干擾素-γ消除腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞介導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞輻射抵抗的實驗研究

韓若臻 項林敏 邱恩毅 董事 翁欣然 胡呈呈 陳恩樂

肺癌位居惡性腫瘤相關(guān)死亡率第一位，其中非小細(xì)胞肺癌占肺癌總數(shù)約80%[1-2]。放療已成為治療肺癌的重要手段之一，但部分患者對放療抵抗，甚至出現(xiàn)放療后腫瘤進(jìn)展[3]。腫瘤基質(zhì)對腫瘤細(xì)胞發(fā)生、發(fā)展和治療抵抗起到支持作用，而腫瘤基質(zhì)中腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（cancer-associated fibroblasts,CAFs）為腫瘤組織中主要成分之一 ，后者對腫瘤細(xì)胞起到保護(hù)作用，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生對治療抵抗，同時促進(jìn)腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移[4-5]。此外，電離輻射可誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞浸潤于腫瘤組織中，而腫瘤微環(huán)境中CD8+T細(xì)胞豐度與腫瘤患者預(yù)后呈正相關(guān)[6]。CD8+T細(xì)胞能在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時釋放干擾素-γ，干擾素-γ通過作用于CAFs來減少谷胱甘肽（glutathione,GSH）和半胱氨酸釋放，進(jìn)而消除其介導(dǎo)的化療耐藥作用[7]。但干擾素-γ能否通過這一途徑來消除CAFs對輻射后腫瘤細(xì)胞的保護(hù)作用，對此，本研究觀察了干擾素-γ消除CAFs介導(dǎo)的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞輻射抵抗的效果，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、人肺鱗癌細(xì)胞系H460購自中科院上海細(xì)胞庫。DMEM全培養(yǎng)基、10%FBS、青霉素、鏈霉素購自美國Thermo Fisher公司。細(xì)胞蛋白抽提試劑盒和聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）快速制備試劑盒、人FAP-PE流式抗體購自美國Bio-Rad公司。CCK-8試劑盒、半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)品、胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)品、GSH檢測試劑盒、GSH合成酶抑制劑（丁硫氨酸-亞砜亞胺，BSO）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。Transwell小室購自美國Corning公司。流式抗體 CD105-APC、CD44-APC、EPCAM-FITC、Annexin-V-FITC、PI、CD45-APC 購自美國 eBioscience公司。DNA損傷修復(fù)蛋白γH2AX、胱氨酸轉(zhuǎn)運蛋白xCT抗體、信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白1（STAT1）抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔二抗均購自英國Abcam公司。7-氟苯呋咱-4-硫酸銨鹽（SBD-F）購自美國Sigma公司；高效液相色譜檢測涉及的三氯乙酸、EDTA-2Na、磷酸鹽、醋酸鈉、冰醋酸、氯化鈉、氫氧化鈉和四硼酸鈉十水合物試劑均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。高效液相色譜儀（AA9800）購自美國蘭博公司。

1.2 方法

1.2.1 CAFs提取及鑒定 CAFs從2020年12月至2021年6月溫州市中心醫(yī)院胸外科行根治性切除的15例肺癌患者的組織標(biāo)本中提取，其中肺腺癌11例，肺鱗癌4例；患者術(shù)前均無放化療治療史。具體方法：術(shù)中冷凍切片證實為非小細(xì)胞肺癌后，切取1 cm×0.5 cm腫瘤組織置于DMEM全培養(yǎng)基中，1 h內(nèi)轉(zhuǎn)移至實驗室超凈臺，用PBS液沖洗標(biāo)本5遍，將標(biāo)本剪成約0.3 cm×0.3 cm大小的組織塊，置于T25培養(yǎng)瓶中，加入2 ml DMEM全培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中，6～12 h后再加入2 ml培養(yǎng)基。培養(yǎng)過程中，可見CAFs貼壁于標(biāo)本周圍，7～10 d內(nèi)長滿。將第3～6代CAFs用于后續(xù)實驗。取0.5×106個細(xì)胞接種于無菌載玻片中，細(xì)胞完全貼壁后去除培養(yǎng)基，PBS洗2次，加入4%多聚甲醛，24 h后提取載玻片進(jìn)行HE染色及免疫組化染色，平滑肌肌動蛋白（smooth muscle actin,SMA）為CAFs特異性蛋白之一，若細(xì)胞質(zhì)染色呈褐色表示陽性；將消化后的CAFs采用流式細(xì)胞術(shù)檢測，進(jìn)行流式抗體（CD105、CD44、FAP、CD45、EPCAM、CD24）染色及鑒定，以確定是否為CAFs細(xì)胞。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) A549、H460、CAFs細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM全培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基含10%FBS、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素。細(xì)胞在37℃ 、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，0.25%胰酶消化后按1∶3比例傳代，傳代間隔時間為2～3 d。

1.2.3 細(xì)胞輻射 分別將10×106個的A549和H460細(xì)胞置于含15 ml DMEM全培養(yǎng)基的15 ml離心管中。將離心管置于瓦里安（23EX）直線加速器中輻射，輻射劑量為10 Gy，共3 min。輻射結(jié)束后，離心管重新置于冰上并轉(zhuǎn)運回實驗室。

1.3 CAFs與輻射后腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)

1.3.1 Transwell法 在24孔Transwell體系中，輻射后的腫瘤細(xì)胞與 CAFs鋪板數(shù)目比例為1∶2，0.2×106個腫瘤細(xì)胞鋪板于下室（無CAFs組），0.4×106個CAFs細(xì)胞鋪板于上室（CAFs組），共培養(yǎng)36 h。

1.3.2 CAFs細(xì)胞上清培養(yǎng)法 3×106個CAFs鋪板于10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，48 h后收集上清液于15 ml離心管，2 500 r/min離心5 min，上清液經(jīng)0.22 μm過濾器過濾。取0.2×106個輻射后腫瘤細(xì)胞鋪板于24孔板，12 h后吸棄細(xì)胞培養(yǎng)基，加入CAFs細(xì)胞上清液500 μl，36 h消化細(xì)胞并通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡；CAFs完全貼壁后，在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入干擾素-γ（終濃度為5 ng/ml）或者BSO（終濃度為 0.1 mmol/L），作用8 h后，更換培養(yǎng)基并收集48 h后CAFs細(xì)胞上清液，用于后續(xù)共培養(yǎng)及上清液相關(guān)指標(biāo)檢測實驗。

1.4 腫瘤細(xì)胞凋亡檢測 分別收集Transwell體系中各輻射后A549和H460細(xì)胞于1.5 ml EP管中，離心后吸除上清液，250 μl Annexin-V buffer重懸腫瘤細(xì)胞。往細(xì)胞懸液中加入Annexin-V流式抗體和碘化丙啶（PI）各 0.25 μl，室溫避光孵育 15 min；孵育結(jié)束后，2 500 r/min 離心 5 min，150 μl Annexin-V buffer重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測Annexin-V和PI。Annexin-V陽性代表細(xì)胞早期凋亡，Annexin-V和PI雙陽代表細(xì)胞晚期凋亡，兩種比例之和表示細(xì)胞凋亡占比。

1.5 腫瘤細(xì)胞活性檢測 采用CCK-8法。0.2×106個輻射后腫瘤細(xì)胞鋪板于96孔板中，各實驗孔分別加入100 μl DMEM全培養(yǎng)基和CAFs細(xì)胞上清液培養(yǎng)基，36 h后吸除培養(yǎng)基，往各孔中加入100 μl CCK-8檢測液，1 h后酶標(biāo)儀測定450 nm處吸光度（A）值，以未輻射細(xì)胞作為對照組，檢測細(xì)胞活力，細(xì)胞活力（%）=[A（實驗）-A（空白）]/[A（對照）-A（空白）]×100，其中A（空白）為CCK-8溶液的吸光度，A（對照）為CCK-8溶液和無處理細(xì)胞的吸光度，A（實驗）為CCK-8溶液和CAFs細(xì)胞上清液培養(yǎng)基處理細(xì)胞的吸光度。

1.6 輻射后的腫瘤細(xì)胞γH2AX、xCT、STAT1蛋白表達(dá)情況檢測 采用Western blot法。獲得細(xì)胞沉淀后，加入細(xì)胞裂解液，4℃、12 000 r/min，離心 5 min，收集蛋白。采用BCA蛋白定量法檢測蛋白濃度并調(diào)節(jié)蛋白濃度為 1 μg/μl。取 20 μl蛋白液進(jìn)行凝膠電泳（SDSPAGE）和轉(zhuǎn)膜。將分離的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，使用5%脫脂牛奶封閉，加入鼠抗人一抗，4℃過夜。加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗，室溫孵育2 h后。以GAPDH作為內(nèi)參照，采用化學(xué)發(fā)光法將蛋白條帶曝光到膠片上，測定 γH2AX、xCT、STAT1 蛋白表達(dá)情況。

1.7 CAFs細(xì)胞上清液中GSH、半胱氨酸、胱氨酸水平檢測 采用高效液相色譜法將標(biāo)準(zhǔn)品溶液及CAFs細(xì)胞上清液經(jīng)PBS稀釋后，用三（2-羧乙基）膦鹽酸鹽還原，用三氯乙酸溶液進(jìn)行蛋白沉淀，再用7-氟苯呋咱-4-硫酸銨鹽進(jìn)行衍生化反應(yīng)。實驗中色譜條件：柱溫29℃，流動相為甲醇，流速為0.8 ml/min，激發(fā)波長385 nm，發(fā)射波長515 nm。以標(biāo)準(zhǔn)品的位置及面積作為參照，計算GSH、半胱氨酸、胱氨酸水平。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 采用GraphPad Prism 6.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CAFs的鑒定 流式細(xì)胞術(shù)檢測可見，CAFs為一群呈現(xiàn) CD24、CD45、EPCAM陰性表達(dá)的細(xì)胞，而CD105、CD44、FAP 陽性表達(dá)，見圖1a、b（插頁）。HE染色可見，CAFs呈紡錘形或星形的扁平細(xì)胞（圖1c，插頁）。免疫組化可見CAFs中SMA呈陽性表達(dá)（圖1d，插頁）。

圖1 CAFs細(xì)胞的鑒定（a：流式細(xì)胞術(shù)檢測CAFs中CD24、CD45和EPCAM表達(dá)陰性；b：流式細(xì)胞術(shù)檢測CAFs中CD105、CD44和FAP表達(dá)陽性；c：觀察CAFs細(xì)胞形態(tài)，HE染色，×100；d：CAFs細(xì)胞SMA呈陽性表達(dá)，免疫組化染色，×100）

2.2 CAFs細(xì)胞上清液對輻射后肺癌細(xì)胞凋亡及細(xì)胞活性的影響 流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，A549細(xì)胞在CAFs組的細(xì)胞凋亡占比為（59.7±3.3）%，無 CAFs組為（38.3±3.6）%；H460細(xì)胞在 CAFs組的細(xì)胞凋亡占比為（58.2±5.5）%，無 CAFs組為（29.8±3.9）%。CCK-8檢測發(fā)現(xiàn)，A549細(xì)胞活性CAFs細(xì)胞上清液培養(yǎng)基為（38.1±2.1）%，DMEM 全培養(yǎng)基為（59.1±2.4）%；H460細(xì)胞活性CAFs細(xì)胞上清液培養(yǎng)基為（37.8±2.3）%，DMEM全培養(yǎng)基為（58.6±4.6）%。見圖2。

圖2 CAFs細(xì)胞上清液對輻射后肺癌細(xì)胞凋亡及細(xì)胞活性的影響（a：流式細(xì)胞術(shù)檢測Transwell體系中輻射后的A549細(xì)胞凋亡占比；b：CCK-8檢測CAFs細(xì)胞上清液培養(yǎng)基和DMEM全培養(yǎng)基中輻射后的A549細(xì)胞活性，**P＜0.01；c：流式細(xì)胞術(shù)檢測Transwell體系中輻射后的H460細(xì)胞凋亡占比；d：CCK-8檢測CAFs細(xì)胞上清液培養(yǎng)基和DMEM全培養(yǎng)基中輻射后的H460 細(xì)胞活性，**P＜0.01）

2.3 干擾素-γ對CAFs細(xì)胞上清液GSH、半胱氨酸、胱氨酸水平及非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞活性的影響 高效液相色譜檢測發(fā)現(xiàn)，加入干擾素-γ的CAFs細(xì)胞上清液中 GSH水平為（41.3±10.2）μmol/L，加入BSO為（39.1±9.6）μmol/L，加入 DMEM 全培養(yǎng)基（對照組）為（78.2±10.6）μmol/L，干擾素-γ和 BSO均明顯降低CAFs細(xì)胞上清液中的GSH水平（均P＜0.05）。在干擾素-γ作用后，CAFs細(xì)胞上清液中半胱氨酸水平為（47.8±4.8）μmol/L，明顯低于對照組的（86.9±8.7）μmol/L（P＜0.01），而胱氨酸水平為（133.0±10.8）μmol/L，明顯高于對照組的（73.7±5.2）μmol/L（P＜0.01）。CCK-8檢測表明，干擾素-γ和BSO兩者均降低了輻射后腫瘤細(xì)胞活性，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見圖3。

圖3 干擾素-γ對CAFs細(xì)胞上清液GSH水平及非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞活性影響（a：干擾素-γ和BSO對CAFs上清液GSH水平的影響；b：BSO對輻射后A549和H460細(xì)胞活性的影響；c：干擾素-γ對輻射后A549和H460細(xì)胞活性的影響；d：干擾素-γ對CAFs細(xì)胞上清液中半胱氨酸水平的影響；e：干擾素-γ對CAFs細(xì)胞上清液中胱氨酸水平的影響）

2.4 干擾素-γ對 CAFs細(xì)胞內(nèi) γH2AX、xCT、STAT1蛋白表達(dá)的影響 Western blot檢測結(jié)果表明，CAFs細(xì)胞上清液培養(yǎng)后使輻射后的A549細(xì)胞和H460細(xì)胞的γH2AX表達(dá)減少，而干擾素-γ作用后γH2AX表達(dá)增加。CAFs細(xì)胞內(nèi)STAT1獲得激活并使其成為p-STAT1，后者可進(jìn)入細(xì)胞核來實現(xiàn)其生物學(xué)功能。干擾素-γ作用CAFs后，細(xì)胞內(nèi)胱氨酸轉(zhuǎn)運蛋白xCT表達(dá)減少，后者位于細(xì)胞膜上并發(fā)揮將細(xì)胞外胱氨酸轉(zhuǎn)運入細(xì)胞內(nèi)的作用。見圖4。

圖4 干擾素-γ對CAFs細(xì)胞內(nèi)γH2AX、xCT、STAT1蛋白表達(dá)影響的電泳圖（a：干擾素-γ處理后CAFs細(xì)胞內(nèi)xCT、STAT1、p-STAT1蛋白相對表達(dá)；b：干擾素-γ處理的CAFs細(xì)胞上清液對輻射后A549細(xì)胞內(nèi)γH2AX蛋白表達(dá)影響；c：干擾素-γ處理的CAFs細(xì)胞上清液對輻射后H460細(xì)胞內(nèi)γH2AX蛋白表達(dá)影響）

3 討論

肺癌位居腫瘤相關(guān)死亡率第一位，5年生存率僅為15%[1-2]。非小細(xì)胞肺癌在肺癌中占比為85%，放療已成為非小細(xì)胞肺癌治療的重要手段之一，但是部分患者呈現(xiàn)對放療的抵抗及放療后腫瘤進(jìn)展，導(dǎo)致患者預(yù)后不佳[3]。研究表明，作為腫瘤基質(zhì)主要細(xì)胞CAFs對腫瘤發(fā)生、發(fā)展起到支持作用，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞對放療發(fā)生抵抗[5]。因此，本研究先成功分離和鑒定非小細(xì)胞肺癌組織中CAFs，再通過Transwell和CAFs細(xì)胞上清液培養(yǎng)兩種方法實現(xiàn)CAFs與輻射后的肺腺癌細(xì)胞A549和肺鱗癌細(xì)胞H460共培養(yǎng)，繼而確認(rèn)CAFs誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌對輻射抵抗。該兩種非直接接觸共培養(yǎng)方式的結(jié)果說明，CAFs通過釋放某種物質(zhì)來介導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞對輻射的抵抗，進(jìn)而提高腫瘤細(xì)胞活性及減少細(xì)胞凋亡。

放療通過射線作用在腫瘤組織中形成羥自由基和超氧陰離子等活性氧（reactive oxygen species,ROS），后者通過氧化蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA進(jìn)而損傷細(xì)胞以達(dá)到治療目的[8]。GSH是一種由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸組成的γ-酰胺鍵和巰基的三肽，是抗氧化應(yīng)激的主要還原劑[9]。研究表明，腫瘤細(xì)胞內(nèi)GSH能抵消ROS的作用，從而維持腫瘤細(xì)胞的生存，增加對細(xì)胞損傷的耐受，繼而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移[10]?；诖?，筆者通過高效液相色譜檢測CAFs細(xì)胞上清液GSH水平，結(jié)果表明CAFs細(xì)胞上清液的GSH水平顯著性高于腫瘤細(xì)胞上清液，筆者推測CAFs通過釋放GSH來實現(xiàn)對輻射后肺癌細(xì)胞的保護(hù)。為了進(jìn)一步說明來自于CAFs的GSH實現(xiàn)該效應(yīng)，筆者在CAFs的細(xì)胞體系中加入BSO，結(jié)果表明，BSO降低CAFs細(xì)胞上清液中GSH水平并使輻射后的腫瘤細(xì)胞活性低于對照組。同樣，梁延杰等[11]利用肺癌小鼠模型開展相關(guān)研究，其通過降低肺癌細(xì)胞中的GSH水平來增加腫瘤細(xì)胞對輻射的敏感性，進(jìn)而抑制腫瘤組織生長。

化療、放療和腫瘤靶向治療的療效與腫瘤微環(huán)境干擾素水平及CD8+T細(xì)胞數(shù)量呈正相關(guān)，后者殺傷腫瘤細(xì)胞時會釋放干擾素-γ[12-13]。Wang等[7]研究表明，干擾素-γ通過作用于CAFs以減少其GSH的釋放，進(jìn)而提高卵巢癌細(xì)胞對順鉑的敏感性。順鉑通過損傷腫瘤細(xì)胞DNA來實現(xiàn)治療，而射線輻射同樣具有破壞腫瘤細(xì)胞DNA的作用?；诖耍P者推測干擾素-γ具有與放療協(xié)同作用來控制腫瘤的生長。在用干擾素-γ對CAFs處理后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)干擾素-γ同樣能減少CAFs細(xì)胞上清液GSH水平，同時發(fā)現(xiàn)輻射后肺癌細(xì)胞活性低于干擾素-γ對照組。干擾素-γ屬于Ⅱ類細(xì)胞因子受體家族的成員，其細(xì)胞膜受體為IFNGR，幾乎在所有細(xì)胞類型中均以中等水平表達(dá)（成熟紅細(xì)胞除外），與受體結(jié)合后通過JAK/STAT信號途徑發(fā)揮生物學(xué)功能，在JAK的催化下，STAT發(fā)生磷酸化形成p-STAT，繼而形成p-STAT二聚體，并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮生物學(xué)功能[14]，后者與xCT的特定啟動子區(qū)域結(jié)合后，快速抑制成纖維細(xì)胞xCT基因轉(zhuǎn)錄[7]。本研究中Western blot檢測同樣證明，經(jīng)干擾素-γ處理后的CAFs呈現(xiàn)xCT蛋白表達(dá)下降，后者是糖蛋白相關(guān)氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白家族的成員，表達(dá)于細(xì)胞膜上，為胱氨酸轉(zhuǎn)運蛋白[15]，xCT蛋白表達(dá)下降減少了胱氨酸用于合成半胱氨酸及GSH，進(jìn)而消除了CAFs介導(dǎo)的肺癌細(xì)胞對輻射抵抗。在干擾素-γ處理組中輻射后腫瘤細(xì)胞內(nèi)的γH2AX蛋白表達(dá)下調(diào)，該蛋白表達(dá)水平反映DNA損傷程度[16]，進(jìn)一步驗證了干擾素-γ消除CAFs介導(dǎo)的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞對輻射抵抗。

綜上所述，研究者用源于非小細(xì)胞肺癌臨床標(biāo)本的CAFs來開展研究，證明了該細(xì)胞通過釋放GSH來誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌對輻射的抵抗。同時，干擾素-γ下調(diào)CAFs的胱氨酸轉(zhuǎn)運蛋白xCT表達(dá)并使GSH釋放減少，進(jìn)而逆轉(zhuǎn)非小細(xì)胞肺癌對輻射的抵抗。電離輻射誘導(dǎo)CD8+T免疫細(xì)胞在腫瘤組織中豐度[6]，干擾素-γ可來自于該細(xì)胞，研究能夠為放療結(jié)合免疫治療用于非小細(xì)胞肺癌治療提供依據(jù)。