超臨界CO2 參與下煤儲層原位微生物甲烷化物理模擬研究

蘇現(xiàn)波，汪露飛，趙偉仲，夏大平，周藝璇，王 乾

(1.河南理工大學 非常規(guī)天然氣研究院，河南 焦作 454003；2.中國地質大學(武漢) 資源學院，湖北 武漢 430074；3.中原經濟區(qū)煤層(頁巖)氣協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 焦作 454003；4.河南理工大學 資源環(huán)境學院，河南 焦作 454003；5.河南理工大學 能源科學與工程學院，河南 焦作 454003)

2020 年中國對世界做出了“2030 碳達峰、2060碳中和”的承諾。為實現(xiàn)“雙碳”目標，中國將逐步完成以煤炭為主的高碳能源供給體系向清潔、可再生能源為主的低碳能源供給體系的轉變[1]。煤炭燃燒供能的同時會排放較多CO2，造成溫室效應。至2020 年煤炭在我國能源消費結構中的占比仍高達57%[2]。相較于煤炭(高碳能源)，同屬化石能源的天然氣則是高效的中低碳能源，在產生相同熱值的情況下，其CO2排放量比煤低三分之二左右，表明天然氣是高碳能源向低碳潔凈能源轉化過程中重要的過渡能源，而煤層氣正是非常規(guī)天然氣的重要組成部分。

我國煤層低滲透率、低孔隙率和高地應力的特點[3]，致使煤層氣的商業(yè)化開發(fā)存在困難。A.R.Scott[4]、蘇現(xiàn)波[5]等在微生物增產煤層氣(Microbially Enhanced CBM,MECBM)概念的基礎上進行了升華和創(chuàng)新，提出了煤層氣生物工程(Coalbed Gas Bioengineering,CGB)的新技術理念。這一技術是將經過選育、馴化、改良的菌種注入地下煤層或采用地面發(fā)酵產氣的方式，通過厭氧發(fā)酵把煤的部分有機組分轉化為甲烷，實現(xiàn)煤層氣增產和碳減排的雙重目標。近年來，關于煤層氣生物工程的研究主要集中在煤厭氧發(fā)酵制取生物甲烷的生成途徑、強化生物甲烷產出和微生物對煤儲層的改性等方面。目前，普遍認為煤制生物甲烷需要經過水解、酸化、產氫產乙酸和產甲烷4 個階段，煤中復雜聚合物的分子量過大，不能被產甲烷菌直接利用，需要先被會水解發(fā)酵菌釋放的胞外酶分解成小分子聚合物，而后這些小分子聚合物被一些產酸菌利用，生成氨、氫氣和揮發(fā)性脂肪酸等，再次在產氫產乙酸菌的作用下?lián)]發(fā)性脂肪酸被進一步降解，形成了產甲烷菌可直接代謝底物：二氧化碳、氫氣和乙酸，最后產甲烷菌利用底物生成生物甲烷[6-7]。強化生物甲烷產出的方式主要有生物刺激、生物強化和提高煤的生物利用度等。實驗證明外加電場馴化能夠促進厭氧發(fā)酵系統(tǒng)中細菌與產甲烷古菌的協(xié)同合作，進而提高生物甲烷的產量[8-9]。美國Luca 公司在粉河盆地進行了先導性試驗，試驗井在添加培養(yǎng)基后，每口井的產氣量比預期增加了1 260 m3，恢復到歷史峰值產氣量的50%左右[10]。通過引進外源菌種來改善本源菌種的產甲烷能力可顯著提高生物甲烷的生成。有研究表明，產甲烷菌與牛瘤胃消化液中富集得到的厭氧真菌混合，能夠快速降解大麥秸稈同時產生甲烷[11]。使用物理、化學和生物的手段對煤樣預處理，同樣可以提高煤的生物利用度，進而強化生物甲烷的產出[12]。將煤進行研磨，可以增加微生物與煤的附著面積；利用高錳酸鉀、過氧化氫等強氧化劑溶解煤，可以實現(xiàn)煤的解聚；使用白腐菌、芽孢桿菌等強降解能力的菌對煤進行降解，可以破壞煤結構，提高甲烷的生成效率。另外，超臨界CO2萃取(Sc-CO2)-厭氧發(fā)酵聯(lián)作增產煤層氣逐漸被重視，在理想條件下，煤儲層埋藏深度超過800 m 時，煤儲層溫度和壓力容易使CO2達到超臨界狀態(tài)(溫度大于31.06℃，壓力大于7.39 MPa)[13]。Sc-CO2與煤有機基團作用可改變煤的理化性質。Sc-CO2的擴散系數為液態(tài)CO2的100 倍，具有良好的擴散性[14]。Sc-CO2能夠有效萃取復雜化合物中的有機物，煤中非共價鍵的破壞導致小分子有機物從煤的大分子結構中脫落[15]，易被微生物利用生成甲烷。有學者利用壓汞儀和孔滲儀對生物作用后的殘煤進行測試，發(fā)現(xiàn)生物轉化能夠增大煤表面的粗糙程度，增加煤的孔隙和滲透率，孔隙的連通性增強，有利于甲烷的解吸[16]。在常規(guī)厭氧發(fā)酵中CGB 的可行性與優(yōu)越性已得到了證實，而在煤儲層原位條件下，微生物厭氧降解煤制取生物甲烷的研究還存在空白。前期國內外開展的先導性試驗一般都是在煤層中添加營養(yǎng)液來刺激煤層中本源微生物生產甲烷[17-18]，而真正結合CGB 的核心理念，將經過馴化后的高效產甲烷菌群注入地下煤層的探索還未見報道。

筆者為了解CGB 在原位儲層條件下的產氣潛力，通過自主設計的原位厭氧發(fā)酵實驗裝置物理模擬煤儲層原位溫壓條件和氣體組分，將馴化后的本源菌群注入厭氧發(fā)酵罐，進行厭氧發(fā)酵制取生物甲烷，對比厭氧發(fā)酵前后氣、固、菌的差異性，證實儲層原位條件下生物甲烷生成的可行性，計算在Sc-CO2參與下生物氣組分的產量，并揭示不同發(fā)酵系統(tǒng)生物甲烷化過程中微生物的差異性。

1 實驗部分

1.1 實驗材料與設備

1.1.1 實驗材料

煤樣取自新疆地區(qū)某煤層氣區(qū)塊目標煤層的新鮮煤樣，編號為XJ，煤質分析見表1。煤樣真空干燥12 h后，研磨并篩分至80～100 目(180～150 μm)。實驗菌源從原位煤樣中富集得到。產甲烷菌的液體培養(yǎng)基(g/L)：NH4Cl 1.0，MgCl2·6H2O 0.1，K2HPO4·3H2O 0.4，KH2PO40.2，酵母膏 1.0，L-半胱氨酸鹽酸鹽 0.5，Na2S 0.2，NaHCO32.0，乙酸鈉 2.0，胰蛋白胨 0.1，微量元素液10.0 mL。微量元素液(g/L)：氨基三乙酸 1.5，MgSO4·7H2O 3.0，CoCl2·6H2O 0.1，MnSO4·2H2O 0.5，CaCl2·2H2O 0.1，ZnSO4·7H2O 0.1，NaCl 1.0，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.1，CuSO4·5H2O 0.01，KAl(SO4)20.01，H3BO30.01，Na2MoO40.01。

表1 煤樣的基本性質參數Table 1 Property parameters of coal samples

1.1.2 實驗設備

500 mL 厭氧發(fā)酵罐4 個、壓力表4 個、四通閥4 個、小型液壓式計量泵、氣體增壓泵、抽真空泵、恒溫培養(yǎng)箱、氣體流量計、液體流量計、干燥管(圖1)。

圖1 原位厭氧發(fā)酵裝置Fig.1 In-situ anaerobic fermentation device

1.2 實驗方法

1) 本研究選取新疆地區(qū)某煤層氣區(qū)塊目標煤儲層為研究對象，物理模擬目標煤儲層的原位儲層條件，儲層壓力(8.6 MPa)、溫度(35℃) 和原始氣體組分(CH475%，CO225%)。從煤層中提取本源菌群，經過實驗室長期馴化后，得到高效的產甲烷菌群。

2) 以4 個500 mL 的厭氧發(fā)酵罐為反應容器，分別編號1、2、3、4，每個罐加入50 g 煤樣(80～100 目)作為降解底物，其中1 號為常規(guī)厭氧發(fā)酵系統(tǒng)，2、3、4號為原位厭氧發(fā)酵系統(tǒng)。根據理想氣體狀態(tài)方程計算出每個發(fā)酵罐的自由體積后，將發(fā)酵罐抽至真空。通過氣體流量計向2、3、4 號發(fā)酵罐中注入CH4至發(fā)酵罐壓力達到4.0 MPa，然后再向2、3、4 號發(fā)酵罐內注入CO2至發(fā)酵罐壓力達到4.8 MPa。利用小型液壓式計量泵將生物發(fā)酵液泵入3、4 號發(fā)酵罐至發(fā)酵罐壓力達到煤層原位壓力(8.6 MPa)，將無菌水泵入到2 號樣品罐至相同儲層壓力，最后向1 號發(fā)酵罐加入同體積的生物發(fā)酵液。將4 個發(fā)酵罐同時放在35℃的恒溫培養(yǎng)箱中，等待罐內氣體吸附穩(wěn)定后，收集2、3、4 號厭氧發(fā)酵罐內的原始氣體組分10 mL，做初始階段的氣體組分測試。參照文獻[19]，常規(guī)厭氧發(fā)酵的發(fā)酵時間設置為30 d，當3 號發(fā)酵罐內氣體濃度不再變化時(60 d)，視為原位厭氧發(fā)酵結束，通過干燥管和氣體流量計緩慢解吸厭氧發(fā)酵罐中的氣體，記錄混合氣體的體積和氣體組分。

3) 本研究中1 號發(fā)酵罐為常規(guī)厭氧發(fā)酵罐，用來對比常規(guī)厭氧發(fā)酵系統(tǒng)與Sc-CO2參與下原位厭氧發(fā)酵系統(tǒng)中的氣相產物、固相產物和微生物群落結構的差異性。2 號發(fā)酵罐作為空白對照罐，通過參照空白對照罐注入前后氣體體積差來折算3 號發(fā)酵罐和4 號發(fā)酵罐內溶解、吸附的氣體體積，從而推算出儲層原位條件下的實際產氣量。3 號發(fā)酵罐為取氣測試罐，每隔5 天進行取氣檢測，用來記錄原位儲層條件下不同發(fā)酵階段氣體組分隨時間的變化規(guī)律。4 號發(fā)酵罐作為3 號發(fā)酵罐的平行樣，用來驗證原位產氣數據的可靠性。

1.3 分析測試方法

1.3.1 微生物多樣性分析

對原始菌液和厭氧發(fā)酵后的菌液平行取樣3 次，送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行DNA 的純度和濃度檢測，檢測合格后進行16SrRNA 測序。

1.3.2 氣相產物檢測

利用氣相色譜檢測儀(GC-4000A)對常規(guī)厭氧發(fā)酵系統(tǒng)和原位厭氧發(fā)酵系統(tǒng)的氣相產物進行組分測試分析，檢測器為熱導(TCD)，10 階程序升溫，升溫速率0.1～40℃/min，TDX-01 色譜柱，載氣為氦氣。

1.3.3 紅外光譜分析

采用紅外光譜儀(HYPERION2000)對發(fā)酵前后的煤樣進行測試，光譜范圍為4 000～400 cm-1，分辨率為4 cm-1。

1.3.4 相關計算

式中：c為二氧化碳的生物轉化率；vt為原位厭氧發(fā)酵結束后3 號厭氧發(fā)酵罐內二氧化碳由于溶解、吸附和微生物轉化而減少的量，mL；vd為不參與生物發(fā)酵的2 號空白對照罐內二氧化碳由于溶解和吸附而減少的量，mL；v為3 號厭氧發(fā)酵罐內二氧化碳的注入量，mL。

2 結果與討論

2.1 產氣分析

常規(guī)厭氧發(fā)酵系統(tǒng)與Sc-CO2參與的原位厭氧發(fā)酵系統(tǒng)中生物甲烷生成量分別為4.35 mL/g(圖2a)和32.9 mL/g(圖2d)，后者是前者的7.56 倍。常規(guī)厭氧發(fā)酵系統(tǒng)的產甲烷高峰期出現(xiàn)在第20 天，隨后甲烷產量開始大幅下降并逐漸停止，這與前人在實驗室研究的低變質煤厭氧發(fā)酵產氣結果基本相符[20]。原位厭氧發(fā)酵開始的第0～10 天 CO2濃度大幅降低，CH4濃度升高，有少量的N2和H2，說明該階段主要以CO2吸附和溶解為主，同時N2、H2的生成，說明CO2生物甲烷化開始。H2濃度在第5 天達到峰值，隨后開始降低，說明原位條件下的生物甲烷在第5 天開始生成，CH4濃度在第5～10 天的激增應是CO2溶解和生物甲烷化的疊加影響造成的。第10～60 天原位厭氧發(fā)酵罐內的CO2濃度停止大幅下降，說明厭氧發(fā)酵罐內CO2達到了溶解平衡，此時CO2濃度降低是由于微生物的利用，合成了生物甲烷。原位厭氧發(fā)酵系統(tǒng)經過60 d 后，對發(fā)酵罐內的氣體進行解吸和對比發(fā)現(xiàn)，CH4體積增加了7.65%，CO2體積減少了30.23%，而注入無菌水的厭氧發(fā)酵罐2，微生物不參與發(fā)酵，氣體只有溶解和吸附損失，CH4和CO2的體積分別減少了0.01%和13.50%。該Sc-CO2儲層原位條件下，厭氧發(fā)酵罐2 內CO2的減少量(829 mL)近似為厭氧發(fā)酵罐3 內CO2溶解和吸附的量vd，厭氧發(fā)酵罐3 內CO2的減少量(1 952 mL)為CO2溶解、吸附以及微生物轉化利用的總量vt，厭氧發(fā)酵罐3 內二氧化碳的注入量v由圖可知為6 458 mL，由1.3.4 的相關計算公式得出Sc-CO2儲層原位條件下，CO2的生物轉化率為17.4%(圖2b-圖2d)。

圖2 常規(guī)厭氧發(fā)酵與原位厭氧發(fā)酵的產氣數據Fig.2 Gas production data of conventional anaerobic fermentation and in-situ anaerobic fermentation

2.2 煤的官能團分析

2.2.1 測試結果

厭氧發(fā)酵前后煤中官能團的變化如圖3 所示，紅外光譜劃分為羥基吸收帶(波數3 600～3 100 cm-1)、脂肪結構吸收帶(波數3 000～2 800 cm-1)、含氧官能團吸收帶(波數1 800～1 000 cm-1)和芳香結構吸收帶(波數900～700 cm-1)4 個部分[21]，并在圖譜上標出13 個不同強度的吸收峰變化。

圖3 FTIR 吸光度圖譜Fig.3 FTIR absorbance spectrum

2.2.2 官能團定性分析

根據FTIR 對吸收峰歸屬的劃分[22]，1 號、2 號吸收峰位于羥基吸收帶，屬于煤中醇、酚羥基的伸縮振動，在原位條件下厭氧發(fā)酵罐內的Sc-CO2對煤樣進行萃取，煤樣中的羥基被萃取脫落，特征吸收峰消失[15]。3 號、4 號吸收峰位于脂肪結構吸收帶，屬于甲基和亞甲基的伸縮振動，煤樣經過微生物厭氧發(fā)酵后，甲基和亞甲基峰的吸收峰強度降低，說明微生物可能利用甲基和亞甲基合成了甲烷。5、6、7、8、9 號吸收峰位于含氧官能團吸收帶，該區(qū)域主要是羧基、羰基和醚氧的伸縮振動，同時還包含了芳環(huán)上碳碳雙鍵的振動、脂肪鏈上CH2和CH3的彎曲振動等。10、11、12、13 號吸收峰位于芳香結構吸收帶，是煤芳香結構CH面外變形振動的區(qū)域，F(xiàn)TIR 光譜表明，Sc-CO2萃取-微生物厭氧發(fā)酵聯(lián)作系統(tǒng)對苯酚、醇、醚、酯中含氧基團的降解能力要強于常規(guī)的厭氧發(fā)酵系統(tǒng)。

2.3 群落結構差異性分析

2.3.1 細菌群落變化

分析了同一時間點不同厭氧發(fā)酵系統(tǒng)內微生物群落的組成結構(圖4)?；?6S rRNA 測序結果，原始菌液中微生物群落優(yōu)勢細菌門類是厚壁菌門(Firmicutes)、互養(yǎng)菌門(Synergistota)、擬桿菌門(Bacteroidota)和變形菌門(Proteobacteria)，約占初始階段總相對豐度的97%。經過30 d 的常規(guī)厭氧發(fā)酵后，厚壁菌門和變形菌門分別從37.35%和25.54%下降到14.99%和3.77%，而互養(yǎng)菌門和脫硫菌門(Desulfobacterota)分別從13.29% 和0.25% 增加到33.69% 和12.52%。優(yōu)勢菌屬由Pseudomonas(25.49%降到1.47%)和Para-clostridium(10.47%降到0.17%)變成了Syner-01(3.25%增到15.21%)、Sphaerochaeta(1.16% 增到11.87%)和Syntrophobacter(0.21%增到10.82%)。Pseudomonas和Paraclostridium擁有極強的降解能力，能夠降解結構復雜的長鏈烷烴，同時也能參與碳水化合物的發(fā)酵[23-24]，在厭氧發(fā)酵后期底物的不足導致其生長繁殖受阻。Syner-01 是Synergistaceae家族的成員，該家族是合成型乙酰和氨基酸氧化細菌[25]，Syner-01 和Sphaerochaeta都能代謝氨基酸產生乙醇、乙酸、乳酸、H2和CO2，作用于厭氧發(fā)酵后期的產氫產乙酸階段，豐度較高。在經過60 d 的原位儲層條件的厭氧發(fā)酵后，森林土源芽孢桿菌Solibacillus(0.008%增到60.24%)成為了菌群中唯一的優(yōu)勢菌種，這種菌不利用葡萄糖及相關糖類作為碳源，卻對乙酸和丙酮酸有著顯著的利用，這表明Solibacillus silvestris產生能量的途徑不同于利用葡萄糖代謝途徑[26]。

2.3.2 古菌群落變化

不同于細菌群落，古菌群落的結構相對簡單，檢測出的古菌菌屬只有Methanosarcina、Methanoculleus、Methanobacterium、Methanosaeta(圖4b)。常規(guī)厭氧發(fā)酵系統(tǒng)以甲烷八疊球菌屬Methanosarcina(67.15%)和甲烷囊菌屬Methanoculleus(23.09%) 為主，Methanosarcina是已知的唯一能夠利用所有產甲烷途徑(乙酸營養(yǎng)途徑、氫營養(yǎng)途徑和甲基營養(yǎng)途徑)的產甲烷微生物菌屬，常被視為乙酸營養(yǎng)型的代表。而Methanoculleus只能利用H2將CO2還原成CH4，屬于氫營養(yǎng)途徑的產甲烷微生物菌屬，可見常規(guī)厭氧發(fā)酵系統(tǒng)是多種途徑同時進行合成甲烷。在原位厭氧發(fā)酵系統(tǒng)中，Methanoculleus以絕對的數量優(yōu)勢，成為環(huán)境中的優(yōu)勢菌屬。在常規(guī)厭氧發(fā)酵中占據優(yōu)勢地位的Methanosarcina，只占原位厭氧發(fā)酵系統(tǒng)古菌總相對豐度1.15%，氫營養(yǎng)途徑的產甲烷微生物菌屬Methanoculleus和Methanosaeta占到了原位厭氧發(fā)酵系統(tǒng)總相對豐度的96.44%，說明原位厭氧發(fā)酵系統(tǒng)是以氫營養(yǎng)為主要途徑來合成甲烷。Methanosaeta的豐度下降，可能是受到了Solibacillus silvestris的影響，Solibacillus silvestris在環(huán)境中有較強的競爭能力和適應能力，利用了環(huán)境中產生的乙酸，導致Methanosaeta缺乏代謝底物而豐度降低，乙酸裂解產生甲烷的途徑被抑制。

圖4 細菌群落和古菌群落的相對豐度Fig.4 Relative abundance of bacterial communities and archaeal communities

3 結 論

a.Sc-CO2參與下儲層原位厭氧發(fā)酵產生的生物甲烷是常規(guī)厭氧發(fā)酵的7.56 倍。在該儲層條件下，CO2的噸煤減少量為39.0 m3，其中16.6 m3的CO2被溶解，22.4 m3的CO2被微生物轉化，說明煤層氣生物工程能夠為煤層氣增產和“雙碳”目標的實現(xiàn)提供有效途徑。

b.常規(guī)厭氧發(fā)酵系統(tǒng)和原位厭氧發(fā)酵系統(tǒng)對煤進行生物發(fā)酵產氣后，煤中的甲基、亞甲基均脫落，苯酚、醇、醚、酯中含氧基團被不同程度地降解。儲層原位條件下微生物對煤的降解更為徹底。

c.Sc-CO2參與的儲層原位條件下，產甲烷菌群由原始群落中參與多種產甲烷代謝途徑的產甲烷菌逐漸向單一的氫營養(yǎng)型產甲烷菌演化。森林土源芽孢桿菌Solibacillus silvestris成為細菌菌群中的優(yōu)勢菌屬，目前正在針對該菌屬的代謝特征和耐壓機制開展深入研究。