檸條堆肥與耕作深度對連作黃瓜土壤細(xì)菌群落組成與代謝功能的影響

張凱歌，蘭摯謙，付玉芳，王曉卓，張雪艷

（寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏銀川 750021）

檸條(Caragana microphylla)作為防風(fēng)固沙、保持水土的功能作物被廣泛種植于我國西北地區(qū)，根據(jù)生長情況需要定期進(jìn)行平茬，據(jù)統(tǒng)計僅寧夏全區(qū)每年產(chǎn)生超過80萬t檸條殘茬廢棄資源[1]。檸條殘茬堆肥化處理作為資源再利用的有效途徑越來越被人們廣泛關(guān)注。Zhang等[2]研究發(fā)現(xiàn)，檸條堆肥氮素和有機(jī)質(zhì)含量高，在長期連作的黃瓜土壤中連續(xù)施用可顯著增加根際土壤碳礦化，促進(jìn)黃瓜根系發(fā)育。但檸條堆肥的高效施用尚缺乏系統(tǒng)性的研究。

有機(jī)肥常以底肥方式施入農(nóng)田，不合理的施用伴隨著對土層過度的侵?jǐn)_。免耕作為一種保護(hù)性耕作方式，減少了對土壤團(tuán)粒結(jié)構(gòu)的破壞，促進(jìn)了生態(tài)環(huán)境的穩(wěn)定性[3]，但長期免耕會導(dǎo)致土壤固、液、氣失衡，需要深翻打破犁底層，協(xié)調(diào)土壤中的水、肥、氣、熱，以改善土壤環(huán)境，促進(jìn)土壤微生物群落多樣性和穩(wěn)定性[4–6]。耕作方式對農(nóng)田土壤環(huán)境的影響在小麥、玉米、棉花等大田作物上多有研究[7]，而設(shè)施土壤上的研究較少。

因此，本研究以檸條堆肥與不同耕作深度配合，探討對土壤養(yǎng)分和微生物多樣性等關(guān)鍵指標(biāo)的影響，以期為檸條殘茬廢棄資源高效再利用，及設(shè)施農(nóng)田生態(tài)可持續(xù)發(fā)展提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與設(shè)計

試驗(yàn)在寧夏園藝產(chǎn)業(yè)園4號日光溫室進(jìn)行，土壤質(zhì)地為粉壤土(含砂粒23.5%，粉砂52.8%和黏粒3.7%)，土壤速效氮、磷、鉀含量分別為10.92、38.52、49.95 mg/kg，有機(jī)質(zhì)含量為12.83g/kg。該區(qū)域海拔 1110.14 m，位于東經(jīng) 105°53′—106°36′，北緯 38°26′—38°48′之間，屬于中溫帶干旱氣候，平均溫度6.28℃～13.1℃，年降雨量為129～600 mm。本試驗(yàn)于2018年2月至2020年1月連續(xù)進(jìn)行了4茬，供試黃瓜品種為‘博美626’(天津德瑞特種業(yè)有限公司)。試驗(yàn)以雞糞+翻耕15 cm為對照(CK)，施用檸條堆肥分別配合免耕(T0)、翻耕15 cm(T15)、翻耕 35 cm (T35)、翻耕 45 cm (T45)，共 5 個處理。檸條、玉米秸稈、羊糞以質(zhì)量比1∶2∶6混合作為堆肥原料，碳氮比 25∶1，堆肥50 天后即為檸條堆肥。檸條堆肥的理化性狀為：容重0.25 g/cm3、總孔隙度 79.2%、全氮 29.70 g/kg、全磷 18.60 g/kg、全鉀18.60 g/kg、有機(jī)碳475 g/kg。雞糞全量氮、磷、鉀含量依次為30.80、13.40、2.32 g/kg，有機(jī)碳含量為312 g/kg。5個處理的氮素投入量相等，雞糞施用量為 22.5 t/hm2，檸條堆肥施用量為 23.2 t/hm2，連同磷酸二銨450 kg/hm2和復(fù)混肥(N∶P∶K=20∶20∶20) 450 kg/hm2，在黃瓜移栽前一次性配合耕作作底肥施用。黃瓜采用高畦栽培，雙行種植，株距33 cm，行距70 cm。為防止處理間水分橫向運(yùn)移，小區(qū)之間用泡沫板進(jìn)行隔離，泡沫板埋入深度為80 cm。每個小區(qū)面積9 m2，每個處理3次重復(fù)隨機(jī)排列，進(jìn)行統(tǒng)一追肥和灌水。

1.2 土壤樣品的采集與分析

在第4個栽培茬的盛果期(定植后2.5個月)，采用5點(diǎn)取樣法在每個處理每個重復(fù)的栽培畦中部(避開溫室最北部和最南部)取0—20 cm土層樣品。采用四分法將混合的土壤裝入自封袋后用冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室，新鮮土壤中剔除石子等雜物后，土壤過2 mm篩后，保存于–80℃冰箱中，用于土壤微生物群落多樣性分析。另一部分土壤風(fēng)干磨碎過1 mm篩后用于土壤養(yǎng)分含量的測定。

1.2.1 土壤養(yǎng)分 土壤pH采用電位計法(上海雷磁，PHS-3E)，EC值采用電導(dǎo)法(上海雷磁，DDS-307)，有機(jī)質(zhì)含量采用重鉻酸鉀—硫酸氧化法；全氮含量采用H2SO4消化—半微量凱氏定氮法；速效氮含量采用K2SO4浸提—流動分析儀進(jìn)行測定[8]。

1.2.2 微生物群落多樣性 采用Biolog-ECO技術(shù)，稱取相當(dāng)于10 g烘干土于250 mL錐形瓶中，加入 90 mL 滅菌去離子水，震蕩 1 h (200 r/min，4℃)，靜置30 min后，取上清液用滅菌去離子水稀釋1000倍，吸取 150 μL加至 Biolog-ECO 板的微孔中，25℃下暗室培養(yǎng)，每24 h在590 nm下測定吸光值，以每孔平均顏色變化率 (average well color development，AWCD) 作為微生物活性的有效指數(shù)，其公式為：

式中，C為微平板含有31種碳源每孔讀數(shù)，R表示對照微孔讀數(shù)，n表示96孔板中碳源底物的種類。

1.2.3 土壤微生物DNA的提取及測序 微生物宏基因組測序由上海派森諾生物科技有限公司完成。土壤樣品微生物總DNA利用快速提取試劑盒 (MP Biomedicals, Santa Ana, CA, USA)提取。利用 1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組 DNA 質(zhì)量，用超微量分光光度計 (NanoDrop 1000，USA) 測定提取的DNA 濃度。采用通用的正向引物 338F (5′-ACTCC TACGGGAGGCAGCA-3′) 和反向引物 806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′) 對細(xì)菌 16S rRNA基因V3～V4區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增程序如下：初始變性 2 min (98℃)，變性 30 s (95℃)，退火 30 s (55℃)，延伸 45 s (72℃)，進(jìn)行 27 個循環(huán)，然后穩(wěn)定延伸 10 min (72℃)。用 2% 瓊脂糖凝膠電泳對 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測。對擴(kuò)增產(chǎn)物切膠回收，用 QuantiFluorTM 熒光計進(jìn)行定量。將純化的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行等量混合，連接測序接頭，合格后采用Illumina Miseq 平臺 (Illumina, Inc., San Diego, CA,USA) 對DNA片段進(jìn)行雙端(Paired-end)測序。利用Vsearch軟件對所有樣品序列進(jìn)行去引物片段，在98%相似度水平對去重后的序列聚類后輸出分類操作單元 (operational taxonomic units，OTUs)，使用QIIME2在Greengenes數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對得到 OTUs 的分類學(xué)信息，得出物種對應(yīng)的基因豐度和分類學(xué)水平上各樣品中物種的豐度，從而構(gòu)建相應(yīng)分類學(xué)水平上的豐度譜，并計算Chao1豐富度估計量、Shannon多樣性指數(shù)和Simpson指數(shù)及Pielou’s 指數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

使用 SPSS 24 軟件，進(jìn)行單因素 ANOVA 分析；用Origin 2018制作相關(guān)圖表。利用qiime2云平臺 (https://view.qiime2.org/)進(jìn)行 α 多樣性分析 (包括Chao1、Shhanno、Simpson 等指數(shù))，使用 R 軟件對環(huán)境因子、細(xì)菌群落和功能、微生物碳代謝功能指標(biāo)進(jìn)行冗余分析 (RDA分析)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對黃瓜產(chǎn)量的影響

4個檸條堆肥處理的黃瓜產(chǎn)量與CK無顯著差異，黃瓜產(chǎn)量隨耕作深度增加而下降，免耕和淺耕處理(T0和T15)的黃瓜產(chǎn)量顯著高于深翻(T45)處理(圖1)。

圖1 不同處理的黃瓜產(chǎn)量Fig. 1 Cucumber yield of different treatments

2.2 不同處理對土壤理化性質(zhì)的影響

施肥和耕作深度的改變影響了土壤pH、EC值、碳氮比和速效氮含量(圖2)。檸條堆肥處理中土壤pH隨耕作深度增加而上升，T0、T15和CK處理差異不顯著；T0、T15和T35處理土壤EC值和速效氮含量顯著高于CK，而T45處理速效氮含量顯著低于CK處理。與CK相比，檸條堆肥配合免耕和淺耕顯著降低了土壤碳氮比，而T35和T45處理的碳氮比保持穩(wěn)定。

圖2 不同處理下土壤pH、EC、碳氮比和速效氮含量Fig. 2 Soil pH, EC, C/N ratio and available nitrogen content under different treatments

2.3 不同處理對土壤細(xì)菌群落多樣性的影響

各處理 Good’s coverage 指數(shù)均大于 0.96，表明本研究測序深度滿足分析要求(表1)，檸條堆肥各處理的 Good’s coverage 指數(shù)均高于 CK。細(xì)菌群落豐富度、多樣性和均勻度指數(shù)均隨耕作深度增加呈先上升后降低的趨勢，T35處理最高。除T0外，其他處理 Shannon、Simpson 和 Pielou’s 指數(shù)均高于 CK，且深翻處理均顯著高于T0 (P<0.05)，說明檸條堆肥施用和深翻處理均有利于農(nóng)田微生物群落多樣性發(fā)展。

表1 不同處理土壤細(xì)菌群落豐富度、多樣性和均勻度指數(shù)Table 1 Soil bacteria species richness, diversity, and evenness index under different treatments

放線菌門(Actinobacteria，40.77%)、變形菌門(Proteobacteria，26.26%)、綠彎菌門 (Chloroflexi，10.50%)相對豐度大于10%，為各處理中土壤優(yōu)勢菌門。放線菌門(Actinobacteria)的相對豐度隨耕作深度的增加顯著下降，而變形菌門(Proteobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、酸桿菌門(Acidobacteria)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)的相對豐度與放線菌門相反，T35處理的酸桿菌門(Acidobacteria)、桿菌屬菌門(Patescibacteria)、Rokubacteria門相對豐度最高；T15較CK顯著提升了變形菌門(Proteobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、Deinococcus-Thermus門、桿菌屬菌門(Patescibacteria)的相對豐度度；T0處理土壤放線菌門(Actinobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)和Deinococcus-Thermus門的豐度顯著高于T15處理(分別提高26.38%、295.83%和52.29%，圖3a)。

圖3 不同處理土壤樣品細(xì)菌在門(a)、屬(b)水平上的物種分布組成Fig. 3 Composition of bacteria at the phylum (a) and genus (b) levels in the soil under different treatments

5個處理土壤中諾卡氏菌屬(Nocardioides)和暈輪放線菌屬(Haloactinopolyspora)占主導(dǎo)地位。T0和T45處理較CK顯著降低了諾卡氏菌屬(Nocardioides)的相對豐度，其他處理與CK無顯著差異；T0、T15、T35和T45處理較CK提高了暈輪放線菌屬(Haloactinopolyspora)和特呂珀菌屬(Truepera)的相對豐度，但顯著降低了鹽單胞菌(Halomonas)和新疆鹽坑微菌(Salinimicrobium)的相對豐度。

由圖4所示，在UPGMA聚類樹上，施用檸條堆肥的4個處理(T0、T15、T35與T45)為一個大類，施用雞糞的處理(CK)為另一個大類，表明有機(jī)肥種類是造成土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異的主要因素；檸條堆肥處理中，免耕(T0)與其他3個耕作處理土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分屬不同亞類，耕作制度也是影響細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的重要因素；翻耕深度的增加改變了菌群結(jié)構(gòu)，T45和T35處理分為一個小類，表明細(xì)菌群落關(guān)系最相近，其次與T15處理為一個亞類，三者細(xì)菌群落較為相近；從聚類分析圖中發(fā)現(xiàn)，不同處理菌群與CK的距離隨著耕作深度的增加而增加，說明施肥類型和耕作深度交互作用造成細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異的增加。

圖4 不同處理UPGMA聚類分析圖Fig. 4 Graphics of UPGMA clustering analysis in different treatments

2.4 不同處理對微生物功能多樣性的影響

圖5顯示了細(xì)菌豐度前19位的KEGG基因代謝通路條目。這19條代謝通路按照功能可劃分為代謝、遺傳信息處理、環(huán)境信息處理和細(xì)胞進(jìn)程4大類。代謝功能與土壤物質(zhì)循環(huán)密切相關(guān)，其中氨基酸代謝、輔助因子和維生素代謝、萜類和聚酮化合物代謝、其他氨基酸代謝、類脂化合物代謝相關(guān)的微生物相對豐度大小順序均為T35>T45>T15>T0>CK。

圖5 不同處理土壤細(xì)菌代謝通路Fig. 5 Bacterial metabolic pathways in the soil under different treatments

細(xì)菌碳代謝功能對土壤物質(zhì)循環(huán)和作物生長至關(guān)重要，細(xì)菌群落對6大碳源的利用程度如圖6所示。6大碳源中，土壤微生物對多聚物利用程度最高，對羧酸類化合物利用程度次之，對碳水化合物的利用程度最低。雖然不同碳源的利用程度受耕作深度的影響不同，檸條堆肥各處理對6種碳源的利用總的看來均顯著高于雞糞處理(CK)。免耕處理(T0)對氨基酸、胺類化合物和芳香類化合物的利用率均高于翻耕處理，而翻耕處理對羧酸類化合物和多聚物的利用程度高于免耕。

圖6 不同處理下6大碳源的利用情況Fig. 6 The utilization of six carbon sources under different treatments

2.5 環(huán)境因子、細(xì)菌群落和功能、微生物碳代謝的冗余分析

施肥和耕作主要通過改變環(huán)境因子影響土壤微生物。環(huán)境因子、細(xì)菌群落、細(xì)菌功能和微生物碳代謝間的冗余分析(RDA分析)結(jié)果(圖7)顯示，pH、EC和速效氮對細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和微生物群落碳代謝功能影響顯著(P<0.01)，豐度排在前9名的細(xì)菌也與土壤碳代謝緊密相關(guān)，前兩軸解釋的環(huán)境因子、細(xì)菌群落、細(xì)菌功能和微生物碳代謝總變異分別為58.24%、58.266%、43.671%和80.76%。綠彎菌門、酸桿菌門、芽單胞桿菌門、羧酸類化合物代謝和萜類化合物和聚酮化合物代謝與土壤pH呈顯著正相關(guān)，酸桿菌門、芽單胞桿菌門、其他氨基酸代謝、異生物素生物降解和代謝和能量代謝與土壤碳氮比呈正相關(guān)，EC值和速效氮含量有利于厚壁菌門豐度和氨基酸代謝的提升，綠彎菌門和芽單胞桿菌門與羧酸類化合物代謝呈顯著正相關(guān)，厚壁菌門和放線菌門與胺類化合物和芳香類化合物呈顯著正相關(guān)。

圖7 環(huán)境因子(a)、細(xì)菌群落組成(b)、細(xì)菌功能(c)及微生物碳代謝(d)之間的冗余分析Fig. 7 Redundancy analysis among environmental factors, bacterial community composition, bacterial function,and microbial carbon metabolism

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)與傳統(tǒng)雞糞相比，檸條堆肥的施用并未顯著降低黃瓜產(chǎn)量。糞肥的長期施用會造成土壤酸化，從而影響土壤養(yǎng)分循環(huán)及作物生長[9]。本研究發(fā)現(xiàn)檸條堆肥連續(xù)施用較傳統(tǒng)雞糞提高了土壤pH，這是因?yàn)闄帡l堆肥施用后向土壤中輸入了更多中堿性物質(zhì)，提升了土壤的緩沖能力[10]。同時，結(jié)合深翻可調(diào)節(jié)土壤耕層結(jié)構(gòu)和土壤碳氮比，降低氮循環(huán)效應(yīng)，從而促進(jìn)有機(jī)肥分解消耗質(zhì)子來抑制土壤酸化[11–12]。耕作深度增加降低了速效氮的含量，可減少表層土壤養(yǎng)分的聚集，降低土壤次生鹽漬化的風(fēng)險。

微生物群落多樣性是表征農(nóng)田土壤微生物群落功能的發(fā)揮和土壤特征及功能的重要指標(biāo)[13]。本研究發(fā)現(xiàn)在相同翻耕深度下檸條堆肥施用較傳統(tǒng)雞糞提高了土壤細(xì)菌群落的多樣性，說明檸條堆肥含有更豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)了土壤微生物的生長。路穎等[14]研究也發(fā)現(xiàn)，性質(zhì)、質(zhì)量和分解速率差異的不同類型有機(jī)物輸入到土壤中，會對土壤微生物群落多樣性產(chǎn)生顯著影響。有研究表明耕作方式也是影響微生物多樣性的重要因素[15]。本研究發(fā)現(xiàn)檸條堆肥各處理中，耕作處理(T15、T35和T45)較免耕處理(T0)均提高了土壤細(xì)菌豐富度、多樣性和均勻度指數(shù)，T35處理最高。

本研究發(fā)現(xiàn)各處理樣品中放線菌門、變形菌門、綠彎菌門為土壤細(xì)菌群落的優(yōu)勢菌門，這與賈遠(yuǎn)航等[16]研究的結(jié)果一致，這說明不同土壤的微生物群落存在很多共性和一定的環(huán)境適應(yīng)性。盡管如此，施肥和耕作對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)組成造成了一定的影響，肥料類型為主導(dǎo)因素。本研究中，放線菌門的相對豐度最大，被視為土壤碳氮循環(huán)主要功能細(xì)菌[17]。有研究表明，放線菌門的相對豐度與土壤團(tuán)粒結(jié)構(gòu)的大小呈負(fù)相關(guān)[18]。相同耕作深度下，檸條堆肥處理放線菌門的相對豐度低于雞糞處理，這可能與土壤結(jié)構(gòu)的變化有關(guān)。檸條堆肥為土壤微生物的物質(zhì)循環(huán)提供了原料、能源和良好的生存環(huán)境，產(chǎn)生的有機(jī)無機(jī)膠結(jié)物質(zhì)促進(jìn)了團(tuán)粒結(jié)構(gòu)的形成，從而降低了放線菌門的相對豐度。同時，在檸條堆肥各處理中，免耕處理(T0)放線菌門、厚壁菌門的相對豐度高于耕作處理(T15、T35和T45)，這可能是放線菌門和厚壁菌門作為富營養(yǎng)菌在有機(jī)營養(yǎng)輸入條件下更多地依賴于不穩(wěn)定的碳源[19]，免耕處理為放線菌門和厚壁菌門提供了更為充足的營養(yǎng)，其他菌群受外源輸入養(yǎng)分影響較小。耕作深度的增加改善了土壤耕層結(jié)構(gòu)，促進(jìn)了變形菌門、綠彎菌門、酸桿菌門和芽單胞桿菌門的相對豐度的提升。

本研究對細(xì)菌功能預(yù)測發(fā)現(xiàn)，代謝為細(xì)菌群落的主要功能，檸條堆肥各處理主要代謝通路基因豐度均高于CK，T35處理對氨基酸、碳水化合物等物質(zhì)的合成促進(jìn)效果最好。細(xì)菌碳代謝功能對土壤物質(zhì)循環(huán)和作物生長至關(guān)重要[20]。本研究中檸條堆肥各處理碳源利用程度均高于CK，這可能是檸條堆肥作為豆科植物殘茬堆肥富含有機(jī)質(zhì)，為微生物的生長提供了充足的有效碳源。耕作深度也顯著影響了碳源的利用，微生物對氨基酸、胺類化合物、碳水化合物和芳香類化合物的利用程度隨著耕作深度的增加而降低，而深翻處理提高了羧酸類化合物和多聚物的利用。

施肥和耕作分別通過直接和間接方式影響微生物群落[21]；一方面可以直接為微生物創(chuàng)造適宜的生存環(huán)境，另一方面通過調(diào)控環(huán)境因子改變微生物群落。有研究表明，不同處理間細(xì)菌群落組成差異主要取決于土壤性質(zhì)[22]。本研究發(fā)現(xiàn)土壤pH、EC和速效氮含量對土壤細(xì)菌群落組成、功能和碳源利用均有顯著的影響，其中pH是影響土壤群落結(jié)構(gòu)的主要驅(qū)動因子[23–24]。綠彎菌門、酸桿菌門、芽單胞桿菌門與土壤pH呈顯著正相關(guān)，檸條堆肥施用和耕作深度增加通過提高土壤pH來促進(jìn)這些菌群豐度的增加。細(xì)菌群落的變化和生物功能緊密相關(guān)[25–26]。本研究發(fā)現(xiàn)，前9豐度的細(xì)菌顯著影響了土壤碳代謝，綠彎菌門和芽單胞桿菌門與羧酸類化合物代謝呈顯著正相關(guān)，厚壁菌門和放線菌門與胺類化合物和芳香類化合物呈顯著正相關(guān)。變形菌門和厚壁菌門作為富營養(yǎng)菌，可能會受到EC和速效氮等養(yǎng)分指標(biāo)的調(diào)控，從而影響相關(guān)功能的表達(dá)，此外，EC值過高對大多數(shù)菌群結(jié)構(gòu)和功能發(fā)揮呈負(fù)向影響。

4 結(jié)論

檸條堆肥對黃瓜的增產(chǎn)效果與雞糞沒有顯著差異。檸條堆肥配合免耕可提升土壤EC值和速效氮含量，配合深翻(35 cm、45 cm)可顯著提高土壤碳氮比和土壤細(xì)菌群落多樣性。放線菌門、變形菌門、綠彎菌門為土壤細(xì)菌群落的優(yōu)勢菌門，檸條堆肥能提高土壤優(yōu)勢菌門相對豐度，T35和T45能夠顯著提高變形菌門和綠彎菌門相對豐度。同時，檸條堆肥各處理也有效提高了主要代謝通路相對豐度，有利于菌群功能發(fā)揮；相對雞糞，檸條堆肥有助于細(xì)菌碳代謝能力的提升，結(jié)合深翻進(jìn)一步提高了對羧酸類化合物和多聚物的利用。RDA分析表明，環(huán)境因子、細(xì)菌群落和菌群功能間主要處在共生關(guān)系，pH是影響土壤群落結(jié)構(gòu)的主要驅(qū)動因子，可通過檸條堆肥和適當(dāng)深翻(T35)來維持良好土壤環(huán)境，作為調(diào)節(jié)土壤微生物群落、維持農(nóng)田生態(tài)可持續(xù)發(fā)展的重要方式；同時，可通過優(yōu)化有機(jī)肥使用量及有機(jī)無機(jī)配比研究進(jìn)一步提高產(chǎn)量。