采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化姜黃素納米混懸溫敏性水凝膠的處方和制備工藝

李佳佳, 寧偎鋒, 李 磊

(沈陽(yáng)化工大學(xué) 制藥與生物工程學(xué)院, 遼寧 沈陽(yáng) 110142)

姜黃素[1-2][1,7-雙-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-1,6-庚二烯-3,5二酮]是從姜黃中提取的多酚化合物,具有抗氧化功能,被研究發(fā)現(xiàn)具有保護(hù)肝臟作用[3-4]、抗癌作用[5-6]、以及對(duì)神經(jīng)退行性疾病和炎癥性疾病的治療作用[7].相關(guān)文獻(xiàn)曾報(bào)道用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01%～0.25%姜黃素補(bǔ)充嚙齒動(dòng)物飲食,其通過(guò)抑制NF-κB、STAT3和MCP-1的過(guò)表達(dá)來(lái)保護(hù)微血管免受缺血再灌注損傷,進(jìn)而達(dá)到治療青光眼的目的[8].但姜黃素的水溶性差、生物利用度低,限制了其在臨床中的應(yīng)用.對(duì)于眼科疾病的治療,大多數(shù)藥物由于淚液稀釋或者滴眼劑的流出并不能達(dá)到很好的療效.局部給藥是優(yōu)選的給藥途徑,能減少全身吸收的副作用,可加快藥物代謝和清除[9-11].本研究制得的空白凝膠基質(zhì),在常溫下為液態(tài),給藥后立即在用藥部位轉(zhuǎn)化為半固態(tài)的凝膠,并結(jié)合姜黃素納米混懸液制得一種姜黃素納米混懸溫敏性水凝膠,為姜黃素在眼科方面的應(yīng)用提供了一種思路.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

姜黃素 (天津市天新精細(xì)化工開(kāi)發(fā)中心)、泊洛沙姆188 (P188,上海思域化工科技有限公司)、泊洛沙姆407 (P407,浙江瑪雅試劑有限公司)、羧甲基殼聚糖(CMC,山東西亞化學(xué)科技有限公司)、戊二醛(GA,天津博迪化工股份有限公司)、去離子水(浙江杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司),均為分析純.

AR1530精密電子天平,美國(guó)奧豪斯公司;DZF-6020型真空干燥箱,上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;RC-6型溶出度測(cè)試儀,天津市國(guó)銘醫(yī)藥設(shè)備有限公司;冰箱,山東澳柯瑪股份有限公司;數(shù)控超聲波清洗儀,上海必能信超聲波有限公司;透析袋,南京森貝伽生物科技有限公司;恒溫加熱磁力攪拌器,鞏義予華儀器有限責(zé)任公司.

1.2 姜黃素納米混懸溫敏性水凝膠的制備

采用反溶劑法制備姜黃素納米混懸液[12-14].取處方量的姜黃素溶于乙醇配置姜黃素乙醇溶液.按ω(乙烯醇)∶ω(姜黃素)=1.5∶1配置聚乙烯醇溶液.在350 r/min轉(zhuǎn)速下,將姜黃素乙醇溶液注入聚乙烯醇溶液中,持續(xù)攪拌5 min,制得姜黃素納米混懸液,暫存于4 ℃冰箱中.

采用攪拌子法制備空白凝膠基質(zhì).將一定量P407、P188和CMC溶于去離子水,放入55 ℃恒溫加熱磁力攪拌器中,向其中滴加一滴戊二醛,繼續(xù)攪拌半小時(shí).反應(yīng)停止后在室溫下冷卻24 h,使用預(yù)先浸泡的纖維素膜(8000～14 000Mw.t)透析24 h,得到空白凝膠基質(zhì)(如圖1所示).

將姜黃素納米混懸液從冰箱中取出,在高速磁力攪拌下緩慢加入空白凝膠基質(zhì),持續(xù)攪拌使其分散均勻,放入4 ℃冰箱冷卻24 h以上,直至溶液澄清透明,得姜黃素納米混懸溫敏性水凝膠.

圖1 空白凝膠基質(zhì)的制備流程

1.3 星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化設(shè)計(jì)

從4 ℃冰箱中取出空白凝膠基質(zhì),用模擬淚液稀釋,輕搖振蕩,放置至無(wú)氣泡.測(cè)出淚液稀釋前后的膠凝溫度,t1為模擬淚液稀釋前的相變溫度,t2為模擬淚液稀釋后的相變溫度.

根據(jù)星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法,采用Design-expert 8軟件,將單因素實(shí)驗(yàn)確定的P407與P188質(zhì)量分?jǐn)?shù)比、CMC體積分?jǐn)?shù)、GA體積分?jǐn)?shù)設(shè)置為自變量,t1、t2為響應(yīng)指標(biāo),對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行多項(xiàng)回歸、擬合方程、方差分析和失擬檢驗(yàn),生成二維高線圖和三維響應(yīng)面圖.根據(jù)t1≥ 25 ℃和t2≤ 33 ℃,優(yōu)化出兩種最適制備處方,并對(duì)其預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值進(jìn)行偏差分析.

1.4 結(jié)構(gòu)表征

采用日本電子株式會(huì)社GSM-6701F型掃描電鏡(SEM)對(duì)姜黃素納米混懸溫敏性水凝膠進(jìn)行形態(tài)測(cè)試,取真空干燥粉碎后的姜黃素納米混懸溫敏性水凝膠,在其表面噴金,在20 kV加速電壓下觀察其表面形態(tài);采用日本理學(xué)RigkuD/max-1200型X射線衍射儀(XRD)對(duì)姜黃素納米混懸溫敏性水凝膠進(jìn)行測(cè)試,掃描速度為1.2 (°)/min,掃描范圍為5°～50°;采用天津港東FTIR-650型傅里葉變換紅外光譜儀(FT-IR)對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)試,掃描范圍為400 ～4000 cm-1;采用上海菁華科技儀器有限公司752型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(UV-Vis)測(cè)定樣品的吸光度.

1.5 性能測(cè)試

1.5.1 包封率和載藥量測(cè)定

1.5.2 溶脹率測(cè)定

1.5.3 姜黃素體外釋放率測(cè)定

稱(chēng)取適量的姜黃素納米混懸溫敏性水凝膠、姜黃素納米混懸液(含姜黃素5 mg)和5 mg姜黃素,分別放入透析袋中,將其置于100 mL模擬淚液中,然后全部放置于33 ℃恒溫水浴槽中.從釋放開(kāi)始至第30、60、100、150、200、250、300及350 min時(shí)各取5 mL淚液,離心取1 mL上清液,用乙醇稀釋至10 mL,測(cè)定其在427 nm處的吸光度.再補(bǔ)充5 mL相同模擬淚液至體系中,保持總體積不變.根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算不同釋放時(shí)間藥物溶出百分率,并對(duì)時(shí)間作圖,繪制溶出曲線.載藥水凝膠釋藥率計(jì)算公式為:釋藥率 =(釋藥質(zhì)量/載藥質(zhì)量)×100%.

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 泊洛沙姆比例對(duì)膠凝溫度的影響

經(jīng)過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn),篩選出以P407與P188質(zhì)量分?jǐn)?shù)比為3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1制得空白凝膠基質(zhì).其他實(shí)驗(yàn)參數(shù)為:戊二醛體積分?jǐn)?shù)為2%、反應(yīng)溫度為55 ℃、攪拌速度為10 r/s、CMC體積分?jǐn)?shù)為15%.圖2(a)是P407與P188質(zhì)量分?jǐn)?shù)比對(duì)臨界相變溫度的影響曲線.由圖2(a)可知P407與P188質(zhì)量分?jǐn)?shù)比對(duì)臨界相變溫度影響較大.因此,初步選定P407與P188質(zhì)量分?jǐn)?shù)比為3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1來(lái)進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化.

2.1.2 姜黃素質(zhì)量濃度對(duì)膠凝溫度的影響

以P407與P188質(zhì)量分?jǐn)?shù)比為6∶1(即P407質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18%,P188質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%)、CMC體積分?jǐn)?shù)為15%、GA體積分?jǐn)?shù)為2%、反應(yīng)溫度為55 ℃、攪拌速度為10 r/s制得空白凝膠基質(zhì).將空白凝膠基質(zhì)與質(zhì)量濃度為5 g/L、10 g/L、15 g/L、20 g/L的姜黃素乙醇溶液混合制得姜黃素納米混懸溫敏性水凝膠.圖2(b)是姜黃素質(zhì)量濃度對(duì)臨界相變溫度的影響曲線.由圖2(b)可知姜黃素的質(zhì)量濃度對(duì)膠凝狀態(tài)未見(jiàn)顯著影響.

2.1.3 戊二醛體積分?jǐn)?shù)對(duì)膠凝溫度的影響

選定P407與P188質(zhì)量分?jǐn)?shù)比為6∶1、攪拌速度為10 r/s、反應(yīng)溫度為55 ℃,分別加入體積分?jǐn)?shù)為1%、2%、3%、4%、5%的戊二醛制備空白凝膠基質(zhì).圖2(c)為戊二醛體積分?jǐn)?shù)對(duì)臨界相變溫度的影響曲線.由圖2(c)可知:隨著戊二醛體積分?jǐn)?shù)的增大,臨界相變溫度逐漸降低;當(dāng)戊二醛體積分?jǐn)?shù)為3%時(shí),膠凝時(shí)間最適宜;當(dāng)戊二醛體積分?jǐn)?shù)過(guò)大,反應(yīng)液會(huì)直接凝固并喪失溫敏特性.

2.1.4 CMC體積分?jǐn)?shù)對(duì)膠凝溫度的影響

選定質(zhì)量分?jǐn)?shù)比為6∶1的P407和P188,向其中加入體積分?jǐn)?shù)為10%、12%、14%、16%、18%、20%的CMC,在55 ℃時(shí),轉(zhuǎn)速為10 r/s,加入體積分?jǐn)?shù)為3%的戊二醛制備空白凝膠基質(zhì).使用分度值為0.1的溫度計(jì)測(cè)其臨界相變溫度.圖2(d)是CMC體積分?jǐn)?shù)對(duì)臨界相變溫度的影響曲線.由圖2(d)可知膠凝的相變溫度隨CMC的體積分?jǐn)?shù)增加而降低.

2.1.5 反應(yīng)溫度對(duì)膠凝溫度的影響

選定質(zhì)量分?jǐn)?shù)比為6∶1的P407和P188,轉(zhuǎn)速為10 r/s,分別在反應(yīng)溫度為40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65℃時(shí),向反應(yīng)液中滴加體積分?jǐn)?shù)為2%的戊二醛,測(cè)定制得的空白凝膠基質(zhì)的臨界相變溫度.圖2(e)是反應(yīng)溫度對(duì)臨界相變溫度的影響曲線.由圖2(e)可知反應(yīng)溫度對(duì)臨界相變溫度并未產(chǎn)生顯著影響.

圖2 單因素對(duì)膠凝狀態(tài)的影響

綜合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)姜黃素質(zhì)量濃度和反應(yīng)溫度對(duì)臨界相變溫度的影響較小,即對(duì)膠凝狀態(tài)影響較小;而P407與P188的質(zhì)量分?jǐn)?shù)比、CMC的體積分?jǐn)?shù)和GA的體積分?jǐn)?shù)對(duì)膠凝狀態(tài)影響較顯著,需要進(jìn)一步進(jìn)行處方工藝優(yōu)化.

2.2 星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化分析

根據(jù)表1中的星點(diǎn)設(shè)計(jì)因素和水平進(jìn)行姜黃素納米混懸溫敏性水凝膠的制備工藝優(yōu)化. Design-expert 8軟件生成的多元線性回歸及二項(xiàng)式擬合方程為:

t1=27.61-27A-1.55B-0.098C+1.19AB+0.13AC+0.32BC+0.86A1+1.05B1+0.56C1(R2=0.8732),

t2=31.17-2.65A-1.30B+0.076C-0.056AB-0.28AC+0.52BC+1.22A1+0.93B1+0.97C1(R2=0.9356).

其中:A為P407與P188的質(zhì)量分?jǐn)?shù)比;B為CMC的體積分?jǐn)?shù);C為GA的體積分?jǐn)?shù).可見(jiàn)擬合度較好.響應(yīng)面模擬結(jié)果方差分析t1和t2的P<0.000 1.失擬項(xiàng)檢驗(yàn)結(jié)果表明t2的結(jié)果也好于t1.

表2為星點(diǎn)設(shè)計(jì)及效應(yīng)值,圖3和圖4分別為P407與P188質(zhì)量分?jǐn)?shù)比、CMC體積分?jǐn)?shù)、GA體積分?jǐn)?shù)對(duì)t1和t2三維響應(yīng)面圖.由表2、圖3和圖4可知:P407與P188的質(zhì)量分?jǐn)?shù)百分比和CMC的體積分?jǐn)?shù)對(duì)臨界相變溫度影響較大;當(dāng)P407與P188質(zhì)量分?jǐn)?shù)比和CMC體積分?jǐn)?shù)取值較小時(shí),圖形平面性較明顯,反應(yīng)了取值較為恰當(dāng).

表1 星點(diǎn)設(shè)計(jì)因素和水平

表2 星點(diǎn)設(shè)計(jì)及效應(yīng)值

圖3 P407與P188質(zhì)量分?jǐn)?shù)比、CMC體積分?jǐn)?shù)和GA體積分?jǐn)?shù)對(duì)t1三維響應(yīng)面圖

由Design-expert 8軟件進(jìn)行優(yōu)化,再結(jié)合二維等高線和三維響應(yīng)面,選取了兩個(gè)優(yōu)化處方來(lái)制備此劑型,如表3所示.優(yōu)化處方1∶P407與P188的質(zhì)量分?jǐn)?shù)比為7∶1,CMC體積分?jǐn)?shù)為13.90%,GA體積分?jǐn)?shù)為2%.優(yōu)化處方2:P407與P188的質(zhì)量分?jǐn)?shù)比為5∶1,CMC體積分?jǐn)?shù)為14.5%,GA體積分?jǐn)?shù)3%.由表3中優(yōu)化處方1和優(yōu)化處方2的預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值偏差分析結(jié)果可知兩處方偏差值均在±1%以?xún)?nèi),符合眼部用藥要求,即t1≥ 25 ℃、t2≤ 33 ℃.

圖4 P407與P188質(zhì)量分?jǐn)?shù)比、CMC體積分?jǐn)?shù)和GA體積分?jǐn)?shù)對(duì)t2三維響應(yīng)面圖

表3 姜黃素納米混懸溫敏性水凝膠優(yōu)選處方

2.3 凝膠載藥性能分析

對(duì)凝膠載藥性能的研究是判斷此劑型功能的重要標(biāo)準(zhǔn)之一.表4是兩個(gè)優(yōu)化處方制得的凝膠包封率和載藥量比較,圖5是兩個(gè)優(yōu)化處方制得的凝膠溶脹率比較.由表4可知:與優(yōu)化處方1相比,處方2的包封率和載藥量性能較好.由圖5可知:隨著P407與P188質(zhì)量分?jǐn)?shù)比增大,以及戊二醛體積分?jǐn)?shù)減少,包封率和載藥量越高,溶脹率越大.這可能與凝膠的三維孔洞有關(guān),孔徑越疏松,孔隙越多,藥物更容易擴(kuò)散,短時(shí)間內(nèi)即可達(dá)到載藥平衡.

表4 兩個(gè)優(yōu)化處方制得的凝膠包封率和載藥量比較

圖5 兩個(gè)優(yōu)化處方制得的凝膠溶脹率曲線

2.4 SEM分析

圖6為姜黃素納米混懸液和姜黃素納米混懸溫敏性水凝膠的SEM照片(×60 000).

圖6 樣品SEM圖

由圖6可知:姜黃素納米混懸液中粒子均呈球狀,分布較均勻,且制備成姜黃素納米混懸溫敏性水凝膠對(duì)納米粒子形態(tài)無(wú)影響.

2.5 FT-IR分析

圖7是羧甲基殼聚糖、泊洛沙姆和空白凝膠基質(zhì)的紅外測(cè)試曲線.由圖7可知:羧甲基殼聚糖在 3200～3600 cm-1顯示出非常強(qiáng)大的峰,這可能是—OH的拉伸振動(dòng)和—NH的振動(dòng)導(dǎo)致的.但是,在空白凝膠基質(zhì)紅外曲線中,此峰發(fā)生了變化,這可能與—NH2消失有關(guān).1617 cm-1處左右的峰可能是由于—NH2的變形振動(dòng)以及與—COO—基團(tuán)的不對(duì)稱(chēng)拉伸振動(dòng)重疊而產(chǎn)生的強(qiáng)峰,但產(chǎn)物中并未出現(xiàn)此峰.泊洛沙姆紅外曲線中可能由于—CH拉伸、—CH2彎曲、面內(nèi)—OH彎曲和—CO拉伸,分別在2889.73、1467.29、1343.46 cm-1處出現(xiàn)了特征峰,這些峰在空白凝膠基質(zhì)中表現(xiàn)不明顯或者消失不見(jiàn).以上結(jié)果表明空白凝膠基質(zhì)已成功合成.

圖7 羧甲基殼聚糖、泊洛沙姆和空白凝膠基質(zhì)的紅外曲線

2.6 XRD分析

圖8為羧甲基殼聚糖、泊洛沙姆、泊洛沙姆與CMC物理混合物和空白凝膠基質(zhì)的XRD曲線.由圖8可知:泊洛沙姆特征峰在20.03°和24.43°,羧甲基殼聚糖特征峰在21.30°.在泊洛沙姆與CMC物理混合物中,盡管峰很低,但也表現(xiàn)出兩者峰的特征.所制得的空白凝膠基質(zhì)XRD曲線中沒(méi)有峰存在.

圖8 XRD曲線

2.7 體外釋放率

圖9是姜黃素、姜黃素納米混懸液和姜黃素納米混懸溫敏性水凝膠隨時(shí)間變化的體外釋放率曲線.

圖9 姜黃素、姜黃素納米混懸液和姜黃素納米混懸溫敏性水凝膠的體外釋放率曲線

由圖9可知:姜黃素在淚液中的釋放非常緩慢,在200 min時(shí),依據(jù)處方2制備的姜黃素納米混懸溫敏性水凝膠的累積釋放率為13.2%,姜黃素納米混懸液的累積釋放率為17%.與姜黃素納米混懸劑相比,姜黃素納米混懸溫敏性水凝膠可以達(dá)到緩釋效果,且藥物釋放有明顯的時(shí)滯現(xiàn)象.在釋放初期,處方2的藥物的釋放率出現(xiàn)突釋現(xiàn)象,這可能是大量的姜黃素吸附在水凝膠表面而不是包埋在凝膠的孔狀結(jié)構(gòu)中,藥物未達(dá)到孔徑的飽和程度所導(dǎo)致的.

3 結(jié) 論

本文制備了一種溫敏性的姜黃素納米水凝膠劑,并進(jìn)行了體外性能測(cè)試,期望進(jìn)一步拓展姜黃素在臨床中的用途.首先,采用反溶劑法制得姜黃素納米混懸劑,并將其載入以P407、P188與CMC交聯(lián)所得的空白凝膠基質(zhì)中,制備出姜黃素納米混懸溫敏性水凝膠,并進(jìn)行掃描電鏡、紅外光譜以及X射線衍射表征;然后,采用單因素法發(fā)現(xiàn)P407與P188的質(zhì)量分?jǐn)?shù)比值、GA體積分?jǐn)?shù)以及CMC體積分?jǐn)?shù)對(duì)此劑型的制備有顯著影響;最后,對(duì)這3種影響因素進(jìn)行星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化并進(jìn)行體外釋放性能的比較.結(jié)果顯示:P407與P188的質(zhì)量分?jǐn)?shù)比為5∶1、CMC體積分?jǐn)?shù)為14.5%、GA體積分?jǐn)?shù)為3%時(shí),姜黃素納米混懸溫敏性水凝膠具有緩釋作用.本研究為該制劑的后續(xù)體內(nèi)外研究奠定一定的基礎(chǔ),為姜黃素在眼科的臨床應(yīng)用提供了新思路.