胰酶對肉雞腸黏膜組織炎性因子表達(dá)量的影響

本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，日糧中添加植物精油和胰酶可以降低腸黏膜炎性因子表達(dá)量。劉嬌等[14]研究結(jié)果表明，在攻毒作用下，日糧中添加植物精油可以降低肉鴨腸道黏膜炎性因子的表達(dá)量。劉嬌[15]研究結(jié)果表明，日糧中添加酶制劑可以減少肉鴨炎癥的發(fā)生。熊學(xué)林[16]研究表明，在妊娠后期、哺乳期母豬日糧中添加植物精油，可以降低其炎性反應(yīng)。這與本試驗(yàn)研究的結(jié)論相類似。

4 結(jié)論

在肉雞日糧中添加植物精油和胰酶能夠緩解腸道炎癥，提高腸道消化酶活性及肉雞生長性能，且呈現(xiàn)植物精油劑量效應(yīng)。